Summary
この記事では、生後1-8マウスまたはラット仔に断続的低酸素症の短い期間を管理するための方法を説明します。このアプローチは、効果的に低酸素暴露の30分以内に収穫される培養神経前駆細胞の「影響をプライミング」強固な組織レベルを誘発します。
Introduction
この方法の目的は、再現性と効果的に新生児の齧歯類に全身の低下周囲の酸素の断続的な発作を提供することです。幹細胞生物学を操作するために、断続的低酸素症（IH）を使用するための理論的根拠は、増殖培地のO 2含有量が変更されたインビトロ細胞培養実験における由来します。具体的には、20％のO 2、3％O中の幹/前駆細胞集団の細胞増殖の増加は 2の結果の拡張された培養物の「標準的な」条件と比較した場合、アポトーシスの減少およびニューロン収量1,2を増加させました。
このグループは、全身IHの投与と豊富な経験を持っており、呼吸可塑3-7に IHの役割について鋭意検討しました。この作品、および慢性IHはげっ歯類CNS 8-10に神経新生を増加させることを最近の知見は、in vivoでの急性の探査のための基礎を形成プレコンディショニング刺激として低酸素状態（すなわち、組織の収穫に先立って）神経幹/前駆細胞（NPCの）11のその後の培養に。仔マウスは、急性間欠性低酸素症（AIH）の短い（<1時間）の期間にさらされたときに驚くべき、脳室下帯（SVZ）から採取した細胞はかなりの神経球または接着単層細胞のような拡張のための容量を増加しました。 AIHプロトコルは、「ニューロンの運命」転写因子（Pax6の）の発現増加と関連していました。
従って、 インビボでの AIHプロトコルは、「プライム」のNPC培養前に手段を提供することができます。例えば、このアプローチのアプリケーションは、負傷した中枢神経系に移植前に細胞集団を拡大し、または単に以前のin vitro実験に培養細胞の神経分化を増加させる含めることができます。さらに、これは任意の、全身送達であるため、臓器、組織または細胞は、同様の研究のための候補です。したがって、記述されたようなプロトコルは、小型哺乳類で断続的な酸素操作に関する研究の広い範囲に適用できる可能性です。
このアプローチにはいくつかの利点があります。他の公開作品では、新生児を治療する前に、長期投与のために以下の取り扱いを可能にする低気圧チャンバ内のダム、とごみとして処理され、治療の9時の母体の接触を維持しました。現在のアプローチは、繁殖の女性、または各実験ごとに異なるダムの使用に繰り返し治療をバイパスします。このプロトコルはまた、正確なゴミが一致したと年齢をマッチさせた新生児の研究を可能にします。代表的なデータは、このプロトコルの他のキーの強度、AIHとすなわち迅速性を実証し、配信として、神経幹細胞生物学における強力かつ一貫性のある生物学的応答を誘発します。これは、組織や細胞レベルのbiologiを引き出すために、このプロトコルのための先例を確立細胞生物学を変えるCAL変更。
このレポートではAIHにげっ歯類の子犬を露出するだけでなく、ニューロスフェアとして増殖SVZ細胞の集団の分析に使用する詳細な手順を概説します。
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Protocol
注：このプロトコルのすべての動物の手順は、フロリダ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）の承認を得て実施し、「実験動物の管理と使用に関する指針」に準拠しているされています。
1.基本実験は、断続的低酸素症の管理前に設定
- 他の実験目的5,13,14のための大人の齧歯類とほぼ同じ方法で、全身マウスプレチスモグラフ室を使用して、異なるガス混合物への子犬12を公開します。チャンバは3-4仔マウスまたは1-2仔ラットを収容するために十分なサイズである4インチ径（容積= 450 ml）を、有しています。ここで、AIHプロトコルは、生後1-8（P1〜P8）歳の新生児に配信されます。
- 21％でチャンバーの酸素化を維持し、21％、「ベースライン」ガスを送達するために圧縮空気のガスタンクを使用してください。 「相対的な低酸素状態」を達成するために、10％酸素/ 90％窒素ガスのタンクを使用します。
NOTE：プラスチックチューブ（3/16 "直径）は、流量計にガスタンクを接続しています。このように、流量計への入力は、ベースラインと低酸素気流のために一本のチューブそれぞれ構成されています。 - 次のようにガス配管を構成します。
- 各チャンバーに1 L /分の流れを可能にするバイアス流調整器、流量計からのプラスチックチューブ（1/8 "直径）を実行する（ すなわち 、4 L / minで4チャンバが使用される場合）。
- 容積脈波室にバイアス流量調整からプラスチック管（直径1/8 "）を実行します。各チャンバに1 L /分の空気流は、ガス交換は、生理学的および行動の観察に基づいて、動物に、非ストレス誘導されたものとみなさされる所定の流量です。
- 何のガス流が使用されていない、またはプロトコル中の脈波検査室のうち、他のチャンバに逃げるないようにキャップ付き室にバイアス流ユニットへとからすべての未使用の接続およびすべての未使用の開口部をシール。
- （室を置き、S）37℃に平衡化し、または体温を可能にするためにチャンバ内に動物を入れする前にインキュベーター。
断続的低酸素症のためのサイクルタイムの2キャリブレーション
- 、空気タンクと流量計との間で、すべてのチューブを検査し、適切な接続用計器とバイアス流ユニット、およびバイアス流ユニットとプレチスモグラフィーチャンバー（複数可）を流します。 例えば、使用されていない未使用のバイアス流ユニットのうちラインおよび任意のチャンバ開口部をチェック：すべての説明ラインと閉鎖の段階的チェックして、接続を確認し、手順1で説明したように接続が設定されています。
- 手持ちO 2メートルで、周囲O 2センサを接続して、容積脈波室蓋にセンサーを取り付けます。
- 両方のガスタンクを開き、ガスのオフサイクルの流れをクランプするプラスチック製のチューブで絶縁外科手術、長い取っ手止血のペアを1つ取り付けます。この方法では、一度に一つのガスタンク室あたり1リットル/分のガス流を供給しています。 「低酸素」ガス混合物をチャンバに供給される一方で、「ベースライン」のガス混合物をクランプ、およびその逆。
- 10％の目標レベルに到達し、21％に戻ることチャンバーO 2に必要な時間を記録します。その後のプロトコルの配信のための記録された時間を利用しています。
急性間欠性低酸素症の3管理
- ステップ2.1で説明したように、すべてのチューブとの接続を点検します。
- 脈波検査室（複数可）に新生児を置き、チャンバーベースに容積脈波室の蓋を収容します。未使用室接続の適切なOリングシールにシールであるだけでなく、閉鎖を確認してください。これらの手順は、ガス混合物の適切な配送を確保するために重要です。
- 子犬を保持室は37℃のインキュベーターに扱われることを置き、ドアを閉めます。室前のプロトコルを開始する37℃に平衡化することを許可します。 incubatで37℃で対照動物を維持または室内空気の酸素で。
- 両方のガスタンクを開き、ガスのオフサイクルの流れをクランプするプラスチック製のチューブで絶縁外科手術、長い取っ手止血のペアを1つ使用します。この方法では、一度に一つのガスタンク室あたり1リットル/分のガス流を提供しています。
- 正確に時間サイクルにハンドヘルドタイマーを使用し、したがって、チャンバへのガス流の交互に得られた、チューブ間の止血を切り替える時刻を示します。
- 2ステップ、20サイクルプロトコルのすべてのステップをオフにマークするために、図1に提供されるものなどの処理ログを使用して、各サイクルの完了を記録します。
- 動物は指定範囲（37°Cになるインキュベーターの設定である33〜35°C）に維持されることを保証するために、サイクルごとの変更のインキュベーターの温度を監視します。
- 密接にこのような発声、レベルの変化などの動物が見える苦痛なしでサイクルに耐えることを確認するために、プロトコル全体子犬の活動を監視四肢活性またはローリング。
脳室下帯から幹/前駆細胞の単離および培養4
注：コントロールに比べAIH次ニューロスフェア形成の変化は、組織や細胞レベルの変化を誘発するこのプロトコルの有効性を示すエンドポイントの例です。
- セルを形成するニューロスフェアを単離するために、AIHが完了した直後にチャンバーからマウスまたはラット仔を削除します。プロトコル終端の30分以内にIACUCプロトコルに従って動物を生け贄に捧げます。
- 以前の方法の章15,16と独立したビデオプロトコル8に発表されたように、SVZの組織を採取する神経球の文化に置き、標準の通路及びデリバティブニューロスフェアの展開を行っています。
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Representative Results
過去のデータに基づいて、初期の実験は、1分間のサイクル長を使用して行きました。上記のステップ2で実行される後続のキャリブレーションに基づいて、それは21％のベースラインに戻るには、同様の時間を要したこと、チャンバー内のO 2レベルは1分後に低酸素症のフラッシングで13％であったことを決定しました。しかし、2分間のサイクルを10％の酸素と、「ベースライン」サイクルの間に21％のリターンを達成するために、両方のに十分でした。続いて、2分のサイクルの長さが使用されてきました。プロトコルの継続時間は、ベースラインおよび低酸素（80分、全体の処理時間）との間で交互に20サイクルからなりました。 20サイクルの持続時間が原因で、このようなサイクル期間は、呼吸アウトカム指標11の変化を誘発するのに十分であることを示す以前の作品に選ばれました。説明（ 図2）の設定を使用して、AIHを施した新生児は、明らかな有害事象がなかったと80の間に痛みや不快感を示唆する行動を示さありませんでした分プロトコル。具体的には、目に見える無呼吸は、過度の手足や頭の動き、または発声を認められませんでした。 AIH後、脳室下帯由来神経幹細胞/前駆細胞集団は、14日間のニューロスフェアとして培養（および接着単層集団として、データは示していない）は、各構成球内で増加拡張を実証、直径がほぼ2倍の増加を示す（ 図3）。次の許容条件に播種された細胞は、（分裂促進因子の非存在下、すなわち）酸素正常状態から採取された細胞と比較して、より広範囲の神経分化を示したかなり多くのβ-3陽性細胞（45％<10％>の増加）を得治療（コントロール）の仔（ 図4）。
図1.この急性のIH記録シートは、動物を文書化するために使用されますそして、実験の詳細は、開始とIHプロトコルの完了後に前のチェックリストを提供し、すべて完了したサイクルを正確に集計するための追跡文書として役立ちます。
図2.断続的低酸素症は、新生児げっ歯類のために設定します。（A）インキュベーターを37℃で環境を維持します。プレチスモグラフィーチャンバーをインキュベーター内で、再度室扉半開き（B）に示されています。 （C）右、各チャンバーのために1リットル/分に調整流量計。ガス流は、任意の接続された室（インキュベータ内で、左）にバイアス流ユニットスプリッタ部（中心）を介して導かれます。 （D）は、ベースラインの止血剤コントロール（赤テープ）および低酸素（黄色テープ）の入力ライン。 ANK ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3の制御神経球（A）は、AIHのニューロスフェア（B）よりも小さな直径を示します。画像は10X客観的、スケールバー=100μmと撮影。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.コントロールの神経球（A）は、AIHのニューロスフェア（B）よりも少ないβ-3-チューブリン陽性神経芽細胞を示しています。画像は20X客観的、スケールバー=50μmの時に撮影しました。G "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
