Introduction
전염성 해면상 뇌증 (TSEs, 프리온 질환) 동물과 인간의 다양한 영향을 확장 배양 기간이 치명적인 신경 퇴행성 질환의 그룹입니다. TSEs의 추정 병인 제는 감염, 질병 - 관련에 PRP PRP (C)의 정상 세포 형태의 템플릿 기반의 변환에 의해 자기 전파 할 수있는 호스트 프리온 단백질 (PRP)의 미스 폴딩 이성체로 구성되는 감염된 호스트 1의 중추 신경계 조직에 축적 형태 PRP (TSE). 전염성 프리온은 일반적으로 포유 동물 종간 송신이 제한 이벤트 「TSE 종 장벽 "이라는 개념이 탄생했다 종 특이 방식으로, 호스트 간에서 송신한다. 프리온 종 장벽의 생물학적 결정은 잘 이해되지 않습니다. 감염성 PRP TSE 호스트 PRP C C 사이의 아미노산 서열 유사성강력 변환 3-5 일어난다하지만, 생체 내 6,7에서 관찰 된 모든 프리온 전송 이벤트를 설명하기에 불충분 남아 있는지에 영향을 미친다.
따라서, TSE 종 장벽 특성은 주로 동물 도전 연구에 의존했다 : 서로 프리온에 주어진 종으로부터 나이브 동물을 노출시키고 질병 발병과 전송 효율의 지표로서 공격 속도로 얻어진 배양 시간을 측정. 이종 종에서 PRP C를 발현하는 마우스는 연구 8 이런 종류의에 사용됩니다. 트랜스 제닉 마우스의 제작 및 프리온 장기화 생물 검정뿐만 아니라 동물의 윤리적 사용과 관련된 비용은 TSE 종 장벽 실험 조사 장애물이다. TSEs에 대한 인간 종 장벽의 평가는 인간의 PRP C를 발현하도록 유전자 조작 된 생쥐에 의존한다. 이 마우스는 인간의 TSEs 또는이 t 수정에 굴복 긴 배양 기간을 필요로빠른 질병 발병 9 그가 인간의 PRP C 분자. 이 마우스에서 인간이 아닌 TSEs에 대한 배양 기간은 도전 부정적인 결과의 해석을 정상 마우스의 수명을 넘어 연장 할 수있다. 비 - 인간 영장류는 인간 종 장벽을 연구하기위한 프록시로서 사용되었지만, 그것은 인간 숙주에 진행됨에 따라 이러한 연구 정확하게 질병 요점을 되풀이되지 않을 동물 실험과 인간이 아닌 영장류의 다른 유형과 같은 문제점을 내포한다.
동물 생물 검정은 TSE에 종의 감수성을 측정하기위한 "금 표준"방법 남아 있지만, 장애물, 비용이 살아있는 동물 실험의 윤리 대안의 조사를 강요했다. PRP TSE에 의해 시드 단백질 분해 효소 K (PK)에 내성 상태 PRP (입술)에 호스트 PRP C의 변환을 평가에 따라 체외 분석,의 숫자는 개발 TSE 특검팀을 조사하기 위해 사용되어왔다ecies 장벽 10-12. 시험 관내 분석법의 예로는 무 세포 분석법 변환, 증폭 단백질 환상 (PMCA)를 미스 폴딩 및 변환 효율을 율 (CER) 10-14 분석을 포함한다. 이러한 분석 중 어느 것도 자연 감염 후 종 장벽에 관련된 계정 주변 요인을 고려하지 않지만, 모든 TSEs 잠재적으로 취약 호스트를 식별하는 데 유용 할 수 있습니다.
여기에서는 정상 뇌 균질 액으로부터 유도 두 변성 PRP C 기판이 벤치 탑 프리온 전환 반응에 사용되는 CER 분석 용 프로토콜, (도 1) (13)을 제시한다. pH를 7.4로 변성 기판 PRP C 만 종 장벽 (14)의 부재 하에서, 반응에 의해 시드 PRP TSE PRP 해상도로 전환시킬 수있다. 대조적으로, pH가 3.5에서 다른 기판에 PRP C 변성은 PRP 입술 다음 배양으로 변환 될 수 있도록어떤 종에서 PRP TSE로 변환을위한 제어 역할을합니다. pH가 3.5 기판의 pH가 7.4에 대해 기판의 PRP 입술에 PRP C의 변환의 비율은 종 장벽의 측정치를 제공한다. 우리는 CER 분석 다양한 TSEs에 실험실 쥐의 종 장벽 알려져을 예측 및 만성 소모성 질환 (CWD) 및 기타 TSEs 14 뿔양 등 다양한 포유 동물 종의 종 장벽을 예측하기위한 노력의 분석을 사용한 것을 발견했다 15. 유용이 방법을 찾을 수 TSE 종 장벽 또는 PRP C -to-PRP 해상도 변환의 평가를 신속하게 검사를 허용하는 도구에 관심 수사관.
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Protocol
USGS 국립 야생 동물 보건 센터에서 실시 동물 연구는 실험 동물 복지 가이드 라인의 NIH 사무실에 따른 제도적 동물 관리 및 사용위원회 프로토콜 # 1 EP080716에서 수행되었다. 수렵 채취 동물의 조직은 위스콘신 또는 천연 자원의 미시간 부서에서 선물했다.
1. 솔루션 준비
참고 : 아래에 나열된 솔루션은 아래 제 2의 CER 분석 기판의 준비가 필요합니다. 높은 농도의 원액에서 각 솔루션을 준비; 원액에 대한 권장 농도는 나열된 각각의 화학 물질 이름 뒤에 괄호 안에 표시됩니다. 사용까지 4 ° C에서 기판 준비 및 저장시 신선한 모든 솔루션을 준비합니다.
- 100 mM의 S : 용해 버퍼를 들어, 10 mM의 트리스, pH가 7.5 (1 M 트리스이, pH가 7.5 원액 권장) 다음의 용액을 조제비난의 클로라이드 (염화나트륨, 1 M 스톡 용액), 10 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, 500 mM의 EDTA, pH가 8.0 스톡 용액), 0.5 % NP-40 (10 % 스톡 용액), 0.5 % 데 옥시 콜레이트 (DOC, 10 % 원액 ).
- 변환 버퍼, 0.05 % 도데 실 황산나트륨 (SDS, 10 % 원액) 0.5 % 트리톤 X-100 1 인산염 완충 식염수 (10 % 스톡 용액) (PBS, 10, pH가 7.4 스톡 용액)의 용액을 제조 하였다.
- 카오 솔루션의 경우, 염산 구아니딘 1X PBS에서 (GdnHCl, 8 M 주식) (10 배 원액)의 두 개의 3 M 솔루션을 준비합니다. 진한 염산 (HCL)을 사용하여 3.5 ± 0.05 솔루션 중 하나의 pH를 조정한다. 제 2 용액의 pH가 7.4 ± 0.05에 남아 있는지 확인하고 진한 염산이나 수산화 나트륨 (NaOH를) 필요로 조정합니다.
2. CER 분석 기판 쌍을 준비
- 관심의 종에서 건강하고, 비 TSE에 감염된 뇌 조직을 얻고 10 %의 중량 당 볼륨을 준비다음 방법 중 하나를 사용하여 용해 버퍼에 균질 (/ V w) : 다운스, 비드 밀, 또는 박격포와 유 봉 균질화. 또한, 주사기 및 바늘로 균질화를 실시하고, 기판은 흡인 27 G 바늘 주사기를 통해 용이하게 배출 될 수있을 때까지 증가 게이지의 바늘을 사용하여 생성 된 균질 물을 구체화.
- 설치류 및 다른 작은 포유 동물로부터 제조 된 기판의 경우, 전체 뇌 (들)을 균질화; 큰 포유 동물로부터 제조 된 기판에 대해, 균질을 준비하는 OBEX (뇌간) 조직을 사용합니다. 뇌 파쇄 액의 양을 선택할 때, 단계 2.6에서 단백질을 침전 원심 분리기의 용량의 50 % 이하를 준비하지 않는다.
- 취득 된 뇌 조직의 품질이 의심스러운 경우, SDS-PAGE 및 면역 블롯 (16)는 기판 (17)에 의해 제조하기 전에 PRP C 수준을 평가.
- 별도의 표시 플라스틱 원뿔 튜브에 두 개의 동일한 볼륨으로 뇌 균질 나눈다. (GdnHCl 추가뇌 균질 1 부피비로 pH를 3.5 또는 1 각 튜브에 7.4 중 하나에서 1 PBS에 3 M 솔루션).
- 두 용액의 pH 값을 확인합니다. 진한 HCl을 사용하여 pH 0.05 ± 3.5로 pH를 기판의 pH를 조정한다. 다른 기판의 pH가 7.4 ± 0.05에 남아 있는지 확인하고 염산 또는 필요에 따라 NaOH로 필요에 따라 산도를 조정합니다. 산 또는 염기의 현명한 첨가하여 pH 값을 오버 슈트하지 마십시오.
- 5 시간 동안 실온 (RT)에서 끝을 통해 엔드 믹서에 솔루션을 돌립니다.
- 각 원추형 튜브 내의 기판 용액에 메탄올 4 권을 첨가하여 단백질을 침전, 와류 잘 혼합하고, 16 ~ 18 시간 동안 -20 ° C에서 배양.
- 4 ℃에서 30 분 동안 13,000 × g에서 원심 분리하여 침전물 샘플. 조심스럽게 가만히 따르다하고 상층 액을 버리고 메탄올 펠릿에서 증발 할 수 있습니다. 튜브의 내부에 달라 붙었다 메탄올을 흡수을 지원하기 위해 면봉을 사용합니다. 펠렛을 통해-DR을 허용하지 마십시오Y와 메탄올이 더 이상 표시되면, 다음 단계로 진행합니다.
- 변환 버퍼에 재현 탁 단백질 펠렛. 단계 2.2에서 분배 된 각각의 튜브 내로 뇌 균질 출발 물질의 양과 동일한 변환 버퍼의 양을 사용한다.
참고 : 변환 버퍼가 모두 pH를 3.5 및 7.4 처리 기판 준비에서 단백질 펠렛을 재현 탁하기 (세제의 낮은 수준과 생리적 산도를 포함) 위의 단계 1.2에 정의 된 솔루션이다 사용하는 것이 중요합니다. - cuphorn 초음파 처리기에서 간단히 초음파 처리 기판 솔루션 (30 % 최대 전력 ~ 10 초), 0.5로 나누어지는 - 표시 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 1.0 ml의 볼륨. 각각의 기판의 분취 액에 품질 관리 면역 블롯 (단계 290)를 수행한다. CER 분석 (4 절)을 수행 할 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 다른 분량을 저장합니다.
- 사용 전에 CER 기판 쌍 (도 2)의 품질 관리를 수행한다. 이 단계는 CER 기판이 제공하기 것을 보장변환 연구에서 전자 최적의 결과.
- 두 개의 기판에 PRP C의 비교 금액을 확인합니다. 10 ~ 25 SDS-PAGE (16)에 의해 각각의 기판 ㎕의 17을 발현 수준에 PRP 수준을 비교. 7.4 및 3.5의 기판이 서로의 ~ 10 % 이내의 pH 단백질 수준은, 기판 쌍 CER 연구에 사용하기 적합한 지.
참고 : PRP 면역 블롯 광범위한 PRP C 저하의 증거를 보여주지해야한다. PRP 면역은 주로> 20 kDa의해야합니다. 이 분자량보다 작은 밴드 분해 산물이 될 수 있습니다. 줄무늬 패턴은 기판 쌍 사이 거의 동일해야합니다. - 양 기판의 PRP C 민감한 PK되어야 같이, 100 ㎍ / ml의 최종 농도 PK 각 기판의 10-25 μl를 치료하고 열 셰이커로 1 시간 동안 37 ℃에서 1,000 rpm으로 샘플을 소화. SDS-PAGE (16, 17)을 발현 수준으로 남아있는 PRP 신호를 평가합니다.PRP 해상도와 기판은 CER 연구에서 사용하기에 적합하지 않다.
- 두 개의 기판에 PRP C의 비교 금액을 확인합니다. 10 ~ 25 SDS-PAGE (16)에 의해 각각의 기판 ㎕의 17을 발현 수준에 PRP 수준을 비교. 7.4 및 3.5의 기판이 서로의 ~ 10 % 이내의 pH 단백질 수준은, 기판 쌍 CER 연구에 사용하기 적합한 지.
3. TSE 에이전트 씨앗을 준비
- 관심의 종 TSE에 감염된 뇌 조직을 확보하고 1X PBS pH를 7.4 균질 위의 단계 2.1에 나와있는 방법을 사용하여 (/ V는 w) 10 %를 준비합니다.
참고 : 씨앗은 또한 중추 신경계 외부의 다른 TSE에 감염된 조직에서 생산 될 수있다, 그러나, TSE에 감염된 말초 조직에서 파생 된 종자에 의한 뇌 유래 된 기판의 변환 효율은 아직 실험적으로 출간 된 문헌에서 평가되지 않았습니다. - (100)에 균질 (들) 결과로 나누어지는 - 전까지 -80 ° C에서 0.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 300 μL 용량의 저장은 CER 분석을 수행 할 수 있습니다.
4. CER의 분석
주 : CER 분석은 하나의 종 ( "시드"에서 제공) PRP TSE 비교적 소량의 첨가를 포함부분적으로 pH를 3.5 또는 7.4 중 하나에서 변성 된 다른 종 (감염되지 않은 뇌 "기판"에서 제공) PRP C의 상대 초과로. 확장 흔들어 배양 기간 후, 각 반응에 PRP TSE에 의한 PRP C의 템플릿 기반의 변환은 PRP 입술 나머지 PK의 소화와 면역 검출 이후의 농도계 신호에 의해 평가된다. 이전에 pH를 3.5 대 7.4 변성 기판에 PRP 입술 레벨을 비교하는 종 장벽의 측정치를 제공한다. 상기 분석 과정의 실험 개요도 1에 제공된다.
- 천천히 감염되지 않은 CER 기판 쌍을 해동 얼음 침대 (약 1 시간 해동 시간)의 상단에 배치하여 및 TSE에 감염된 종자 솔루션 (분석은 이전에 모두 pH가 3.5과 7.4에서 변성 기판 같은 부피 필요).
- 완전 해동 후에 대기음 후 통해 각 기질 용액을 추방27 G 주사기 바늘을 여러 번을 다시 균질화한다. 간단히 30 %, 최대한의 권력 ~ 10 초 동안 각 TSE에 감염된 종자 솔루션을 초음파 처리. 전환 반응을 준비하는 동안 얼음에 모든 솔루션을 보관하십시오.
- TSE 에이전트 당 라벨 5 개인 낮은 바인딩, 얇은 PCR 튜브 테스트되고.
- pH를 3.5로 제조하여 pH 7.4 및 (b) 기판에 CER 제조 (a) 기판의 CER 95 μL에 10 % TSE 감염된 시드 용액 5 μl를 첨가하여 이들 튜브 전환 반응을 준비한다.
- 각각의 실험 예를 들어, 이전에 모두 pH를 3.5 및 7.4에 변성 CER 기판 쌍의 평행 반응을 준비합니다.
- 경험적인 결정을 통해 감염되지 않은 뇌 기판에 TSE 에이전트 씨의 비율을 최적화합니다. 일반 씨앗 : 고용 기판 비율은 100 μL의 총 반응 볼륨을 유지하고 1:99 μL, 2:98 μL 및 5:95 μl를 포함한다. 대부분의 응용 프로그램, 5:95 μL 씨 : 기판의 부피 비율이 적절한 지와 일에 무엇을 제시한다프로토콜입니다.
- 다음 TSE 화제 당 세 개의 대조 시료 시험되는 준비 : (a) 입력 PRP 입술 용 컨트롤로 95 μL 변환 버퍼에 10 % TSE 감염된 시드 용액 5 μL를 추가; (b) pH가 3.5 이상, 불특정 템플릿 변환 컨트롤 등의 (c) pH를 7.4로 제조 95 μL 기판 5 μL 변환 버퍼를 추가한다.
- 간단히 잘 씨와 기판을 혼합 폐쇄 PCR 튜브에 각각의 샘플을 소용돌이. PCR 튜브의 뚜껑에 갇혀 반응 혼합물의 임의의 양을 제거하는 저속 벤치 톱 원심 분리기에서 미니 순간 펄스에 따라.
- PCR 튜브에 동의 장착 된 탁상용 열 흔드는 개별적으로 표지 된 PCR 튜브에로드 샘플. 24 시간 동안 37 ° C에서 1,000 rpm으로 샘플을 흔들어.
- 이하의 (w / v)이고, PK 100 ㎍ / ml의 최종 농도 2 %의 최종 농도 sarkosyl 추가 흔들. 다이제스트 샘플 열 셰이커 1 시간 동안 37 ° C에서 1,000 rpm으로.
NOTE : PRP C의 PK 소화의 샘플 변환 후 보조기구 sarkosyl의 추가. 시드 화 샘플 (4.5 단계)에서 거짓 긍정적 인 신호는 거의 sarkosyl의 첨가에 의해 제거된다. - 17 immunoblotting에 다음 SDS-PAGE (16)에 의해 각 샘플에 남아있는 PRP 입술을 5 분 동안 95 ° C로 SDS-PAGE 샘플 버퍼, 열 샘플을 추가하고 해결.
주 : 시료 완충액의 첨가 및 가열은 샘플 즉시 처리 될 수 있거나 샘플을 -20 ° C에서 저장 될 수있다 또는 -80 ° C에 선행 면역 후. 여기에 제시된 모든 데이터는 NOVEX 누 페이지 젤 및 전송 시스템을 사용하여 생성되었다. CER 분석에서 개별 샘플은 샘플 버퍼 및 제조자의 지시에 따라 환원제로 처리 하였다. 이어서 샘플을 5 분 동안 95 ° C로 가열하고, 각 시료의 30 μl의 12 % 비스 - 트리스 프리 캐스트 겔에 로딩 하였다. - 척도로서 변환 효율 비 (CER)을 계산종 장벽. 농도계 (17)에 의해 PRP 해상도의 측정 수준과는 pH가 3.5 샘플의에 의해 pH가 7.4 시료의 전체 밀도를 나눕니다. 백분율을 생성하기 (100)에 의해 곱.
- 주어진 TSE 에이전트 종의 평균 CER ± 표준 편차를 생성하기 위해 독립적 인 실험 반복 실험에서 데이터를 컴파일합니다.
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Representative Results
CER 분석의 성공적인 사용은 전환 반응에 사용 된 기판 쌍의 품질에 크게 의존한다. 이러한 이유로, CER 기판 쌍을 제조 절차에 따라, 품질 관리는 면역 블롯 (도 2)이 수행되어야한다. 양 기판의 경우, 분석 면역에 의해 10 ~ 25 μL. PRP C는 각각의 기판에 용이하게 검출 할 수 있어야하며 PRP C 수준은 둘 사이의 대략 같아야한다. 면역 반응성은 20 kDa의 위 주로 볼 수 있지만, 작은 밴드는 또한 명백하다. 우리의 경험에 의하면, 작은 밴드의 존재는 종 의존한다. 저 분자량 제품이 발견되면, 이들의 존재는 두 기판 쌍으로 확인되어야한다.
그것은 그 CER 기판이 PK로 기판을 처리하여 (그림 2) 내생 PRP 해상도가 없음을 확인하는 것이 중요합니다. PRP 입술이 존재하는 경우, 동물 SUBST 사용속도 준비 TSE 감염 또는 subclinically 감염되었을 수 있습니다. 또한, 기판의 PRP C는 변성 또는 침전 과정에서 PK에 강한 상태로 잘못 폴딩 수 있습니다. 이유와 무관 PRP 입술 함유 CER 기판 전환 분석에서의 용도에는 적합하지 않은.
실험용 생쥐 TSE 연구에서 가장 자주 사용되는 실험 동물 중 하나이고; 같은 대부분의 TSEs에 대한 감수성은 CER 분석의 충실도를 테스트합니다. 그림 3a는 (CD1 변형) PRP에 기판을 마우스에서 PRP C의 CER 분석 변환의 결과를 제공에 대한 생체 내 벤치 마크를 제공, 8 잘 특징이다 마우스 계대 스크래피의 RML 변형) (1)에 의한 입술, 에이전트는 마우스 호스트 (18), 2) 국내 양 고전 스크래피, 긴 잠복기 (18) 다음 마우스로 전송할 수 에이전트, 3) WHI에 적응테 꼬리 사슴 (Odocoileus virginianus) CWD와 햄스터 계대 스크래피의 263K 변형, 에이전트 최소한 여부 (19, 20) 감수성있는 마우스. 결과 PRP 입술 수준은 PRP 입술은 pH가 3.5에서 변성 및 TSE 에이전트와 시드 모든 기판에있는 동안 마우스 기판의 pH 7.4에서 변성 및 다양한 TSE 에이전트와 시드에서 변수했다. pH를 7.4 및 3.5에 기재 PRP 입술 레벨을 비교하여 전환율 독립적 적어도 세 번 계산되고도 3b에 도시되어 평균 ± SD 하였다. RML 반응에 의해 시드를 들어, pH가 7.4에서 3.5 사이의 기질 전환율은 약 100 %였다. 스크래피에 의해 접종을 위해, pH가 7.4 기판의 변환은 pH가 3.5 기판이 약 75 %였다. CWD 또는 pH를 7.4 기판의 263K에 의한 변환을 최소화했다. 분산의 단방향 분석 RML과 (S)의 변환 비율의 차이를 구별 할 수 있었다crapie 또는 CWD와 263K, RML과 스크래피의 그러나 변환 비율은 CWD와 263K와는 크게 달랐다.
CER 분석은 사람 조직 또는 생물 검정이 지나치게 어렵거나하지 윤리적, 트랜스 제닉 마우스 생산은 바람직하지 않다 아르 동물 종과 함께 사용하도록 구성 될 수있다. 우리는 CWD에 다양한 야생 동물 종의 감수성을 특징이 분석을 사용하고있다. 이 분석의 사용 예를 들어, 우리는 그림 4에서 일부 예비 결과를 제시한다. 사냥꾼 갇혀 살쾡이 (살쾡이 루퍼스)에서 두뇌하는 것은 발견은 여전히 PRP C와 PRP 분해 산물의 검출 수준을 포함하는 이들 제안, 광범위한 아니었다 조직 CER 기판 (그림 4A)에 대한 허용 원인이 될 수 있습니다. 밥 캣 뇌에서 생성 된 기판 쌍은 적절한 분자량의 PRP 면역 반응을 보여 내생 PRP 해상도를 포함하지 않았다 (그림 4B). 두 개의 분리 된 동물로부터 생성 밥캣 CER 기판 쌍이 CWD 에이전트는도 3에 기재된 마우스 CER 분석에서 사용한 것과 동일한 백색 꼬리 사슴 함께 배양 하였을 때, 우리는 PRP 입술의 농도가 pH에서 제조 된 기판과 비교 하였다하여 pH 7.4로 제조 기판을 발견 CWD로 변환 밥캣 PRP C의 최소 종의 장벽을 나타내는 3.5 (그림 4C). 같은 CWD에 의해 흰 꼬리 사슴 PRP C의 변환을위한 CER이 양성 대조군으로, 여기에 밥캣 PRP C로 변환하는 데 사용, 격리 이전 Morawski 등 95.2 ± 18.4 %로보고되었다. (2013) 15.
그림 1 :. CER 분석 실험 개요 두 가지 분석 기판은 부분적으로 뇌 조직 w 감염 비 프리온에 PRP C 변성에 의해 제조된다pH가 3.5 pH가 7.4 하나의 i 번째 카오 솔루션을 제공합니다. 기판은 관심의 프리온 에이전트로부터 PRP TSE 파종하고 실험 샘플은 모두 pH를 3.5 및 7.4 기판에 PRP TSE 변환에 PRP C를 할 수 있도록 진탕 24 시간 배양을 실시한다. 인큐베이션 후, 변환은 SDS-PAGE 및 면역 블 롯팅에 의해 평가된다. 신호 밀도는 농도계에 의해 읽기 및 CER은 각 실험 샘플의 pH가 3.5 신호 밀도에 산도 7.4의 비율로 계산된다.
그림 2 : CER 기판에 품질 관리. CER 분석에서 이들의 사용에 앞서, 마우스 기판 pH가 7.4 또는 3.5 어느 하나에서 제조 한 (A)는 각각의 쌍의 기판 PRP C 함량을 평가하기 PK 처리 1) 부재하에 면역 블롯에 의해 분석 하였다 (PRP C 수준 간의 동일해야 pH가 7.4과 3.5 substra TES CER 분석에서 사용)과 2) PK의 존재 (100 ㎍ / ㎖) 처리에 대해 테스트하는 기존의 기판 (기존 PRP 입술에 사용하기에 적합하지 않다 표시하는 임의의 기판을 제조하는데 사용되는 조직에서 PRP 입술을 CER 분석). (B) 전환 분석 동안 비 특정 PRP 입술 형성을 테스트하려면이, pH가 7.4 또는 3.5 중 하나에서 준비 마우스 PRP C 기판은 37 ° C, 1,000 rpm에서 24 시간 진탕 변환 버퍼 시딩 및 PK가 후속 처리 (100 ㎍ / ㎖) (오른쪽 두 차선)로 면역 블 PRP 입술에 대해 분석. 비 진탕 비 PK 처리 된 마우스 기판 분석 반응 (왼쪽 두 차선) 총 PRP C 함량을 나타낸다. (B)의 경우, 부적합 레인 명확 자른되었지만 면역 각 패널은 동일한 겔, 멤브레인과 노출로부터 도출한다. 모든 패널의 면역 블롯은 SAF (83) 단클론 항체를 사용 하였다.
그림 3 :. 실험실 마우스 기판 사용 CER 분석 (A) 마우스 CER 분석 기판은 pH가 7.4 또는 3.5 RML 마우스 적응 스크래피, 국내 양 고전 스크래피, 흰 꼬리 사슴 만성 소모성 질환 배양 하였다 (CWD) 또는 263K 중 하나에서 준비 CER 분석에서 햄스터 적응 스크래피의 변형. 대조 시료는 (표시된 "없음") 만 감염원 동량없이 마우스 기판을 함유 하였다. 샘플은 각 레인 아래에 표시되는 각각의 샘플에 대한 모노클로 날 항체 SAF 83 원시 농도계 값 면역 블롯에 의해 PK 내성 프리온 단백질 (PRP 해상도)의 존재에 대해 분석 하였다. (B) 막대 그래프는 평균 비를 나타내는 (± 표준 편차) pH가 7.4 각 감염원 3.5 마우스 기판 사이에 적어도 3 독립적 인 분석 실행을 기반으로. 소문자 통계를 참조하십시오동질적인 부분 집합 (Tukey의-Kramer의 최소 유의 차이 방법으로 분산 분석; P <0.05). 이 수치는 Morawski 등. 2013 15에서 수정되었습니다.
그림 4 : CER 분석의 샘플 사용은 CWD에 밥 캣 감수성을 조사하기 위해 밥캣 뇌 균질 (A) 및 PRP C를 기존의 평가 PK의 부재와 존재 (100 ㎍ / ㎖) immunoblotting에 의해 테스트 된 CER 분석 기판 (B)를. 레벨 및 기존 PRP 입술의 존재 각각. (C)가 기판 밥캣 변환 버퍼 시드 비특이적 PRP 입술 형성을 평가하기 CER 분석에서 분석 하였다는 (두 차선 좌측). 비 동요, 비 PK 처리 밥 캣 기판은 분석 반응 (오른쪽 두 차선) 총 PRP C 함량을 나타냅니다.하나의 pH 7.4 또는 3.5에서 준비 (D) 밥캣 기판 CER 분석을 사용하여 흰 꼬리 사슴의 CWD와 함께 배양 하였다. 대조 샘플은 (라벨 "없음") CWD 제의 등량 있지만 밥캣 기판을 함유 하였다. 각 샘플에 대한 원시 농도계 값은 각 레인 아래에 표시됩니다. 모든 패널 고양이 프리온 단백질 (21)과 반응하여 사용되는 단클론 항체 3F4에서 면역 블롯.
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Discussion
이 프로토콜의 성공적인 완료를 들어, 관심 기판 제조 (단계 2.1.2) 및 전환 반응 (단계 4.4.2)에 대한 비율을 기판에 시드에 사용되는 감염되지 않은 뇌 조직에서 PRP C 수준으로 지불해야합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 뇌는 한 PRP C는 면역 (그림 4)에 의해 존재로, 상당한 기간 부검 후 CER 기판으로 사용하기 위해 추출 할 수 있습니다. 실제로 일부는 자기 분해 CER 연구에 사용 샬럿의 뇌에서 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 이들의 뇌에서 파생 된 기판의 배양은 여전히 PRP 고해상도의 형성 결과. 우리는 부분적 CER 분석법 견고성 많은 프로테아제를 불 활성화한다 GdnHCl 1.5 M의 CER 기판 변성에서 유래한다는 추측.
비율 기판하는 종자는 면역에 의해 허용되는 PRP 고해상도 신호를 얻을 경험적으로 결정해야 할 수도 있습니다. 너무 많거나 너무 리터기판 비율 : ittle PRP 입술 기판과 일치하지 않는 변환 비율은 씨앗을 최적화 할 수있는 모든 이유가 부족 제어 샘플 농도계, 높은 배경 PRP 입술 수준을 수행 할 수 있습니다. 변화는 100 μL의 총 반응 볼륨을 유지하고 1:99 μL, 2:98 μL 및 5:95 μl를 포함한다. 기판 부피비 최적 : 거의 모든 경우에, 우리는 5:95 μL 씨는 것을 발견했다. 아무리 사용된다 어떤 비율, TSE 에이전트의 동일한 양이 사용되지 않고 분석은 내부적으로 일관성이있다. 그러나, 템플릿 반응에 사용되는 프리온 감염된 뇌 균질 시드 농도는 아마도 그 변화 시드 역가 또는 희석액에 CER 분석의 결과가 PRP C -to-PRP 입술 변환 다양한 수준에서 발생할 수에 영향을 미친다. 이러한 효과는 시험 관내 프리온 변환 세이 22 목록에서 입증되었고, 다른 프리온 균주의 비교를 복잡하게 할 수있다. CER 분석에서이 문제를 해결하기 위해, 씨앗 CPRP C 변환 템플릿의 희석 범위를 식별하여 pH 3.5 및 7.4에서 제조 한 각각의 PRP C 기판 내에 적정 울드. 이상적인 씨 희석 초과 종자 프리온과 솔루션을 포화 방지하고 아직 전환 반응의 민감도에 대한 통찰력을 제공합니다. 대안 적으로, CER 분석 반응에서 PRP C -to-PRP 입술 변환 분석의 기간에 걸쳐 여러 일정한 시점들에서 측정 및 실시간 중합 효소 연쇄 반응에 대한 판독 (유사한 레이트의 변환 곡선으로 나타내 어질 수도 qPCR에) 23 및 실시간 유도 변환 (RT-QuIC가) 24 분석을 떨고. 이러한 판독 종 장벽의보다 포괄적 인 해석을 허용하고이 방법의 미래 발전의 흥미로운 초점입니다 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜, 우리는 낮은 바인딩, 얇은 PCR 튜브를 사용하지만, 우리는 또한를 갖추고 열 흔드는 표준 1.5 ml의 튜브를 사용했다관이 유형. 프로토콜에 대한 다른 변화는 더 큰 크기의 튜브를 사용하는 것이 필요하지 않습니다. 우리의 경험에서, 그러나, 우리는 더 많은 PRP 입술 생산 및 1.5 ml의 튜브에 비해 낮은 결합 PCR 튜브에 더 많은 결과를 재현 있었다. PCR 튜브에 분석의 향상된 성능에 대한 설명은 단지,이 때의 투기 공기 - 물 계면이 PRP fibrillization 25 중요임을 나타내는 결과들에 기초하지만, 우리는 작은 튜브 PRP 대한보다 최적의 표면 장력을 제공 가설 변환.
아마도 CER 분석의 사용에 주요한 제한은 전환 비율은 질병 투과도 또는 배양 기간의 길이와 생체 종 장벽 결정 요인의 관점에서 무엇을 나타내는 지 이해에있다. 체외 사이의 생체 종 장벽 요인에 현재 알 수없는, 번역 테스트와 T의 CER 분석의 지속적인 사용으로 명확하게해야하지만이미 생체 년에 설립되었으며, 생물 검정 데이터를 사용할 수없는 경우 종에서 결과를 자격을하는 데 도움이 될 것입니다하는 ional TSE 종 장벽. PMCA에 비해 CER 분석의 장점은 어떠한 TSE 에이전트에 의해 변환 될 수 PRP 변환, 즉 pH를 3.5 기판위한 내부 제어의 존재이다. 이있는 경우, TSE 에이전트가 이국적인 호스트의 PRP C의 잘못된 폴딩이 발생할해야하는, 불분명 할 때이 컨트롤 값이다. PMCA의 특정 TSE 에이전트를 증폭 지정된 호스트 기판의 무능력 종 장벽의 증거로 해석 될 수있다 또는 기술의 실패가 원인 일 수 있습니다. PMCA에 비해 CER 분석의 단점은 PRP 입술, CER 기판 준비 추가 단계 및 CER 반응에 의해 생성 된 PRP 입술에 알려진 감염의 증폭을 제한 등이 있습니다. 이는 이전의 연구에서, 그러나, 우리는 CER 분석은 PRP 입술의 비슷한 패턴 FO 결과 발견 주목하여야한다PMCA (15)과 rmation. 여기에 제시된 결과는 또한 CER 분석이 제대로 실험실 마우스 (그림 3) 다양한 TSEs의 전송을 위해 종 장벽을 예측을 나타냅니다와 살쾡이가 국내 고양이 (보고서와 일치, CWD (그림 4)에 고양이 속을 감수성을 가질 수 있음을 시사 catus)는 실험 CWD 도전 (26, 27) 이후 프리온 질병을 수집 할 수 있습니다. CER 분석을 사용하여 연구 CWD (28)에 야생 동물의 감수성을 이해하는 PRP 시퀀싱 노력을 칭찬 할 수있다.
CER 분석은 신속하고 저렴한 비용으로, 체외에서 TSE 종 장벽의 신뢰성 평가를 할 수 있습니다. 동물 생물 검정법의 "황금 표준"에 대한 없습니다 완전히 대체하는 동안, CER 분석은 정당화 사는 동물에서 더 많은 연구를 미연에 방지 할 수있는 TSE 종 장벽의 존재의 초기 평가로 사용할 수 있습니다. 이 때문에, 분석에만 의존하기 때문에비 실험 동물로부터 취득 할 수 뇌 조직에 CER은 동물 실험 절차 (29)를 대체 줄이고 구체화하는 노력을 유지하고있다. 미스 폴딩 형태로 정상적인 기능성 PRP C의 변환 : 종 장벽을 평가하는 것 외에도, CER 분석은 또한 프리온 질병 생물학을 정의 근본적인 이벤트 메카니즘을 조사하기 위해 가진 단순화 된 플랫폼을 제공 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE gels | Life Technologies | NP0342 | |
| 0.5 mm Zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | Other varieties of beads are also effective |
| Antibodies | various suppliers | Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest | |
| Bead homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | High speed with temperature control |
| Conical tubes | any brand | ||
| Cotton-tipped applicator | Uline | S-18991 | |
| Cuphorn sonicator | Heat Systems-Ultrasonics | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC |
| Densitometry software program | UVP | Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software | Other programs, such as NIH ImageJ, will also work |
| Dounce homogenizer | Kimble Chase | 885300 | |
| End-over-end mixer | Labnet International | H5600 | |
| Ethylenediaminetetra acetic acid | Boston Bioproducts | P-770 | Hazardous chemical: eye irritation |
| Guanidine hydrochloride, 8 M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation |
| Heating block | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 435570 | Hazardous chemical: strong acid |
| Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x | Life Technologies | NP0008 | Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid |
| Microcentrifuge tubes | any brand | ||
| Mini-centrifuge | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Hazardous chemical: skin irritation, eye damage |
| SDS-PAGE gel system | Life Technologies | NuPAGE electrophoresis system | Other SDS-PAGE systems will also work |
| PCR tubes (low-binding) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Pestle homogenizer | Fisher Scientific | 03-392-106 | |
| pH meter | Sentron | SI600 | |
| Polyvinyldifluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinase K | Promega | V3021 | Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity |
| Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x | Life Technologies | NP0009 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Hazardous chemical: acute toxicity |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Hazardous chemical; strong base |
| Syringe | BD Biosciences | various | Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized |
| Syringe needles | BD Biosciences | various | |
| Thermoshaker (PCR tube shaker) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 |
References
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