Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

रोगवाहक मच्छरों का लार्वा में chitosan / दखल शाही सेना nanoparticle के मध्यस्थता जीन मुंह बंद

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52523
Automatic Translation
*1, *2,3, 3,4, 1, 3,4, 5, 2,3,4
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम लार्वा द्वारा किया जाता है कि शाही सेना नैनोकणों / chitosan के उपयोग के माध्यम से रोग वेक्टर मच्छरों में जीन समारोह में बाधा हस्तक्षेप के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन है।

Abstract

वेक्टर मच्छरों किसी अन्य जीव की तुलना में अधिक मानवीय पीड़ा दण्ड - और एक लाख से अधिक लोगों को हर साल मार डालते हैं। मच्छर जीनोम परियोजनाओं प्राथमिक अफ्रीकी मलेरिया वेक्टर एनोफ़ेलीज़ gambiae और डेंगू और पीत ज्वर वेक्टर एडीज एजिप्टी में कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययनों सहित मच्छर जीव विज्ञान के नए पहलुओं में अनुसंधान में मदद की। शाही सेना interference- (RNAi-) मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने के लिए इन बीमारी वेक्टर मच्छर प्रजातियों में से दोनों में ब्याज की जीन लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, हम भोजन के साथ संयुक्त और लार्वा द्वारा किया जाता है कि शाही सेना नैनोकणों दखल / chitosan की तैयारी के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। लंबी डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) या छोटे दखल शाही सेना (siRNA) के अणुओं के साथ संगत है जो इस तकनीकी रूप से सरल, उच्च throughput, और अपेक्षाकृत सस्ती पद्धति, ए में विभिन्न जीनों के एक नंबर के सफल पछाड़ना के लिए इस्तेमाल किया गया है gambiae और ए एजिप्टीQRT- पीसीआर के माध्यम से या स्वस्थानी संकरण में सत्यापित है जो लार्वा। लार्वा feedings के बाद, पछाड़ना, कम से कम देर से पोटा संबंधी मंच के माध्यम से बच सकते हैं। इस पद्धति एक मच्छर और कृषि कीटों सहित अन्य कीट प्रजातियों की व्यापक विविधता है, साथ ही अन्य गैर-मॉडल जीवों के लिए लागू किया जा सकता है। अनुसंधान प्रयोगशाला में इसकी उपयोगिता के अलावा, भविष्य, Chitosan, एक सस्ती, गैर विषैले और जैव बहुलक में, संभावित क्षेत्र में उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

Anopheline और Aedine पीढ़ी के रक्त खिला वेक्टर मच्छरों मानव जाति की सबसे खराब संकट के कई के लिए जिम्मेदार रोग के कारण एजेंट संचारित। एक अनुमान के अनुसार 3.4 अरब लोगों को प्रतिवर्ष दुनिया भर के एक से डेढ़ लाख लोगों की मृत्यु के लिए जिम्मेदार है, जो मलेरिया, करार के लिए खतरा हैं। प्लाज्मोडियम सपा द्वारा संक्रमण से मलेरिया का परिणाम है। प्रिंसिपल अफ्रीकी वेक्टर एनोफ़ेलीज़ gambiae सहित (एनोफ़ेलीज़ जीनस के संक्रमित मच्छरों के काटने के माध्यम से लोगों को प्रेषित कर रहे हैं जो परजीवी, http://www.who.int/topics/malaria/en/ 2014) 1। एडीज एजिप्टी डेंगू बुखार, दुनिया में सबसे व्यापक और महत्वपूर्ण arboviral रोग है कि एक अविशिष्ट ज्वर बीमारी का कारण बनता है, जो डेंगू वायरस, के लिए प्राथमिक मच्छर वेक्टर है। डेंगू वायरस एक वार्षिक inciden साथ, वर्तमान में उष्णकटिबंधीय में> 2.5 अरब लोगों के लिए खतरा है24,000 लोगों की मृत्यु सालाना ~ में जिसके परिणामस्वरूप लगभग 50 लाख मामलों के सीई ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2। मानव स्वास्थ्य पर मच्छर जनित बीमारियों के विनाशकारी वैश्विक प्रभाव के बावजूद, को रोकने और इन बीमारियों के इलाज की कारगर साधन की कमी है। मच्छर नियंत्रण वर्तमान में बीमारी की रोकथाम का सबसे अच्छा तरीका है।

वेक्टर कीड़ों की आनुवंशिक हेरफेर द्वारा सन्धिपाद जनित रोगों को नियंत्रित करने के लिए संभावित चार दशकों से अधिक 3 के लिए मान्यता दी गई है। ए के ट्रांसजेनिक उपभेदों हाल ही में ट्रांसजेनिक वेक्टर नियंत्रण रणनीति एक वास्तविकता 4-6 उपयोग करने के लिए संभावित बना दिया है एजिप्टी एक repressible महिला-विशिष्ट उड़ान फेनोटाइप है करने के लिए इंजीनियर। ये प्रगति वेक्टर नियंत्रण और वेक्टर मच्छरों में जीन समारोह में हेर-फेर के अतिरिक्त साधन के लिए उपन्यास आनुवंशिक लक्ष्यों की पहचान करने के लिए शोधकर्ताओं ने चुनौती दी है। जीन अभिव्यक्ति डी का बदलावमहिला-उड़ान मच्छरों 4 में मामला था uring विकास, उपन्यास वेक्टर नियंत्रण रणनीति की व्याख्या को बढ़ावा देने के कर सकते हैं। हालांकि, बड़े पैमाने पर होने के कारण तकनीकी चुनौतियों के लिए, बहुत कुछ जीनों के कार्यों ए के विकास के दौरान विशेषता किया गया है gambiae, ए एजिप्टी, या अन्य मच्छर प्रजातियों।

सी में इसकी खोज के बाद से एलिगेंस 7, पशुओं, पौधों, और सूक्ष्मजीवों में संरक्षित है जो शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई), बड़े पैमाने पर कीड़ों 8,9 सहित जीवों की एक विस्तृत विविधता में कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। आरएनएआई मार्ग अनुक्रम विशिष्ट दखल शाही सेना के रूप में कार्य है कि कम 20-25 न्यूक्लियोटाइड-लंबे siRNAs में पासा खेलनेवाला, जो cleaves लंबे dsRNA द्वारा शुरू की है। प्रतिलेख कारोबार, दरार, और अनुवाद 9 के विघटन को बढ़ावा देकर अनुक्रम में पूरक हैं कि siRNAs चुप्पी जीनों। एक particula को लक्षित लंबे dsRNA अणुओं (आमतौर पर 300-600 बीपी) या कस्टम siRNAsआर अनुक्रम हित के किसी भी जीन मुंह बंद करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा सकता है। शाही सेना वितरित किया जाता है दखल जब प्रबंध करके, शोधकर्ताओं, जो जीन में शुरू मुंह बंद करने के समय को नियंत्रित कर सकते हैं। यह उत्पादन और पैतृक म्यूटेशन, अभी तक सभी कीट प्रजातियों में उपलब्ध नहीं है कि एक महंगी और श्रम प्रधान प्रक्रिया असर उपभेदों के रखरखाव में बाधा कर सकते हैं, जो इस तरह के विकास की मारक या बाँझपन के रूप में चुनौतियों को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में यह लाभ उपयोगी है। आरएनएआई द्वारा जीन मुंह बंद करने की डिग्री जानवर के लिए जीन, ऊतक के लिए ऊतक, और जानवर के लिए जीन से भिन्न हो सकता है, आरएनएआई व्यापक रूप से मच्छरों और अन्य कीड़ों 8,9 में जीन की कार्यात्मक विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है।

तीन दखल शाही सेना वितरण रणनीतियों मच्छरों में इस्तेमाल किया गया है: microinjection, भिगोने / सामयिक आवेदन, और घूस। एक विस्तृत इतिहास और कीड़ों में इन तीन तकनीकों के उपयोग की तुलना के लिए, यू एट अल 8 को देखें। डब्ल्यूई सफलतापूर्वक ए में विकासात्मक जीनों को लक्षित करने के siRNAs देने के एक साधन के रूप में microinjection के 10 का इस्तेमाल किया है एजिप्टी भ्रूण, लार्वा, और pupae 11-14। हालांकि, इस श्रम प्रधान वितरण रणनीति एक microinjection सेटअप और एक कुशल हाथ दोनों की आवश्यकता है। इसके अलावा, microinjection के व्यवहार phenotypes के मूल्यांकन किया जाएगा, खासकर जब जीव, एक confounding कारक के लिए तनावपूर्ण है। अंत में, microinjection के वितरण वेक्टर नियंत्रण के लिए क्षेत्र के लिए बढ़ाया नहीं जा सकता। यह सुविधाजनक है और छोटे से उपकरण या श्रम की आवश्यकता के रूप में एक विकल्प के रूप में शाही सेना समाधान दखल में जीव भिगोने भी, जीन मुंह बंद उत्प्रेरण का एक लोकप्रिय साधन बन गया है। भिगोने मुख्य रूप से कीट सेल लाइन में लागू किया गया है 8 अध्ययन है, लेकिन हाल के एक अध्ययन में, पछाड़ना ए में हासिल की थी एजिप्टी लार्वा जानवरों ingesting जा दिखाई जो dsRNA 15, की एक समाधान में डूबे। हालांकि, कई experimenta के विश्लेषण शामिल अध्ययन के लिएएल समूहों या phenotypes, भिगोने बल्कि महंगा है। लोपेज-मार्टिनेज एट अल। 16 आरएनएआई, दखल शाही सेना युक्त पानी की एक बूंद के साथ नमकीन घोल और पुनर्जलीकरण में निर्जलीकरण शामिल है कि शाही सेना वितरण हस्तक्षेप के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण संचालित पुनर्जलीकरण का वर्णन किया। यह दृष्टिकोण पूरी पशु विसर्जन के साथ जुड़े लागत में कटौती, लेकिन microinjection से ज्यादा महंगा है और उच्च आसमाटिक दबाव के बर्दाश्त कर सकते हैं कि प्रजातियों के लिए अपने आवेदन में सीमित किया जा सकता करता है। इसके अलावा, यह विसर्जन या निर्जलीकरण / पुनर्जलीकरण विसर्जन कार्यप्रणाली क्षेत्र में वेक्टर नियंत्रण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे कल्पना करना मुश्किल है। इन कारणों के लिए, के बाद भ्रूण के अध्ययन के लिए, भोजन किया जाता के साथ शाही सेना हस्तक्षेप के वितरण के लिए एक व्यवहार्य विकल्प रणनीति है।

घूस आधारित रणनीतियों सभी कीट प्रजातियों, शायद सबसे विशेष रूप से ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में काम नहीं करते हैं, भोजन के साथ मिश्रित आरएनए हस्तक्षेप की मौखिक वितरण जीन एसआई को बढ़ावा दिया हैकीड़े 8,17 की एक किस्म में lencing, सहित ए एजिप्टी वयस्कों 18। हम ए में chitosan nanoparticle की मध्यस्थता आरएनएआई वर्णित gambiae लार्वा 19 और सफलतापूर्वक ए में जीन की अभिव्यक्ति की कमी के लिए इस दृष्टिकोण आवेदन किया है एजिप्टी लार्वा 20,21। इधर, बहुलक chitosan के द्वारा आरएनए हस्तक्षेप की entrapping शामिल है जो इस आरएनएआई प्रक्रिया के लिए कार्यप्रणाली, विस्तृत है। Chitosan / दखल शाही सेना नैनोकणों chitosan में एमिनो समूहों के सकारात्मक शुल्क और शाही सेना के 19 दखल की रीढ़ की हड्डी पर फॉस्फेट समूहों द्वारा किए गए नकारात्मक आरोपों के बीच electrostatic बल के माध्यम से शाही सेना के हस्तक्षेप के साथ polycations की आत्म विधानसभा द्वारा गठित कर रहे हैं। वर्णित प्रक्रिया लंबे dsRNA अणुओं (इसके बाद siRNA के रूप में संदर्भित) siRNA फंसे (इसके बाद dsRNA के रूप में) या डबल दोनों के साथ संगत है। निम्नलिखित संश्लेषण, chitosan / दखल शाही सेना नैनोकणों लार्वा खाने के साथ मिलाया जाता है और करने के लिए वितरित कर रहे हैंमौखिक घूस के माध्यम से लार्वा। इस पद्धति, अपेक्षाकृत सस्ती है थोड़ा उपकरण और श्रम 19 की आवश्यकता है, और व्यवहार 20,21 के विश्लेषण सहित कई phenotypes के उच्च throughput विश्लेषण की सुविधा। अन्य रोग वैक्टर और कीट कृषि कीटों सहित अन्य कीड़े, में जीन मुंह बंद करने के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जो इस पद्धति, संभवतः अन्य जानवरों की प्रजातियों की एक किस्म में जीन मुंह बंद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, Chitosan, एक सस्ता, गैर विषैले और biodegradable बहुलक 22 संभावित प्रजाति विशिष्ट मच्छर नियंत्रण के लिए क्षेत्र में उपयोग किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. मच्छर प्रजाति और पालन

  1. ए बनाए रखें gambiae जी 3 और ए एजिप्टी लिवरपूल IB12 (नीचे प्रतिनिधि पढ़ाई में प्रयुक्त) उपभेदों या मानक प्रयोगशाला अभ्यास करने के लिए या पहले से 23,24 के रूप में वर्णित अनुसार हित के अन्य उपभेदों।

2. dsRNA और siRNA डिजाइन और उत्पादन

  1. डिजाइन प्राइमरों ब्याज की जीन के लिए विशिष्ट लंबे dsRNA टेम्पलेट्स निर्माण करने के लिए। ई-आरएनएआई उपकरण 25 का प्रयोग करें। के रूप में पसंद या करने की विधि के अनुसार dsRNA का उत्पादन पहले से 19 में वर्णित है।
    1. एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), β-galactosidase (β-लड़की), या मच्छरों में व्यक्त नहीं कुछ अन्य जीन के अनुक्रम को इसी dsRNA 19 synthesize। इसलिए अगर वांछित, नीचे संक्षेप प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया dsRNA 19 एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। स्टोर dsRNA -80 डिग्री पर RNase मुक्त पानी में भंग; सी की जरूरत तक।
  2. वैकल्पिक रूप से, डिजाइन जीन विशिष्ट siRNA मानक प्रयोगशाला अभ्यास के अनुसार या के रूप में पहले 10 में वर्णित है। किसी भी मच्छर जीन के अनुरूप नहीं है कि नकारात्मक नियंत्रण siRNA डिजाइन करने के लिए एक पछाड़ना siRNA के अनुक्रम हाथापाई। सम्मानित विक्रेताओं के एक नंबर के माध्यम से उपलब्ध हैं, जो कस्टम siRNAs, खरीदें।
    1. इसलिए अगर वांछित, नीचे संक्षेप प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त करने के लिए उपयोग किया siRNAs 20,21 सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। जब तक जरूरत स्टोर siRNA डिग्री सेल्सियस -80 में RNase मुक्त पानी में भंग।

3. शाही सेना नैनोकणों दखल / Chitosan की तैयारी

  1. पूर्व बनाया आरटी 100 मिमी सोडियम सल्फेट इकट्ठा (विआयनीकृत एच 2 ओ में 100 मिमी ना 2 अतः 4) और 0.1 एम सोडियम एसीटेट (विआयनीकृत एच 2 ओ में 0.1 एम एनएसी 2 एच 3 ओ 2 -0.1 एम एसिटिक एसिड, पीएच 4.5) बफ़र्स।
  2. Chitosan के भंग (≥75%deacetylated) 0.1 एम सोडियम एसीटेट बफर में () वी / डब्ल्यू काम कर समाधान 0.02% और बनाने के लिए उपयोग करने से पहले आरटी पर समाधान रहते हैं।
  3. एच 2 ओ विआयनीकृत 50 μl में dsRNA या siRNA भंग और 50 मिमी सोडियम सल्फेट के 100 μl प्रति dsRNA / siRNA के 32 माइक्रोग्राम प्रति के 100 μl समाधान बनाने के लिए 100 मिमी सोडियम सल्फेट बफर में जोड़ें।
  4. DsRNA / siRNA के समाधान के लिए chitosan के समाधान के 100 μl जोड़ें और फिर एक मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में मिश्रण गर्मी। Chitosan के समाधान के 100 μl 50 मिमी सोडियम सल्फेट के 100 μl जोड़कर एक नियंत्रण स्थापित किया है और उसी प्रक्रिया का पालन करें।
  5. नैनोकणों के गठन की सुविधा के लिए आरटी पर उच्च गति vortexing द्वारा 30 सेकंड के लिए तुरंत समाधान मिलाएं।
  6. एक गोली दिखाई जानी चाहिए जो समय के बाद आरटी पर 10 मिनट के लिए 13,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र। एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। मच्छर भोजन तैयार करने के लिए यह प्रयोग करने से पहले आरटी पर ≈10 मिनट के लिए गोली हवा शुष्क।
  7. एमसतह पर तैरनेवाला में बने रहे कि dsRNA / siRNA के कुल राशि की गणना के लिए एक खाली के रूप में नियंत्रण (3.5 देखें) से सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला में dsRNA / siRNA के एकाग्रता easure। शुरुआती dsRNA / siRNA की मात्रा और नैनोकणों में फँस dsRNA / siRNA के प्रतिशत की गणना करने के लिए supernatants में शेष मात्रा के बीच अंतर का प्रयोग करें। इस लदान दक्षता सामान्य रूप से 90% से अधिक है।
  8. अधिक नैनोकणों की जरूरत है अगर एक ही प्रक्रिया दोहराएँ। तुरंत सूख नैनोकणों का प्रयोग करें। उपयोग करने से पहले कणों के कोल्ड स्टोरेज के प्रभाव का मूल्यांकन नहीं किया गया है।

4. मच्छर खाद्य आरएनए नैनोकणों दखल / Chitosan युक्त तैयारी

  1. विआयनीकृत पानी में, agarose पिघल (V / डब्ल्यू) एक 2% agarose समाधान के 1 मिलीलीटर तैयार करें, और उपयोग करने से पहले एक 55 सेल्सियस पानी के स्नान में पिघला agarose समाधान रहते हैं।
  2. मछली खाना गुच्छे मिश्रण (47% क्रूड प्रोटीन, मि। कच्चे तेल वसा 10%, मैक्स। कच्चे फाइबर 3%) एक पर है और सूखी खमीर(डब्ल्यू / डब्ल्यू) 1: 2 के अनुपात। एक मोर्टार और मूसल (नं 50 यूएसए मानक परीक्षण चलनी के माध्यम से प्रचलित) के साथ छोटे कणों का मिश्रण पीस लें। या तो तुरंत, रंग में भूरा होना चाहिए जो जमीन भोजन का प्रयोग करें, या कई हफ्तों के लिए चार सेल्सियस पर एक मोहरबंद कंटेनर में स्टोर।
  3. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में, एक दंर्तखोदनी के साथ धारा 3.7 से सूखे नैनोकणों के साथ जमीन भोजन के 6 मिलीग्राम मिश्रण।
  4. भोजन-nanoparticle के मिश्रण करने के लिए 2% पूर्व पिघल agarose जेल समाधान के 30 μl जोड़ें; एक दन्तखुदनी या pipet टिप का उपयोग करके तुरंत और अच्छी तरह से हलचल।
  5. तुरंत मच्छर लार्वा को खिलाने के लिए भोजन और नैनोकणों युक्त जेल का प्रयोग करें। जेल पूरी तरह से आरटी पर जम जाता है एक बार वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर जेल की दुकान और उपयोग अगले दिन, या बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर।

5. खाद्य आरएनए नैनोकणों दखल / Chitosan को रोकने के साथ मच्छरों का लार्वा को दूध पिलाने

  1. दूध पिलाने की ए gambiae मच्छर लार्वा:
    1. एक एसआई निकालेंएक दन्तखुदनी का उपयोग करते हुए और एक साफ रेजर ब्लेड या दांत लेने का उपयोग करते हुए छह बराबर स्लाइस में काट 1.5 मिलीलीटर ट्यूब से ngle जेल गोली।
    2. विआयनीकृत पानी की 100 मिलीलीटर युक्त 500 मिलीलीटर पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण 20 तीसरे instar लार्वा।
    3. पेट्री एक बार पकवान चार दिनों के लिए एक दिन के हिसाब से जेल गोली (बारीक छोटे टुकड़ों में कटा हुआ) का एक टुकड़ा जोड़कर मच्छर लार्वा फ़ीड। काफी आकार में कम या अगले दिन से पूरी तरह से अनुपस्थित किया जाना चाहिए जो गोली, पर लार्वा खिलाने का पालन सुनिश्चित करें। समय के बाद, मच्छरों देर चौथे instar लार्वा में विकसित होगा।
    4. प्रयोग के दौरान किसी भी दृश्य प्ररूपी परिवर्तन रिकार्ड। चार दिन की अवधि के अंत में धारा 6 में चर्चा के रूप में प्रतिलेख के स्तर और अन्य प्ररूपी परिवर्तन की जांच।
  2. दूध पिलाने की ए एजिप्टी मच्छर लार्वा:
    1. एक साफ रेजर ब्लेड या दन्तखुदनी का उपयोग करते हुए छह बराबर स्लाइस में जेल गोली काटें।
    2. अंडा सेने फाई के बाद 50 साल की उम्र सिंक्रनाइज़ 24 घंटा रखेंपानी विआयनीकृत ≈40 मिलीलीटर में एक पेट्री डिश में आरएसटी instar लार्वा।
    3. दिन के आराम के लिए एक जमीन मछली खाना गुच्छे और सूखी खमीर: फिर 2 की नियमित लार्वा भोजन के लिए वापस लार्वा हस्तांतरण, 4 घंटा / दिन के लिए पेट्री डिश प्रति लार्वा एक टुकड़ा फ़ीड। दैनिक चार लार्वा instars भर प्रक्रिया दोहराएँ।
    4. वांछित विकास समय बिंदुओं पर धारा 6 में चर्चा के रूप में प्रतिलेख के स्तर और अन्य प्ररूपी परिवर्तन की जांच।

जीन पछाड़ना 6. पुष्टि

  1. ए में QRT- पीसीआर द्वारा सापेक्ष प्रतिलेख मात्रा का ठहराव एजिप्टी और ए gambiae लार्वा।
    1. प्रदर्शन और 11,19,20 वर्णित है, या मानक प्रयोगशाला प्रक्रिया के अनुसार के रूप में प्रयोगात्मक लार्वा बनाम कम से कम 10 जमा नियंत्रण पर तीन जैविक प्रतिकृति के साथ QRT- पीसीआर assays के विश्लेषण। प्रतिनिधि परिणाम नीचे शामिल कर रहे हैं।
    2. एक विशेष ऊतक प्रकार / शरीर के अंग (यानी।, मस्तिष्क या एंटीना), perfo के विश्लेषण के लिएब्याज के ऊतकों को ठीक करने के लिए 6.1.1 निम्नलिखित विच्छेदन के रूप में वर्णित RM QRT- पीसीआर (उदाहरण के लिए, देखने के मैसूर एट अल। 21)।
  2. स्वस्थानी संकरण में से पछाड़ना की पुष्टि
    1. Digoxygenin लेबल antisense synthesize और मानक प्रयोगशाला अभ्यास करने के लिए या 26 के रूप में वर्णित अनुसार नियंत्रण riboprobes भावना।
    2. पहले से 11,20 वर्णित है और नीचे प्रतिनिधि परिणाम खंड में चर्चा के रूप में पछाड़ना की पुष्टि के लिए Haugen एट अल। 27 प्रोटोकॉल के अनुसार स्वस्थानी संकरण में निष्पादित करें।
  3. Immunohistochemistry द्वारा पछाड़ना की पुष्टि
    1. लक्षित जीन के प्रोटीन उत्पाद के खिलाफ एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, तो पहले से 28 के रूप में वर्णित, representati में उदाहरण के रूप में phenotype के विश्लेषण के लिए 20 पछाड़ना का सबसे बड़ा स्तर के साथ व्यक्तियों की पहचान की सुविधा है, जो immunohistochemistry के लिए प्रदर्शननीचे दिए गए परिणामों अनुभाग किया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ए gambiae:

Chitosan / dsRNA नैनोकणों कारण chitosan के एमिनो समूहों और dsRNA की फॉस्फेट समूहों के बीच electrostatic बातचीत करने के लिए बनते हैं। समाधान से dsRNA की कमी द्वारा मापा नैनोकणों में dsRNA समावेश की दक्षता में आमतौर पर 90% ऊपर है। परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी छवियों चलता है कि 100-200 एनएम (चित्रा 1) से लेकर व्यास में chitosan-dsRNA कण आकार के औसत से 140 एनएम,।

चित्र 1
Chitosan और दखल शाही सेना द्वारा चित्रा 1. nanoparticle के गठन। Chitosan / dsRNA नैनोकणों (ए) या ​​dsRNA (बी) के अलावा बिना chitosan के समाधान की परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी छवि। छवियों का आकार 1.0 माइक्रोन × 1.0 माइक्रोन था। स्केल बार = 250 एनएम।e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मानक लार्वा खाने के साथ संयुक्त और agarose में शामिल कर रहे हैं, जो इन कणों को खिलाने के सामान्य लार्वा विकास का समर्थन करता है। महत्वपूर्ण बात है, बाह्य त्वक स्तर व्युत्पन्न AgCHS1 टेप के विशिष्ट पछाड़ना के साथ ही आद्यमध्यांत्र-विशिष्ट AgCHS2 (चित्रा 2) dsRNA नैनोकणों की घूस के माध्यम से ऊपर ले लिया है कि प्रदर्शन, 19 संभव आद्यमध्यांत्र परे आरएनएआई शुरू की है। ≈40-60% पछाड़ना क्षमता (जैसे।, चित्रा 2) मनाया जाता है और टेप के बीच अलग-अलग हो गए थे।

चित्र 2
में dsRNA घूस के बाद काइटिन सिन्थेज़ 2 (AgCHS2) चित्रा 2. ट्रांसक्रिप्शन स्तरों <उन्हें> ए gambiae लार्वा। डी एस AgCHS2 या नियंत्रण डी एस GFP के साथ नैनोकणों पर खिलाया लार्वा में AgCHS2 के सापेक्ष mRNA स्तर। डाटा तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति से मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। बारों पर विभिन्न पत्र बनती टी परीक्षण (पी = 0.003) पर आधारित महत्वपूर्ण मतभेद का संकेत मिलता है।

AgCHS1 की पछाड़ना काफी चौथे instar लार्वा की कुल काइटिन सामग्री कम है और काइटिन संश्लेषण अवरोध करनेवाला कीटनाशक के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि हुई है, 19 diflubenzuron, AgCHS2 की पछाड़ना काफी सफेद calcofluor के प्रभाव में वृद्धि हुई है और चौथे instar में peritrophic मैट्रिक्स (प्रधानमंत्री) बाधित जो dithiothreitol लार्वा वृद्धि की मृत्यु दर 17 में जिसके परिणामस्वरूप (चित्रा 3)।

चित्र तीन
AgCHS2 ए पर नैनोकणों किया जाता gambiae peritrophic मैट्रिक्स (प्रधानमंत्री) पारगम्यता। Calcofluor सफेद या डीटीटी उपचार ए के प्रधानमंत्री बाधित आगे chitosan की घूस के माध्यम से AgCHS2 पछाड़ना द्वारा exuberated है जो gambiae लार्वा / dsRNA 19 नैनोकणों। बरकरार प्रधानमंत्री के साथ (ए) मच्छर। बाधित प्रधानमंत्री के साथ (बी) मच्छर, नीले dextran गैस्ट्रिक ceacae में लीक।

ए एजिप्टी:

Chitosan / siRNA नैनोकणों ए दौरान अक्षतंतु मार्गदर्शन जीन semaphorin-1A (sema1a) को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया एजिप्टी लार्वा विकास 20। Sema1a की पछाड़ना लार्वा दिमाग गधे की ≈60% में sema1a के स्तर को कम कर पता लगाया है जो स्वस्थानी संकरण में के माध्यम से पुष्टि की गईessed और पछाड़ना पशु दिमाग के ≈40% में sema1a अभिव्यक्ति का पता लगाने में विफल रही है (बी बनाम चित्रा 4C, पीले रंग की नोक स्पर्शतंतु पालि इंगित करता है)। (नियंत्रण-nanoparticle तंग आ जानवरों की तुलना में जमा पूरे जानवरों पर प्रदर्शन किया QRT- पीसीआर assays के इस तकनीक sema1a टेप में 32 ± 10% की कमी के परिणामस्वरूप पता चला कि चित्रा -4 ए, बनती टी परीक्षण के आधार पर पी <0.01, एन = 5, जहां एन जैविक प्रतिकृति की संख्या) है। लार्वा और पोटा संबंधी घ्राण फेनोटाइप का विश्लेषण करती दौरान महत्वपूर्ण पछाड़ना के साथ जानवरों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो विरोधी Sema1a एंटीबॉडी अभिव्यक्ति (डी 1 बनाम चित्रा 4E1), के नुकसान के सबूत के रूप में मस्तिष्क में पछाड़ना, पोटा संबंधी विकास के कम से कम 24 घंटे के माध्यम से बनाए। (1 टेबल में मात्रा) लार्वा और पोटा संबंधी स्पर्शतंतु पालि दोष sema1a पछाड़ना लार्वा और pupae में पाया गया (चित्रा 4E2, E3 के बनाम डी 2 बनाम चित्रा 4E2, दोनों संकेतों के ओवरले चित्रा 4D3, E3 में दिखाया जाता है)। तुलनात्मक phenotypes मनाया दोष या तो siRNA द्वारा लक्षित कर परोक्ष का परिणाम नहीं थे कि यह सुनिश्चित करने में मदद मिली है, जो दो अलग-अलग sema1a पछाड़ना siRNAs के साथ उत्पन्न किया गया। siRNAs के संयुक्त थे जब पछाड़ना के उच्चतम स्तर (अधिक जानकारी के लिए मैसूर एट अल। 20 देखें), पछाड़ना दक्षता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक रणनीति उत्पन्न किया गया।

चित्रा 4
चित्रा 4. Chitosan / siRNA ए के विकासशील घ्राण प्रणाली में sema1a की पछाड़ना प्रेरित एजिप्टी। QRT- पीसीआर (ए) और सीटू संकरण में (बी, सी) assays के लार्वा में sema1a की पछाड़ना की पुष्टि की siRNA 890 और siRNA नियंत्रण नैनोकणों बनाम 1198 chitosan / दखल शाही सेना नैनोकणों को लक्षित sema1a का एक मिश्रण खिलाया। Sema1a अभिव्यक्ति की हानि (D1-3 बनाम E1-3) विकृत कर रहे हैं कि ग्लोमेरुली में हुई। विवरण के लिए पाठ देखें। पृष्ठीय सभी पैनलों में ऊपर है। स्केल बार 25 माइक्रोन =। यह आंकड़ा मूल रूप से मैसूर एट अल 20 में दिखाई दिया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लार्वा Pupae
siRNA एन <मजबूत> wildtype अल दोष एन जंगली प्रकार अल दोष
नियंत्रण 69 69 (100%) 0 (0%) 68 68 (100%) 0 (0%)
sema1a केडी 77 42 (54.5%) 35 (44%) * 75 51 (68%) 24 (32%) *

Sema1a पछाड़ना निम्नलिखित स्पर्शतंतु पालि दोषों की तालिका 1. मात्रा। नियंत्रण के लिए प्राप्त परिणामों के एक संकलित सारांश siRNA बनाम sema1a पछाड़ना (केडी) siRNA 890 + दोनों लार्वा में प्रदर्शन आठ को दोहराने के प्रयोगों की कुल से 1198 chitosan के nanoparticle खिलाया जानवरों siRNA ( बाएं) और pupae (दाएं) दिखाया गया है। टोटल(एन) का आकलन व्यक्तियों और Antennal लोब (एएल) दोष (घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन को लक्षित दोष, दोषपूर्ण neuropil और ग्लोमेरुली गठन) बनाम जंगली प्रकार आकृति विज्ञान प्रदर्शित करने जानवरों की संख्या / प्रतिशत की संख्या संकेत कर रहे हैं। पछाड़ना सबसे गंभीर दोषों प्रदर्शित कि जानवरों (15 लार्वा और 10 pupae) के एक सबसेट में विरोधी Sema1a एंटीबॉडी धुंधला साथ immunohistochemically सत्यापित किया गया था (* के साथ चिह्नित)। नियंत्रण खिलाया जानवरों में Sema1a का स्तर काफ़ी बदल नहीं किया गया है, जबकि इस तरीके में मूल्यांकन सभी पछाड़ना जानवर, Sema1a के स्तर को कम कर दिया पाए गए। इस तालिका में मूल रूप से मैसूर एट अल 20 में दिखाई दिया।

एक दूसरी जांच में 21, chitosan / siRNA नैनोकणों घ्राण प्रणाली के विकास के दौरान एकल दिमाग प्रतिलेखन कारक (सिम) को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। पूरे जानवरों से विच्छेदित जमा दिमाग के साथ QRT- पीसीआर assays के सिम पछाड़ना दिमाग औसत एक 47% reducti पर था संकेत दिया किपर nanoparticle खिलाया जानवरों को नियंत्रित करने के लिए तुलना में सिम टेप में (पी = 0.005 बनती टी परीक्षण के आधार पर)। सम्मान के साथ सिम के स्तर में औसत एक 77% की कमी पर पता चला एंटीना के साथ तुलनीय assays के जानवर (पी = 0.002 बनती टी परीक्षण के आधार पर) पर नियंत्रण से सिंचित करने के लिए। ऊतकों और जानवरों के बीच पछाड़ना के स्तर में कुछ परिवर्तनशीलता के बावजूद, सिम टेप दो अलग पछाड़ना siRNAs (चित्रा 5B2, बी 3, सी 2 में से किसी के साथ इलाज के बाद पछाड़ना पशु दिमाग / एंटीना की ≈50% में स्वस्थानी संकरण में के माध्यम से पता नहीं थे, सी 3 बनाम बी 1, सी 1, 2 टेबल)। खमीर की ओर आकर्षित कर रहे थे कि व्यक्तियों को आकर्षित नहीं कर रहे थे कि जानवरों शून्य के स्कोर दिया गया है, जबकि एक के स्कोर से सम्मानित सिम 430 के लिए, औसत स्कोर या सिम रहे थे, जिसके दौरान खमीर व्यवहार assays में 718 पछाड़ना जानवरों एसआई थेदो को दोहराने के प्रयोगों में नियंत्रण खिलाया जानवरों की तुलना में gnificantly कम (चित्रा 5A; बनती टी परीक्षण के आधार पर पी <0.001)। दोषपूर्ण गंध ट्रैकिंग व्यवहार कम एंटीना में सिम के स्तर (चित्रा 5B2, बी 1 बनाम बी 3) और दिमाग (चित्रा 5C2 साथ सहसंबद्ध (चित्रा 5A), सी 3 सी 1 बनाम, पीले डॉट्स स्पर्शतंतु पालि की परिधि के निशान; तालिका देखें दो परिणामों की मात्रा का ठहराव के लिए)। एकाधिक दोष एंटीना और सिम पछाड़ना जानवरों के स्पर्शतंतु पालियों में पहचान की गई है (देखें मैसूर एट अल। 21 विवरण के लिए)। उदाहरण के लिए, सिम पछाड़ना लार्वा और pupae ORCO, घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (चित्रा 6) में सभी odorant रिसेप्टर्स के लिए सह रिसेप्टर लाचार की अभिव्यक्ति का अभाव है। कम ORCO प्रतिलेख के स्तर सिम 430 (से तंग आ चुके व्यक्तियों में पाया गया चित्रा 6A3, बी 3) या (चित्रा 6A4, बी 4) पछाड़ना (केडी) chitosan / siRNA नैनोकणों (चित्रा 6A1, बी 1 में जंगली प्रकार के पशुओं के लिए तुलना और चित्रा 6A2 में chitosan / siRNA nanoparticle खिलाया जानवरों, बी 2) को नियंत्रित 718 सिम। L4 लार्वा (चित्रा 6A1-ए 4) में मनाया ORCO अभिव्यक्ति phenotype के नुकसान पोटा संबंधी गठन (चित्रा 6B1-बी 4) के बाद कम से कम 24 घंटों के माध्यम से बनाए।

चित्रा 5
चित्रा 5 सिम पछाड़ना लार्वा शो दोषपूर्ण गंध-attractant के व्यवहार। स्वस्थानी संकरण में एंटीना में सिम शाही सेना के कम स्तर से पता चला (बी 2, बी 3) और सिम के दिमाग (सी 2, सी 3) 430 और 7 सिमखमीर odorant attractant के (ए) के लिए प्रतिक्रिया करने में विफल रहा है, जो 18 पछाड़ना जानवर (करने के लिए तुलना, बी 1 में नियंत्रण खिलाया सी 1),। विवरण के लिए पाठ देखें। एंटीना के समीपस्थ सिरों बी 1-बी 3 में ऊपर की ओर उन्मुख होते हैं। पृष्ठीय सी 1-सी 3 में ऊपर की ओर उन्मुख है। स्केल बार 25 माइक्रोन =। यह आंकड़ा मूल रूप से मैसूर एट अल 21 में दिखाई दिया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
विकासशील ए में ORCO अभिव्यक्ति की चित्रा 6 घटाने सिम की पछाड़ना निम्नलिखित एजिप्टी एंटीना। ORCO प्रतिलेख के कम स्तर व्यक्तियों फ़े में पाया गयासिम 430 (ए 3, बी 3) या 718 सिम के साथ घ (ए 4, बी 4) पछाड़ना (केडी) chitosan / siRNA नैनोकणों (बी 1, A1 में जंगली प्रकार के पशुओं के लिए तुलना और A2 में chitosan / siRNA nanoparticle खिलाया जानवरों, बी 2 नियंत्रण)। विवरण के लिए पाठ देखें। स्केल बार 25 माइक्रोन =। यह आंकड़ा मैसूर एट अल 21 में प्रकाशित छवियों से संकलित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकर्षित किया आकर्षित नहीं
siRNA एन # पशु सामानय मध्यम अमान्य # पशु सामानय मध्यम अमान्य
नियंत्रण 195 196 (100%) 196 (100%) 0 0 0 0 0 0
430 केडी सिम 176 63 (35%) 48 (76%) 15 (24%) 0 113 (64%) 20 (18%) 12 (11%) 81 (71%)
718 केडी सिम 177 66 (37%) 44 (66%) 22 (34%) 0 111 (63%) 20 (18%) 9 (8%) 82 (74%)

तालिका 2 स्तरसिम की एक खमीर व्यवहार परख में लार्वा प्रदर्शन के साथ सहसंबंधी। चार खमीर odorant attractant में प्राप्त परिणामों के एक संकलित सारांश प्रयोगों को दोहराने दिखाया गया है। जानवर (एन) की कुल संख्या इन व्यवहार assays में परीक्षण किया गया है कि व्यक्ति के लार्वा की संख्या को इंगित करता है। व्यक्तिगत लार्वा की संख्या को आकर्षित किया गया है कि (# जानवरों) (बाएं; खमीर गोली छुआ और एक के स्कोर से सम्मानित किया गया है कि जानवरों) (; खमीर गोली छुआ तक नहीं था कि जानवरों और शून्य के स्कोर प्राप्त दाएं) या नहीं आकर्षित किया प्रत्येक शर्त के तहत (नियंत्रण, 430 केडी सिम, या 718 केडी chitosan के सिम / siRNA nanoparticle खिलाया) दिखाए जाते हैं, और कुल जानवरों का प्रतिशत कच्चे संख्या निम्नलिखित शामिल किए गए हैं। सिम की पछाड़ना दिमाग में स्वस्थानी संकरण में के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था और जानवरों के एंटीना (बाएं) को आकर्षित या खमीर (सही) की ओर आकर्षित नहीं।कच्चे संख्या / (सिम प्रतिलेख के स्तर wildtype करने के लिए तुलनीय) सामान्य के साथ व्यक्तियों का प्रतिशत, अशक्त (कोई नमूदार सिम प्रतिलेख), या मध्यम (कम नहीं बल्कि जंगली प्रकार) सिम स्तरों संकेत कर रहे हैं। सिम की हानि खमीर के लिए आकर्षण की कमी के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध। इस तालिका में मूल रूप से मैसूर एट अल 21 में दिखाई दिया।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस के साथ साथ वर्णित chitosan / दखल शाही सेना nanoparticle कार्यप्रणाली को प्रभावी ढंग से ए में लार्वा विकास के दौरान जीन लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है gambiae (आंकड़े 2, 3) और ए एजिप्टी (आंकड़े 4, 5, 6, टेबल्स 1, 2)। Chitosan नैनोकणों के साथ साथ वर्णित प्रतिनिधि परिणाम इसका सबूत के रूप में मच्छरों में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, जो दोनों के लंबे dsRNA या siRNA, किसी के साथ तैयार किया जा सकता है। DsRNA का संश्लेषण siRNA की खरीद की तुलना में कम खर्चीला है, लेकिन अधिक श्रम गहन है। Chitosan / siRNA प्रयोग किया जाता है, तो phenotypes के पर्दाफाश फेनोटाइप परोक्ष लक्षित कर की वजह से नहीं है कि बेहतर आश्वासन के लिए अनुमति देता है, कई siRNAs के साथ की पुष्टि की जा सकती है। इसके अलावा, siRNAs के सामूहिक रूप से वाणिज्यिक उत्पादन बेहतर क्षेत्र के लिए प्रजाति विशिष्ट मच्छर नियंत्रण के लिए शाही सेना मुंह बंद दखल / chitosan के विस्तार की सुविधा हो सकती। बेशक यह इच्छा obsta पर काबू पाने की आवश्यकता होती हैऐसे लागत और वितरण के रूप में cles।

हम इस प्रोटोकॉल के साथ अच्छी सफलता मिली है हालांकि, के तरीके में प्रत्येक जीन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस कारण से, हम एक नई परियोजना की शुरुआत में, शायद एक siRNA और एक लंबे dsRNA कई siRNAs परीक्षण, या सलाह देते हैं। Phenotypes के पहचान की है और कम से कम दो अलग siRNAs के ब्याज की एक जीन को इसी के साथ इस बात की पुष्टि हो जाने के बाद, यह फेनोटाइप अंतर्वेधन को बढ़ाने के लिए इन siRNAs (चित्रा 4) के साथ गठबंधन करने के लिए उपयोगी हो सकता है। समय और भी शाही सेना खिला समय हस्तक्षेप chitosan की अवधि / प्रत्येक अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ए इस के साथ साथ वर्णित के रूप में शाही सेना खाद्य दखल / केवल chitosan के साथ तंग आ गया जब gambiae पनपे। हालांकि, प्रयोगों में हम तारीख, ए करने के लिए प्रदर्शन किया एजिप्टी, पूरक पोषण के बिना अच्छी तरह से हम शाही सेना खिला दखल / chitosan के 4 घंटे बाद सामान्य भोजन की एक खुराक के लिए उन्हें स्थानांतरित से दूर किया है एक समस्या प्रदर्शन नहीं किया है। / Chitosan के साथ प्रयोग दखलएक अलग भोजन सब्सट्रेट में शाही सेना के वितरण, हम अभी तक का प्रयास नहीं किया है, जो इस समस्या को दरकिनार कर सकते हैं। हम कई दिनों के पाठ्यक्रम पर 4 घंटे दैनिक feedings के पछाड़ना और पर्याप्त पोषण के बीच एक अच्छा संतुलन है कि परिणाम में पाया है, लेकिन खिलाने की अवधि के संशोधन के आगे के रूप में वांछित चलाया जा सकता है। इसके अलावा, chitosan / दखल शाही सेना nanoparticle खिला / निरंतर शुरू की है जिसमें लार्वा instar जीन समारोह, इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ की जांच की है, जिसमें महत्वपूर्ण विकास की अवधि के आधार पर एक प्रयोग के लिए आधार पर किया जा सकता है।

पछाड़ना का सत्यापन महत्वपूर्ण जरूर है, लेकिन यह भी समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है। इस कारण से, यह पछाड़ना दक्षता का आकलन किया जा रहा है के रूप में ब्याज की phenotypes उत्पन्न किया जा रहा है अगर एक साथ जांच करने के लिए उपयोगी हो सकता है। QRT- पीसीआर सत्यापन प्रयोगों के लिए, यह प्राइमरों और पीसीआर स्थितियों अनुकूलित कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह जानवरों विकासात्मक हैं कि महत्वपूर्ण हैकुछ टेप की अभिव्यक्ति बहुत विकास के दौरान गतिशील और कारण circadian लय 29 के लिए किया जा सकता है, के रूप में प्रयोग की शुरुआत में सिंक्रनाइज़। इस तकनीक को स्पष्ट रूप से आंत से परे पछाड़ना उत्पन्न करता है, जबकि इसके अलावा, हम केवल इस तकनीक कारगर है, जिसके लिए ऊतकों का आकलन करने के लिए शुरुआत कर रहे हैं, और इस प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकते हैं। इसलिए यह स्वस्थानी संकरण में के माध्यम से QRT- पीसीआर assays के लिए या पूरी जानवरों से ब्याज के ऊतकों विदारक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो विशेष रूप से ऊतकों, (आंकड़े 4-6) 20,21 और immunohistochemistry (चित्रा 4) 20 में पछाड़ना को मापने के लिए उपयोगी हो जाएगा assays के (इन प्रोटोकॉल समस्या निवारण के लिए क्रमश: Haugen एट अल। 27 और Clemons एट अल।, 28 देखें)। पछाड़ना व्यक्ति से व्यक्ति भिन्न होता है के बाद से, यह (figu पछाड़ना के स्तर के साथ संयोजन में phenotypes के आकलन के लिए डबल-लेबलिंग assays के प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी हैबहुत phenotype के लक्षण वर्णन की सुविधा है, जो 4) 20 पुनः। व्यवहार के अध्ययन के लिए, अलग-अलग जानवरों में पछाड़ना स्तर उनके व्यवहार प्रदर्शन (तालिका 2) 20,21 के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है।

ए शाही सेना की डिलीवरी दखल chitosan की मध्यस्थता निम्नलिखित एजिप्टी लार्वा, कम जीन अभिव्यक्ति पोटा संबंधी विकास के 24 एच (आंकड़े 4, 6) 20,21 में पता चला है। जीन की अभिव्यक्ति के स्तर को अभी तक विकास के इस बिंदु से परे एक विस्तृत ढंग से मूल्यांकन नहीं किया गया है, जीन अभिव्यक्ति के कम स्तर दोनों 48 और 72 एच ए में पाया गया है एजिप्टी pupae (के.एम., अप्रकाशित)। यह ए के कई चरणों में पछाड़ना के स्तर के बारे में अधिक विस्तृत विश्लेषण को आगे बढ़ाने के लिए उपयोगी होगा एजिप्टी पोटा संबंधी विकास के लिए और भी ए का आकलन करने के लिए gambiae pupae। यह भी पछाड़ना वयस्कों में बनी रहती है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए दिलचस्प हो सकता है और में nanoparticle की मध्यस्थता का पता लगाने के लिएवयस्क मच्छरों के लिए शाही सेना वितरण रणनीतियों terfering।

दृष्टिकोण को लक्षित साइट विशेष nuclease जीन हाल ही में ए करने के लिए शुरू किए गए थे एजिप्टी और ए gambiae और मच्छरों और अन्य गैर आनुवंशिक मॉडल जीवों 30,31 में लक्षित, पैतृक म्यूटेशन की पीढ़ी की अनुमति के कर रहे हैं। इन तरीकों का उपयोग समारोह phenotype के अधिक समान नुकसान परमिट हालांकि विश्लेषण करती है, ब्याज की म्यूटेशन के लिए स्क्रीनिंग आरएनएआई दृष्टिकोण पर एक फायदा, अभी भी काफी समय लगता है और श्रम प्रधान है। समारोह के अध्ययन के आरएनएआई नुकसान केवल जंगली प्रकार उपभेदों के रखरखाव की आवश्यकता है, हालांकि इसके अलावा, उत्परिवर्ती मच्छर उपभेदों अलग-अलग पाला जाना चाहिए। पीछे हटने का घातक या वयस्क बाँझ म्यूटेशन के रखरखाव वर्तमान में मच्छरों में चिह्नित balancers की मौजूदा कमी को देखते हुए चुनौती दे रहा है। साइट-विशिष्ट दृष्टिकोण को लक्षित nuclease जीन जल्दी से लोकप्रिय हो रहा है, जबकि इस प्रकार, chitosan / इष्टतम हो सकता है लक्षित कर आरएनए हस्तक्षेपमच्छर उपभेदों बनाए रखने के लिए सुसज्जित नहीं प्रयोगशालाओं के लिए और मामलों में चुनाव के लिए जो विकास के दौरान जीन समारोह के नुकसान तनाव के अस्तित्व के साथ असंगत है।

हमारे निष्कर्ष के आधार पर हम chitosan / दखल शाही सेना ए के विकास के दौरान कई अलग अलग जीनों के पछाड़ना के लिए मोटे तौर पर इस्तेमाल किया जा सकता है आशा करते हैं कि gambiae, ए एजिप्टी, साथ ही अन्य कीड़े, और संभवतः अन्य गैर आनुवंशिक मॉडल जीवों। Chitosan के साथ सफल जीन मुंह बंद / दखल शाही सेना Penaeus monodon (झींगा) 32 सहित अन्य सन्धिपाद प्रजातियों में सूचना दी गई है। एक ताजा अध्ययन में नैनोकणों dsRNA के तेज और सुविधाजनक बनाने के इस प्रकार कृषि कीटों को लक्षित करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करने के लिए क्षमता को रेखांकित करता है जो एशियाई cornborer 33, में dsRNA का सीधा खिलाने के साथ तुलना में पछाड़ना दक्षता बढ़ाने कि प्रदर्शन किया। मानव में चिकित्सा विज्ञान के रूप में siRNA-नैनोकणों के संभावित उपयोग एक बड़ा सौदा ओ आकर्षित कर रहा हैचिकित्सा समुदाय में च ब्याज। Giljohann एट अल। 34 dsRNA मुक्त करने के लिए एक तुलना में लंबे समय तक आधा जीवन छह गुना है और आसानी से कोशिकाओं में प्रवेश जो polyvalent आरएनए सोने nanoparticle conjugates, के संश्लेषण और लक्षण वर्णन किया। डेविस एट अल। 35 ठोस ट्यूमर के साथ रोगियों के लिए एक nanoparticle वितरण प्रणाली का उपयोग कर siRNAs की प्रणालीगत प्रशासन से जुड़े पहले मानव नैदानिक ​​परीक्षण, और हाल ही में 36 की समीक्षा की गई chitosan / siRNA चिकित्सा विज्ञान के उपयोग की संभावना का वर्णन किया। इस प्रकार, chitosan / प्रौद्योगिकी को लक्षित आरएनए जीन दखल व्यापक अनुप्रयोगों के लिए क्षमता के साथ एक मूल्यवान प्रयोगशाला तकनीक है। भविष्य के अनुसंधान इस तकनीक के लिए अतिरिक्त अनुप्रयोगों का पता लगाने जाएगा। इसके अलावा, chitosan और अन्य पॉलिमर, अनुसंधान के एक सक्रिय क्षेत्र के रासायनिक संशोधन, हस्तक्षेप शाही सेना वितरण की दक्षता बढ़ाने के लिए या विशिष्ट ऊतकों 37 को लक्षित वितरण अनुमति दे सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.02 ml pipetteman Rainin PR20 for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman Rainin PR200 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-120 for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman Rainin PR1000 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-046 for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5 TEKnova S0299 to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade BDH VWR BDH3092-500MLP to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade MP Biomedicals LLC. 800668 to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge Eppendorf AG 5415D to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells Sigma-Aldrich C3646-25G to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast Universal Food Corp NA to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool German Cancer Research Center NA for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food Wardley Goldfish FLAKE FOOD to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath Thermo Scientific 51221048 to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice not applicable not applicable for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Name Company Catalog Number Comments
Ice bucket Fisher Scientific 02-591-44 for storage of ice used during the procedure
liver powder MP Biomedicals LLC. 900396 to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven A variety of vendors not applicable to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm) Fischer Scientific 875713 interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter Mettler Toledo S220 for preparation of buffers
Razor blade Fischer Scientific 12-640 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA Thermo Scientific/Dharmacon custom for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) BDH/distributed by VWR VWR BDH0302-500G to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer VWR 61066-046 to measure the water bath temperature
Tooth picks VWR 470146-908 for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer A variety of vendors not applicable for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer Fischer Scientific 02-216-108 for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper Fischer Scientific NC9798735 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
  3. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
  4. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
  5. Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
  6. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
  10. Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  11. Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
  12. Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
  13. Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
  14. Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
  15. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
  16. Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
  17. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
  18. Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  20. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
  21. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
  22. Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
  23. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  24. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  25. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
  26. Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
  27. Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  28. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
  29. Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
  30. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  31. Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
  32. Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
  33. He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
  34. Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
  35. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
  36. Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
  37. Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).

Tags

आण्विक जीवविज्ञान अंक 97 वेक्टर जीव विज्ञान आरएनए हस्तक्षेप, DsRNA siRNA पछाड़ना घूस मच्छर लार्वा विकास रोग
रोगवाहक मच्छरों का लार्वा में chitosan / दखल शाही सेना nanoparticle के मध्यस्थता जीन मुंह बंद
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., … More

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., Michel, K., Severson, D. W., Zhu, K. Y., Duman-Scheel, M. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523, doi:10.3791/52523 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter