Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Chitosan / interfering RNA Nanopartikkel mediert genet Slå i Disease Vector mygglarver

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52523
Automatic Translation
*1, *2,3, 3,4, 1, 3,4, 5, 2,3,4
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåte for å hemme genfunksjon i sykdomsvektor mygg ved bruk av kitosan / interfererende RNA-nanopartikler som er inntatt av larver.

Abstract

Vektor mygg påføre mer menneskelig lidelse enn noen annen organisme - og drepe mer enn én million mennesker hvert år. De mygg genomprosjekter tilrettelagt forskning i nye fasetter av mygg biologi, inkludert funksjonelle genetiske studier i primær afrikanske malaria vektor Anopheles gambiae og dengue og gul feber vektor Aedes aegypti. RNA uforstyrret (RNAi-) mediert genet Slå har blitt brukt til å målrette gener av interesse i begge disse sykdomsvektormyggarter. Her beskriver vi en fremgangsmåte for fremstilling av kitosan / interfererende RNA-nanopartikler som er kombinert med mat og inntas av larver. Dette er teknisk ukomplisert høy gjennomstrømning, og forholdsvis billig metode, som er kompatibel med langt dobbelttrådet RNA (dsRNA) eller små interfererende RNA (siRNA) molekyler har blitt brukt for en vellykket knockdown av en rekke forskjellige gener i A. gambiae og A. aegyptilarver. Etter larve feedings, knockdown, noe som er bekreftet gjennom QRT-PCR eller in situ hybridisering, kan vedvare minst gjennom sent pupal scenen. Denne metoden kan anvendes på et bredt utvalg av mygg og andre insektarter, inkludert skadedyr i jordbruket, så vel som andre ikke-modellorganismer. I tillegg til sin anvendelse i forskningslaboratorium, i fremtiden, kitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrytbar polymer, kan potensielt bli anvendt i felten.

Introduction

Blod fôring vektor mygg av Anopheline og Aedine slekter overføre sykdomsfremkallende stoffer som er ansvarlige for flere av de verste svøper i menneskeheten. Anslagsvis 3,4 milliarder mennesker er i faresonen for å pådra malaria, som er ansvarlig for over en halv million dødsfall årlig på verdensbasis. Malaria resultater fra infeksjon med Plasmodium sp. Parasitter, som overføres til mennesker gjennom bitt av infisert mygg av Anopheles slekten, inkludert rektor afrikanske vektor Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , Aedes aegypti er den primære mygg vektor for dengue virus som forårsaker denguefeber, en ikke-spesifikk febril sykdom som er den mest utbredte og betydelig arboviral sykdom i verden 2014) 1.. Dengue-virus er i dag en trussel mot> 2,5 milliarder mennesker i tropene, med en årlig incidence på ca 50 millioner tilfeller har resultert i ~ 24 000 dødsfall årlig ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Til tross for den ødeleggende globale effekten av mygg-borne sykdommer på menneskers helse, er effektive virkemidler for å forebygge og behandle disse sykdommene mangler. Mygg kontroll er i dag den beste metoden for sykdomsforebygging.

Potensialet for å styre leddyr sykdommer ved genetisk manipulering av vektor insekter har blitt anerkjent i over fire tiår tre. Transgene stammer av A. aegypti konstruert for å ha en repressible kvinnelig spesifikke flight fenotype nylig har gjort potensialet for bruk av transgene vektor kontroll strategier en realitet 4-6. Disse fremskritt har utfordret forskerne å identifisere nye genetiske mål for vektor kontroll og ekstra middel til å manipulere gen-funksjon i vektor mygg. Endring av genekspresjon during utvikling, slik tilfellet var i kvinneflight mygg 4 var, kan fremme klarlegging av nye vektor kontroll strategier. Imidlertid i stor grad på grunn av tekniske utfordringer, funksjonene til svært få gener har vært preget under utviklingen av A. gambiae, A. aegypti, eller andre myggarter.

Siden den ble oppdaget i C. elegans 7, RNA-interferens (RNAi), som er konservert i dyr, planter og mikroorganismer, har vært i utstrakt bruk for funksjonell genetiske studier i en rekke organismer, inkludert insekter 8,9. RNAi veien er initiert av dicer, som kløyver lang dsRNA i korte 20-25 nukleotid-lang sirnas som fungerer som sekvens-spesifikke RNA forstyrrende. sirnas stillhet gener som er komplementære i rekkefølge ved å fremme avskrift omsetning, cleavage, og forstyrrelse av oversettelses 9. Lange dsrna molekyler (typisk 300-600 bp) eller egendefinerte sirnas rettet mot en particular-sekvens kan anvendes i forskningslaboratorium for lyddemping ethvert gen av interesse. Ved å styre når interfering RNA er levert, kan forskerne styre tiden på hvilket gen stanse innviede. Denne fordel er nyttig fordi det kan brukes til å overvinne utfordringer som utviklings letalitet eller sterilitet, som kan hindre produksjon og vedlikehold av stammer som bærer mutasjoner arve, en kostbar og arbeidskrevende prosess som ennå ikke er tilgjengelig på alle insektarter. Selv om graden av genet Slå av RNAi kan variere fra gen til genet, vev til vev, og dyr til dyr, er RNAi mye brukt for funksjonell analyse av gener i mygg og andre insekter 8,9.

Tre interfererende RNA leverings strategier har blitt brukt i mygg: mikroinjeksjon, soaking / lokal applikasjon, og inntak. For en detaljert historie og sammenligning av bruken av disse tre teknikkene i insekter, henvises det til Yu et al 8. We har med hell brukt mikroinjeksjon 10 som et middel til å levere sirnas å målrette utviklings gener i A. aegypti embryoer, larver og pupper 11-14. Men denne arbeidskrevende levering strategi krever både en mikroinjeksjon oppsett og en dyktig hånd. Videre er mikroinjeksjon stressende for organismen, en problemfaktor, spesielt når atferds fenotyper vil bli vurdert. Endelig kan mikroinjeksjon levering ikke forlenges til feltet for vektorkontroll. Som et alternativ, har soaking organismen i interfering RNA løsning også blitt et populært middel for å indusere genet Slå, som det er praktisk og krever lite utstyr eller arbeidskraft. Soaking har primært blitt brukt i insektcellelinje studerer åtte, men i en fersk studie, ble knockdown oppnådd i A. aegypti larver neddykket i en oppløsning av dsRNA 15, hvor dyrene viste seg å være inntak. Imidlertid, for studier som involverer analyse av flere Experimental grupper eller fenotyper, er soaking ganske kostbare. Lopez-Martinez et al. 16 beskrevet rehydrering drevet RNAi, en ny tilnærming for interfering RNA levering som involverer dehydrering i saltvannsoppløsning og rehydrering med en eneste dråpe vann som inneholder RNA forstyrrende. Denne tilnærmingen gjør kutte kostnadene forbundet med hele dyr nedsenking, men er dyrere enn mikroinjeksjon og kan være begrenset i sin søknad til arter som tåler høye osmotiske trykk. Dessuten er det vanskelig å forestille seg hvordan nedsenking eller dehydrering / rehydrering nedsenking metodikk kunne tilpasses for vektorkontroll i felten. For disse grunner, for post-embryonale studier, levering av interfering RNA med inntatt mat er et levedyktig alternativ strategi.

Selv svelging baserte strategier ikke fungerer i alle insektarter, kanskje mest kjent Drosophila melanogaster, har oral levering av interfering RNA blandet med mat forfremmet genet silencing i en rekke insekter 8,17, inkludert A. aegypti voksne 18. Vi beskrev kitosan nanopartikkel-mediert RNAi i A. gambiae larver 19 og har med hell brukt denne tilnærmingen for reduksjon av genuttrykk i A. aegypti larver 20,21. Her, metodikk for dette RNAi prosedyre, som innebærer entrapping av interfering RNA ved polymer kitosan, er detaljert. Chitosan / interfererende RNA-nanopartikler er dannet av selvbygging av polykationer med interfererende RNA gjennom de elektrostatiske krefter mellom positive ladninger av aminogruppene i kitosan og negative ladninger som bæres av de fosfatgrupper på ryggraden i interfererende RNA 19. Fremgangsmåten som er beskrevet er kompatibel med både lange dsrna molekyler (heretter referert til som dsRNA) eller dobbelt-trådet siRNA (heretter referert til som siRNA). Etter syntese kitosan / interfererende RNA nanopartikler er blandet med larve mat og levert tillarver gjennom oralt inntak. Denne metoden er relativt billig, krever lite utstyr og arbeidskraft 19, og legger til rette for høy gjennomstrømming analyse av flere fenotyper, inkludert analyse av atferd 20,21. Denne metode, som kan tilpasses for genet Slå studier i andre insekter, blant andre sykdoms vektorer og insekt skadedyr i jordbruket, kan benyttes for genet Slå i en rekke andre dyrearter. Videre, kitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrytbar polymer 22, kan potensielt bli anvendt i feltet for artsspesifikk mygg kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mosquito Arter og stell

  1. Opprettholde A. gambiae G3 og A. aegypti Liverpool IB12 stammer (som brukes i de representative studier under) eller andre stammer av interesse i henhold til standard lab praksis eller som tidligere beskrevet 23,24.

2. dsRNA og siRNA Design og Produksjon

  1. Design primere for å konstruere lange dsrna maler som er spesifikke for genet av interesse. Bruk E-RNAi verktøy 25. Produsere dsRNA i henhold til metoden for valg eller som tidligere beskrevet 19.
    1. For en negativ kontroll, syntetisere dsRNA 19 svarende til sekvensen av grønt fluorescerende protein (GFP), β-galaktosidase (β-gal), eller et annet gen ikke uttrykt i mygg. Hvis ønskelig, kan dsRNA 19 benyttes til å generere de representative resultater er oppsummert nedenfor benyttes som en positiv kontroll. Butikk dsRNA oppløst i RNAse-fritt vann ved -80 °C inntil nødvendig.
  2. Alternativt kan utformingen genspesifikke siRNA henhold til standard laboratoriepraksis, eller som tidligere beskrevet 10. Scramble sekvens av en knockdown siRNA til design negativ kontroll siRNA som ikke korresponderer med noen mygg genet. Kjøpe tilpassede sirnas, som er tilgjengelig gjennom en rekke anerkjente leverandører.
    1. Hvis ønskelig, kan sirnas 20,21 benyttes for å oppnå de representative resultater er oppsummert nedenfor bli brukt som positive kontroller. Butikk siRNA oppløst i RNase-fritt vann ved -80 ° C inntil behov.

3. Forberede Chitosan / interfering RNA Nanopartikler

  1. Samle ferdiglaget RT 100 mM natriumsulfat (100 mM Na 2 SO 4 i deionisert H2O) og 0,1 M natriumacetat (0,1 M NaCl 2 H 3 O 2 -0.1 M eddiksyre, pH 4,5 i deionisert H2O) buffere.
  2. Oppløse kitosan (≥75%deacetylert) i 0,1 M natriumacetat buffer for å gjøre 0,02% (w / v) arbeidsløsning og holde løsningen ved romtemperatur før bruk.
  3. Oppløse dsRNA eller siRNA i 50 mL avionisert H 2 O og legge den til 100 mM natriumsulfat buffer for å lage en 100 mL løsning av 32 mikrogram av dsRNA / siRNA per 100 mL av 50 mM natriumsulfat.
  4. Tilsett 100 ul av kitosan løsning på dsRNA / siRNA-løsning, og deretter oppvarme blandingen i et vannbad ved 55 ° C i 1 min. Sett opp en kontroll ved å tilsette 100 ul 50 mM natriumsulfat til 100 ul chitosanløsning og følger den samme prosedyre.
  5. Bland løsningene umiddelbart for 30 sek ved høy hastighet virvling ved RT for å lette dannelsen av nanopartikler.
  6. Sentrifuger blandingen ved 13 000 xg i 10 min ved romtemperatur, etter hvilken tid en pellet bør være synlig. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml rør. Luft-tørke pellet for ≈10 min ved RT før du bruker den til å forberede mygg mat.
  7. Measure konsentrasjonen av dsRNA / siRNA i supernatanten ved hjelp av supernatanten fra kontrollen (se 3.5) som et tomt for å beregne den totale mengde av dsRNA / siRNA som forble i supernatanten. Bruk forskjellen mellom utgangs mengder av dsRNA / siRNA og mengder som er igjen i supernatantene til å beregne prosentandelen av dsRNA / siRNA innkapslet i nanopartikler. Denne lasteeffektivitet er normalt over 90%.
  8. Gjenta samme prosedyre hvis flere nanopartikler er nødvendig. Bruk tørkede nanopartikler umiddelbart. Virkningen av kjølelagring av partikler før bruk er ikke evaluert.

4. Klargjøring Mosquito Mat som inneholder Chitosan / interfering RNA Nanopartikler

  1. Forbered 1 ml av en 2% agarose-løsning (vekt / volum) i avionisert vann, smelte agarosen og holde smeltet agarose løsning i et 55 C vannbad før bruk.
  2. Bland fiskefor flak (47% råprotein, min. Råfett 10%, maks. Rå fiber 3%) og tørrgjær ved enforhold på 2: 1 (w / w). Riv blandingen til små partikler med en morter og støter (brukbar gjennom No. 50 USA standard test-sikt). Bruk bakken mat, som skal være brunaktig i fargen, enten umiddelbart eller lagre den i en lukket beholder ved 4 ˚C i flere uker.
  3. I en 1,5 ml tube, bland 6 mg av bakken mat med de tørkede nanopartikler fra avsnitt 3.7 med en tannpirker.
  4. Tilsett 30 pl av 2% pre-smeltet agarose gel-løsning til mat-nanopartikkel-blanding; røre umiddelbart og grundig ved hjelp av en tannpirker eller pipette tips.
  5. Bruke gel som inneholder mat og nanopartikler for å mate mygglarver umiddelbart. Alternativt, så snart gelen er fullstendig størknet ved RT, lagre gel ved 4 ° C og bruk neste dag, eller ved -80 ° C for senere bruk.

5. Fôring mygglarver med mat som inneholder Chitosan / interfering RNA Nanopartikler

  1. Fôring A. gambiae mygglarver:
    1. Fjern en single gel pellet fra 1,5 ml tube bruker en tannpirker og skjær den i seks like store skiver med en ren barberblad eller tann hakke.
    2. Overføring 20 tredje instar larver til en 500 ml petriskål inneholdende 100 ml avionisert vann.
    3. Mate mygglarver ved å legge en skive av gel pellet (finhakket i mindre biter) per petriskål en gang om dagen i fire dager. Sørg for å observere larver fôring på pellet, som bør bli betydelig redusert i størrelse eller helt fraværende ved neste dag. Etter gang, vil myggen utvikle seg til sent fjerde stadium larver.
    4. Registrere eventuelle synlige fenotypiske endringer i løpet av eksperimentet. Undersøk transkripsjonsnivåer og andre fenotypiske endringer som diskutert i avsnitt 6 ved enden av den fire dagers periode.
  2. Fôring A. aegypti mygglarver:
    1. Skjær gel pellet inn i 6 like store skiver med en ren barberblad eller tannpirker.
    2. Plassere 50 alders synkronisert 24 timer etter egg klekking fiførste instar larver i en petriskål i ≈40 ml avionisert vann.
    3. Strøm larver ett stykke per petriskål i 4 timer / dag, og deretter overføre larvene tilbake i det faste larve diett med 2: 1 bakke fiskefor flak og tørrgjær for resten av dagen. Gjenta prosedyren daglig gjennom de fire larve instars.
    4. Undersøke transkripsjonsnivåer og andre fenotypiske endringer som omtalt i punkt 6 ved de ønskede utviklings tidspunkter.

6. Bekreftelse av Gene Pusse

  1. Relativ transkripsjon kvantifisering av QRT-PCR i A. aegypti og A. gambiae larver.
    1. Utføre og analysere QRT-PCR-analyser med tre biologiske replikater på minst 10 pooled kontroll vs. eksperimentell larver som beskrevet 11,19,20, eller i henhold til standard lab prosedyre. Representative resultatene er inkludert nedenfor.
    2. For analyse av en spesiell vevstype / kroppsdel ​​(dvs., Hjerne eller antenne), perform QRT-PCR som beskrevet i 6.1.1 etter disseksjon å gjenopprette vevet av interesse (se for eksempel Mysore et al. 21).
  2. Bekreftelse av knockdown ved in situ hybridisering
    1. Syntetisere digoxygenin-merket antisens- og fornemme kontroll riboprober henhold til standard lab praksis eller som beskrevet 26.
    2. Utføre in situ hybridisering pr Haugen et al. 27 protokoll for bekreftelse av knockdown som beskrevet tidligere 11,20 og diskutert i den representative resultater nedenfor.
  3. Bekreftelse av knockdown ved immunhistokjemi
    1. Hvis antistoffer mot proteinproduktet av genet målrettet er tilgjengelige, utfører immunhistokjemi som tidligere beskrevet 28 som letter identifikasjon av personer med størst nivåer av knockdown for fenotype analyse 20 som eksemplifisert i representative resultater nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A. gambiae:

Kitosan / dsrna nanopartikler dannes på grunn av den elektrostatiske interaksjon mellom aminogruppene av chitosan og fosfatgrupper av dsRNA. Effektiviteten av dsRNA inkorporering i nanopartikler er vanligvis over 90%, målt ved uttømming av dsRNA fra oppløsningen. Atomic force mikroskopi bilder viser at kitosan-dsrna partikkelstørrelse gjennomsnitt 140 nm i diameter, alt 100-200 nm (figur 1).

Figur 1
Figur 1. Nanopartikkel dannelse av kitosan og RNA interfererende. Atomic force microscopy bilde av kitosan / dsrna nanopartikler (A) eller kitosan løsning uten tilsetning av dsRNA (B). Størrelsen av bildene var 1,0 um x 1,0 um. Skala bar = 250 nm.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fôring av disse partiklene som er kombinert med standard larve mat og innlemmet i agarose støtter normal larveutvikling. Viktigere er spesifikk knockdown av ektoderm-avledet AgCHS1 transkripter samt midgut spesifikke AgCHS2 (figur 2) er mulig 19, som viser at dsRNA opptas gjennom inntak av nanopartikler initierer RNAi utover midttarmen. Knockdown effektivitet ≈40-60% ble observert (f.eks., Figur 2) og variere mellom transkripsjoner.

Figur 2
Figur 2. transkripsjons nivåer av kitin syntase 2 (AgCHS2) etter dsRNA inntak i <em> A. gambiae larver. Relative mRNA nivåer av AgCHS2 i larver fôret med nanopartikler med ds AgCHS2 eller kontroll ds GFP. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige biologiske replikater. Ulike bokstaver på Linjene indikerer signifikante forskjeller basert på parvise t-tester (P = 0,003).

Knockdown av AgCHS1 betydelig redusert det totale kitin innholdet i fjerde stadium larver og økt mottakelighet for kitin syntese inhibitor insektmiddel, diflubenzuron 19, knockdown av AgCHS2 betydelig økt effekt av calcofluor hvit og dithiothreitol som forstyrret peritrophic matrise (PM) i fjerde stadium larver (figur 3) som resulterer i økt dødelighet 17.

Figur 3
AgCHS2 ingenanopartikler på A. gambiae peritrophic matrise (PM) permeabilitet. Calcofluor hvit eller DTT behandling forstyrrer PM av A. gambiae larver som er videre exuberated av AgCHS2 knockdown gjennom inntak av kitosan / dsRNA nanopartikler 19. (A) Mosquito med intakt PM. (B) Mosquito med forstyrret PM, dekstran blå lekker inn i mage ceacae.

A. aegypti:

Kitosan / siRNA nanopartikler ble brukt til å målrette axon veiledning genet semaphorin-1a (sema1a) under A. aegypti larveutvikling 20. Knockdown av sema1a ble bekreftet gjennom in situ hybridisering, som oppdages reduserte nivåer av sema1a i ≈60% av larve hjernen assessed og ikke klarte å oppdage sema1a uttrykk i ≈40% av knockdown dyr hjernen (Figur 4C vs. B; gul pilspissen indikerer antennal lapp). QRT-PCR-analyser utført på samlede hele dyr viste at denne teknikk resulterte i 32 ± 10% reduksjon i sema1a transkripter sammenlignet med kontroll-nanopartikkel forede dyr (figur 4A; P <0,01 basert på paret t-test, N = 5, hvor N er antall biologiske replikater). Knockdown i hjernen vedvarte gjennom minst 24 timer av pupal utvikling, som vist ved tap av anti-Sema1a antistoff ekspresjon (fig 4E1 vs. D1), som ble anvendt for å identifisere dyr med betydelig knockdown under larve og pupal olfactory fenotype analyser. Larver og pupal antennal lobe defekter (kvantifisert i tabell 1) ble oppdaget i sema1a knockdown larver og pupper (figur 4E2, E3 vs. (figur 4E2 vs. D2, visualisert med mAbnc82; overlegg av begge signaler er vist i fig 4D3, E3). Sammenlign fenotyper ble generert med to separate sema1a knockdown sirnas, noe som bidro til å sikre at manglene observerte var ikke et resultat av off-site målretting av enten siRNA. De høyeste nivåene av knockdown ble generert når sirnas ble kombinert, en strategi som kan brukes til å øke knockdown effektivitet (se Mysore et al. 20 for mer informasjon).

Figur 4
Figur 4. Chitosan / siRNA indusert knockdown av sema1a i utviklingsluktsystemet til A. aegypti. QRT-PCR (A) og in situ hybridisering (B, C) ​​analyser bekreftet knockdown av sema1a i larver fôret med en blanding av sema1a målretting siRNA 890 og siRNA 1198 kitosan / interfererende RNA nanopartikler kontra kontrollnanopartikler. Tap av Sema1a uttrykk resulterte i glomeruli som er deformert (E1-3 vs. D1-3). Se teksten for detaljer. Dorsal er opp i alle paneler. Skala bar = 25 mikrometer. Dette tallet opprinnelig dukket opp i Mysore et al 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Larver Puppe
siRNA n <strong> villtype AL defekter n Villtype AL defekter
Kontroll 69 69 (100%) 0 (0%) 68 68 (100%) 0 (0%)
sema1a KD 77 42 (54.5%) 35 (44%) * 75 51 (68%) 24 (32%) *

Tabell 1. Kvantifisering av antennal lobe defekter følgende sema1a knockdown. En samlet oppsummering av oppnådde resultater for kontroll siRNA vs. sema1a knockdown (KD) siRNA 890 + siRNA 1198 kitosan nanopartikkel-matet dyr fra totalt åtte gjentatte eksperimenter utført i både larver ( venstre) og puppe (til høyre) er vist. Den totaleantall individer vurderes (n) og tall / prosenter av dyr viser villtype morfologi vs. antennal lobe (AL) defekter (olfactory reseptor nervecellen rettet feil, defekt neuropil og glomeruli Formasjonen) er indikert. Knockdown ble bekreftet immunohistochemically med anti-Sema1a antistoffarging i en undergruppe av dyr (15 larver og 10 puppe) som viste de mest alvorlige defekter (merket med *). Alle knockdown dyrene evaluert på denne måten ble funnet å ha reduserte nivåer av Sema1a, mens Sema1a nivåer i kontrollforet dyr som ikke ble merkbart forandret. Denne tabellen opprinnelig dukket opp i Mysore et al 20.

I en annen undersøkelse 21, kitosan / siRNA nanopartikler ble brukt til å målrette transkripsjonsfaktor Single-minded (Sim) under utvikling av luktesystemet. QRT-PCR-analyser med sammenslåtte hjerner dissekert fra hele dyr indikerte at sim knockdown hjerner hadde i gjennomsnitt en 47% reductipå i sim utskrifter i forhold til å kontrollere nanopartikkel-matet dyrene (p = 0,005 basert på paret t-test). Sammenlignbare analyser med antenner avslørt i gjennomsnitt en 77% reduksjon i sim nivåer med hensyn til å kontrollere foret dyr (P = 0,002 basert på paret t-test). Til tross for en viss variasjon i nivåene av knockdown mellom vev og dyr, ble sim transkripter ikke oppdages gjennom in situ hybridisering i ≈50% av knockdown dyr hjernen / antenner etter behandling med en av to forskjellige knockdown sirnas (figur 5B2, B3, C2, C3 vs. B1, C1, tabell 2). I gjær atferdsanalyser under hvilke personer som ble tiltrukket av gjær ble tildelt en score på 1, mens dyr som ikke ble tiltrukket ble gitt en score fra 0, gjennomsnittlig score for sim 430 eller SIM var si 718 knockdown dyrgnificantly lavere enn den for kontrollforet dyr i to duplikate eksperimenter (figur 5A; P <0,001 basert på paret t-test). Defekt lukt-sporing atferd (Figur 5A) korrelert med reduserte nivåer av sim i antennene (Figur 5B2, B3 vs. B1) og hjerner (Figur 5C2, C3 vs. C1, gule prikkene markerer omkretsen av antennal lapp, se tabell 2 for kvantifisering av resultatene). Flere defekter ble identifisert i antennene og antennal fliker av sim knockdown dyr (se Mysore et al 21 for detaljer.). For eksempel, sim knockdown larver og pupper manglet ekspresjon av orco, den obligate co-reseptor for alle odorant-reseptorer i olfactory reseptor neuroner (figur 6). Reduserte Orco transkripsjonsnivåer ble påvist hos personer matet med sim 430 ( Figur 6A3, B3) eller sim 718 (Figur 6A4, B4) knockdown (KD) kitosan / siRNA nanopartikler (sammenlignet med villtype dyr i figur 6A1, B1 og kontrollere kitosan / siRNA nanopartikkel-matet dyrene i Figur 6A2, B2). Tapet av orco uttrykk fenotype observert i L4 larver (Figur 6A1-A4) vedvarte gjennom minst 24 timer etter pupal dannelse (Figur 6B1-B4).

Figur 5
Figur 5. sim knockdown larver viser defekt lukt tiltrekkende oppførsel. In situ hybridisering avslørte reduserte nivåer av sim RNA i antennene (B2, B3) og hjerner (C2, C3) av sim 430 og sim 718 knockdown dyr (sammenligne å styre-matet i B1, C1), som ikke klarte å svare på gjær odorant tiltrekkende (A). Se teksten for detaljer. De proksimale ende av antennene er orientert oppover i B1-B3. Rygg er orientert oppover i C1-C3. Skala bar = 25 mikrometer. Dette tallet opprinnelig dukket opp i Mysore et al 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Tap av orco uttrykk i utviklings A. aegypti antenne etter knockdown av sim. reduserte nivåer av orco avskrift ble påvist hos personer fed med sim 430 (A3, B3) eller sim 718 (A4, B4) knockdown (KD) kitosan / siRNA nanopartikler (sammenlignet med villtype dyr i A1, B1 og kontrollere kitosan / siRNA nanopartikkel-matet dyrene i A2, B2). Se teksten for detaljer. Skala bar = 25 mikrometer. Dette tallet ble samlet fra bilder som er publisert i Mysore et al 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tiltrukket Ikke Tiltrukket
siRNA n # Dyr Normal Moderat Null # Dyr Normal Moderat Null
Kontroll 195 196 (100%) 196 (100%) 0 0 0 0 0 0
sim 430 KD 176 63 (35%) 48 (76%) 15 (24%) 0 113 (64%) 20 (18%) 12 (11%) 81 (71%)
sim 718 KD 177 66 (37%) 44 (66%) 22 (34%) 0 111 (63%) 20 (18%) 9 (8%) 82 (74%)

Tabell 2. Nivås av sim korrelerer med larve ytelse i en gjær atferdsanalyse. En samlet oppsummering av resultatene oppnådd i fire gjær odorant tiltrekkende replikere eksperimenter er vist. Det totale antall dyr (n) angir antall individuelle larver som ble testet i disse atferdstester. Antallet enkelte larver (# dyr) som ble tiltrukket (venstre, dyr som rørte gjær pellet og ble tildelt en score på 1) eller ikke tiltrukket (høyre, dyr som ikke berører gjær pellet og fikk en score fra 0) under hver tilstand (Control, sim 430 KD, eller sim 718 KD kitosan / siRNA nanopartikkel-matet) vises, og prosenter av totalt antall dyr inngår følgende rå tall. Knockdown av sim ble vurdert ved in situ hybridisering i hjernen og antenner av dyr tilt (venstre) eller ikke er tiltrukket (høyre) til gjær. Denrå antall / andel av personer med Normal (kan sammenlignes med villtype sim transkripsjonsnivåer), Null (ingen observerbar sim avskrift), eller Moderat (redusert, men ikke vill type) sim nivåene indikeres. Tap av sim korrelert godt med en manglende tiltrekning til gjær. Denne tabellen opprinnelig dukket opp i Mysore et al 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chitosan / interfererende RNA nanopartikkel metodologi beskrevet her har blitt brukt til å målrette gener under larveutvikling i A. gambiae (figur 2, 3) og A. aegypti (figur 4, 5, 6, Bord 1, 2). Kitosan nanopartikler kan være forberedt med enten lang dsRNA eller siRNA, som begge har vært brukt med hell i mygg som gjenspeiles av de representative resultatene som er beskrevet her. Syntese av dsRNA er billigere enn å kjøpe siRNA, men er mer arbeidskrevende. Hvis kitosan / siRNA brukes, kan fenotyper bli bekreftet med flere sirnas, noe som åpner for bedre sikkerhet for at fenotype avdekket er ikke på grunn av off-site målgruppe. Dessuten kan den kommersielle produksjonen av sirnas hopetall bedre til rette for utvidelse av kitosan / interfering RNA stanse for artsspesifikke mygg kontroll til feltet. Dette vil selvsagt kreve vinne obstacles som pris og leveringstid.

Selv om vi har hatt god suksess med denne protokollen, må metoder optimaliseres for hvert gen. Av denne grunn anbefaler vi at du tester flere sirnas, eller kanskje en siRNA og en lang dsRNA, ved utbruddet av et nytt prosjekt. Når fenotyper er identifisert og bekreftet med minst to distinkte sirnas svarende til et gen av interesse, kan det være nyttig å kombinere disse sirnas å øke pene fenotype (figur 4). Timingen og også varigheten av kitosan / interfererende RNA foringstiden kan optimaliseres for hver undersøkelse. A. gambiae trives når fôret kun med kitosan / interfering RNA mat som beskrevet her. Men i de eksperimenter har vi utført hittil, A. aegypti ikke har klart seg godt uten supplerende ernæring, et problem vi har overvunnet ved å overføre dem til en diett av normal mat etter 4 timer av kitosan / interfering RNA fôring. Eksperimentere med kitosan / forstyrrerRNA levering i en annen mat underlaget, som vi ennå ikke har forsøkt, kan omgå dette problemet. Vi har funnet ut at 4 h daglige feedings i løpet av flere dager resultere i en god balanse mellom knockdown og tilstrekkelig ernæring, men modifisering av varigheten av fôring kunne forfølges videre som ønsket. Dessuten kan larvestadium hvor kitosan / interfererende RNA nanopartikkel foring initieres / forts skreddersys for hvert forsøk avhengig av den kritiske utviklingsperioden hvori genfunksjon undersøkes, en viktig fordel med denne protokoll.

Verifikasjon av knockdown er selvsagt kritisk, men kan også kreve feilsøking. Av denne grunn kan det være nyttig å undersøke samtidig hvis fenotyper av interesse blir generert som knockdown effektivitet blir vurdert. For QRT-PCR-valideringsforsøk, er det kritisk at primere og PCR-forhold er optimalisert. Videre er det viktig at dyrene er utviklingsmessigsynkronisert ved begynnelsen av forsøket, som uttrykk for noen transkriptene kan være svært dynamisk i løpet av utvikling og på grunn av døgnrytme 29. Videre, mens denne teknikken klart genererer knockdown utover gut, vi er bare begynnelsen for å vurdere de vev som denne teknikken er effektiv, og dette kan variere mellom artene. Det vil derfor være nyttig å måle knockdown i bestemte vev, som kan oppnås ved å dissekere vev av interesse fra hele dyr for QRT-PCR-analyser eller gjennom in situ hybridisering (Tall 4-6) 20,21 og immunhistokjemi (figur 4) 20 analyser (se Haugen et al. 27 og Clemons et al. 28, henholdsvis for feilsøking disse protokollene). Siden knockdown varierer fra individ til individ, er det nyttig å utføre dobbelt-merking analyser for å vurdere fenotyper i kombinasjon med knockdown nivåer (Figure 4) 20, som i stor grad forenkler fenotype karakterisering. For atferdsstudier, kan knockdown nivåer i enkelte dyr være korrelert med deres atferds forestillinger (Tabell 2) 20,21.

Følger kitosan-mediert interfering RNA levering til A. aegypti larver, er redusert genekspresjon oppdaget på 24 timer av pupal utvikling (figur 4, 6) 20,21. Selv om nivåene av genekspresjon ennå ikke er vurdert i en detaljert måte utover dette punktet i utviklingen, har reduserte nivåer av genekspresjon blitt påvist i både 48 og 72 h A. aegypti puppe (KM, upublisert). Det ville være nyttig å forfølge mer detaljerte analyser av knockdown nivåer på flere stadier av A. aegypti pupal utvikling og også å vurdere A. gambiae puppe. Det ville også være interessant å finne ut om knockdown vedvarer hos voksne og å utforske nanopartikkel-mediert iterfering RNA levering strategier for voksne mygg.

Stedsspesifikke nuclease genet targeting tilnærminger ble nylig introdusert til A. aegypti og A. gambiae og tillater generering av målrettede, arvelige mutasjoner i mygg og andre ikke-genetiske modellorganismer 30,31. Selv om bruken av disse fremgangsmåter gir en mer ensartet tap av funksjon fenotype analyser, er en fordel i forhold til RNAi tilnærminger, screening for mutasjoner av interesse fortsatt ganske tidkrevende og arbeidskrevende. Videre, selv om RNAi tap av funksjon studier krever vedlikehold av bare villtype stammer, mutante mygg stammer må være individuelt steilet. Vedlikeholdet av recessive dødelige eller voksne sterile mutasjoner er for tiden utfordrende med tanke på dagens mangel på merkede fordelt i mygg. Således, mens stedsspesifikke nuclease genet targeting tilnærminger er raskt økende popularitet, kitosan / interfering RNA målretting kan være den optimalevalg for laboratorier som ikke er utstyrt for å holde mygg stammer og i tilfeller der tap av gen-funksjon under utvikling er uforenlig med overlevelse av belastningen.

Basert på våre funn, forventer vi at kitosan / interfering RNA kan brukes bredt for knockdown av mange ulike gener under utviklingen av A. gambiae, A. aegypti, så vel som andre insekter, og eventuelt andre ikke-genetisk modellorganismer. Vellykket genet Slå med kitosan / interfering RNA har blitt rapportert i andre leddyr arter, inkludert Penaeus monodon (reker) 32. En fersk studie viser at nanopartikler lette opptaket av dsRNA og dermed forbedre den knockdown effektivitet sammenlignet med direkte fôring av dsRNA i den asiatiske cornborer 33, som understreker potensialet for bruk av denne teknologien til å målrette skadedyr i jordbruket. Mulig bruk av siRNA-nanopartikler som terapi hos mennesker tiltrekker seg mye of interesse i det medisinske fellesskapet. Giljohann et al., 34 beskriver syntese og karakterisering av flerverdige RNA-gull nanopartikkel-konjugater, som har en seks ganger lengre halveringstid i forhold til fri dsRNA og lett inn i cellene. Davis et al. 35 beskrev det første menneske klinisk studie med systemisk administrasjon av sirnas ved hjelp av en nanopartikkel levering system til pasienter med solide tumorer, og muligheten for å bruke kitosan / siRNA therapeutics ble nylig anmeldt 36. Dermed kitosan / interfering RNA genet targeting teknologi er en verdifull laboratorium teknikk med potensial for bredere anvendelse. Fremtidig forskning vil utforske flere programmer for denne teknikken. Videre har kjemisk modifisering av chitosan og andre polymerer, et aktivt forskningsområde, kan øke effektiviteten av interfererende RNA levering eller tillater målrettet levering til spesifikke vev 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.02 ml pipetteman Rainin PR20 for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman Rainin PR200 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-120 for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman Rainin PR1000 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-046 for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5 TEKnova S0299 to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade BDH VWR BDH3092-500MLP to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade MP Biomedicals LLC. 800668 to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge Eppendorf AG 5415D to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells Sigma-Aldrich C3646-25G to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast Universal Food Corp NA to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool German Cancer Research Center NA for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food Wardley Goldfish FLAKE FOOD to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath Thermo Scientific 51221048 to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice not applicable not applicable for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Name Company Catalog Number Comments
Ice bucket Fisher Scientific 02-591-44 for storage of ice used during the procedure
liver powder MP Biomedicals LLC. 900396 to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven A variety of vendors not applicable to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm) Fischer Scientific 875713 interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter Mettler Toledo S220 for preparation of buffers
Razor blade Fischer Scientific 12-640 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA Thermo Scientific/Dharmacon custom for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) BDH/distributed by VWR VWR BDH0302-500G to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer VWR 61066-046 to measure the water bath temperature
Tooth picks VWR 470146-908 for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer A variety of vendors not applicable for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer Fischer Scientific 02-216-108 for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper Fischer Scientific NC9798735 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
  3. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
  4. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
  5. Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
  6. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
  10. Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  11. Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
  12. Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
  13. Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
  14. Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
  15. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
  16. Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
  17. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
  18. Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  20. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
  21. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
  22. Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
  23. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  24. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  25. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
  26. Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
  27. Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  28. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
  29. Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
  30. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  31. Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
  32. Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
  33. He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
  34. Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
  35. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
  36. Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
  37. Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).

Tags

Molecular Biology vektor biologi RNA interferens, DsRNA siRNA knockdown svelging mygg larver utvikling sykdom
Chitosan / interfering RNA Nanopartikkel mediert genet Slå i Disease Vector mygglarver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., … More

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., Michel, K., Severson, D. W., Zhu, K. Y., Duman-Scheel, M. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523, doi:10.3791/52523 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter