Abstract
Existem muitos modelos diferentes de animais disponíveis para estudar a patogênese de doenças humanas inflamatórias intestinais (DII), cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. Descrevemos aqui um modelo de colite experimental que é iniciada por transferência adoptiva de células de baço singeneicas CD4 + CD45RB high T em ratinhos deficientes em receptores de células T e B. A população de células T CD4 + elevada CD45RB que consiste em grande parte de células efectoras naive é capaz de induzir a inflamação intestinal crónica, assemelhando-se intimamente os aspectos chave da DII humana. Este método pode ser manipulado para estudar os aspectos do aparecimento e progressão da doença. Além disso, ele pode ser utilizado para estudar a função de inata e adaptativa, e as populações de células imunitárias reguladoras, e o papel da exposição ambiental, ou seja, a microbiota, na inflamação intestinal. Neste artigo, ilustram a metodologia para a indução de colite com um protocolo passo-a-passo. Este includes um vídeo de demonstração de aspectos técnicos essenciais necessários para desenvolver com sucesso este modelo murino de colite experimental para fins de pesquisa.
Protocol
NOTA: Certifique-se que todos os protocolos de animais são aprovados por e em conformidade com Institutional Animal Care e do Comitê Use regulamentos (IACUC) e no Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para a Conservação e Uso de Animais de Laboratório. Camundongos doadores podem ter sexo masculino ou feminino, mas ratos destinatário devem ser do sexo masculino. Se os destinatários do sexo feminino devem ser utilizados, os camundongos doadores têm que ser fêmeas 5. Manter colónias usando, roupa de cama não estéril normal e água não acidificado, uma vez que estes podem causar impacto na microbiota intestinal, e, portanto, o fenótipo dos ratinhos colite 5,6.
1. Preparação Experimental
- Use mídia e buffers geladas. Mantenha as células no gelo durante todo o experimento.
- Realizar o experimento na capa de risco biológico estéril usando técnica estéril.
2. Isolamento de células T do baço
- Sacrificá camundongo doador / mice em CO 2 câmara seguido por dislocatio cervicaln. Spray de abdômen com etanol 70%.
- Faça uma incisão horizontal no abdômen e descascar a pele para expor peritônio. Segure peritônio longe dos órgãos internos com a pinça e fazer uma incisão no peritônio abdominal esquerda para expor e extirpar o baço.
- Inserir o baço em 10 ml de Meios completa em uma placa de Petri. Retire e elimine o excesso de tecido do baço.
- Use duas lâminas de vidro esterilizados para esmagar e provocar uma separação baço em suspensão de uma única célula. Suspensão de células Filtrar através de um filtro de 70 mm em um tubo de 50 ml e lavar filtro com 5 ml de Meio Completo. Coloque até 5 baços em um tubo de 50 ml cônico.
- Centrifugar células a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
- Suavemente ressuspender as células em 5 ml por baço de um tampão de lise, para lisar as células vermelhas do sangue durante 10 min à temperatura ambiente. Adicionar um volume igual de meio completo (5 ml por baço) para o tubo.
- Volte a suspender suavemente as células em 10 ml de Etiquetagem Buffer.
- Contagem de células por exclusão de azul de tripano.
- Retirar 20 l de suspensão de células e adicionar 180 mL de azul tripano para um tubo de microcentrífuga e misture bem. Após 5 min, adicionar 10 ul de células e contagem em hemocitómetro células não-azul sob o microscópio rotulados. Determinar o número total de células viáveis. Descarte de células / trypan azul mix.
- Centrifugar células em 10 ml de Etiquetagem tampão a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
3. O enriquecimento de células T CD4 +
NOTA: Siga as instruções do fabricante para produtos específicos utilizados nesta seção.
- Suavemente ressuspender as células a uma suspensão de uma única célula de 20 x 10 6 células / ml em Etiqueta frioing Buffer.
- Adicionar 5 mL por 1 x 10 6 células de anticorpos de enriquecimento de células T CD4 bioestanhados. Incubar as células em gelo durante 15 min.
- Adicionar 10x volume de Etiquetagem Buffer. Centrifugar células a 450 × g por 7 min. Aspirar cuidadosamente todo o sobrenadante usando sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
- Absolutamente vortex partículas magnéticas de estreptavidina conjugada. Adiciona-se 5 ul de partículas por 1 x 10 6 células.
- Misture bem, mas com cuidado. Mantenha a mistura a 6-12 ° C durante 30 min.
- Adicionar Etiquetagem Tampão a uma concentração de 20-80 x 10 6 células / ml. Transferir-se para 1,0 ml de células marcadas por 12 x 75 mm Tubo de ensaio de fundo redondo (referido como o "tubo-fracção positiva").
- Coloque cada tubo fração positivo no ímã para 6-8 min.
- Com os tubos de fração positiva ainda no ímã, transferir cuidadosamente sobrenadante do tubo-fração positiva com Pasteur de vidro pipeta para uma nova estéreis tubo de 50 ml (referred como a "fracção enriquecida"). Esta fração enriquecida contém células T CD4 +. Tenha cuidado para não perturbar as células marcadas atraídos pelo ímã.
- Suspenda as células deixaram nos tubos-fração positiva no mesmo volume de Etiquetagem tampão como no passo 3,6 por pipetagem cima e para baixo vigorosamente. Coloque tube-fração positiva para trás em ímã para 6-8 min.
- Com tubos de fração positiva ainda no ímã, transferir cuidadosamente sobrenadante (fração enriquecida, CD4 +) a partir de tubo-fração positiva com vidro Pasteur pipeta para estéril tubo de 50 ml a partir do passo 3.8, sem perturbar as células unidas a ímã.
- Repita os passos 3,9-3,10 para aumentar o rendimento de células CD4 + T obtidas. Continuar protocolo utilizando fracção enriquecida (células CD4 +).
4. Rotulagem e Classificando Cells 7
- Centrífuga enriquecido células a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou suct vácuoíon no recipiente de resíduos.
- Ressuspender as células em 1 ml de Etiquetagem buffer. Remover alíquota de células para contar, para avaliar a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano como no passo 2.9.
- Adicionar um volume de Etiquetagem Buffer para 10 x 10 6 células / ml; se as células já estão <10 x 10 6, centrifugar a 450 g durante 7 min, elimine o sobrenadante por vazamento off ou de sucção a vácuo em um recipiente de resíduos, e adicionar volume de Etiquetagem Buffer para 10 x 10 6 células / ml.
- Configure alíquotas separadas de aproximadamente 5-10 × 10 5 células cada para células de controlo não coradas, manchada de isótipo, e single-coradas em tubos de microcentrífuga.
- Adicionam-se 5 ug / ml de CD4-FITC e 1 ug / ml a CD45RB-PE para as células. Adicionar manchas de controlo de isotipo e as manchas individuais com a mesma concentração de alíquotas em tubos de microcentrífuga apropriados. Misture bem, mas com cuidado e incubar em gelo protegida da luz durante 30 min.
- Adicionar 10x volume de Etiquetagem Buffer para células e controles. Centrífuga 450 g durante 7 min. Elimine o sobrenadante por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
- Ressuspender em Labeling Buffer para o volume na etapa 4.5. Centrífuga 450 g durante 7 min. Elimine o sobrenadante por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
- Ressuspender em Labeling Buffer para 10 x 10 6 células / ml. Passa através de células 70 um filtro em tubo FACS. Mantenha no gelo protegido da luz até que esteja pronto para FACS.
- Configure e determinar a compensação apropriada no separador de células com células não coradas e controles individuais manchada.
- Excluir células não viáveis com forwarder e side-dispersão gating (Figura 1A). Configure gating para células CD45RB + CD4 + e com controles manchada de isótipo. Células portão à população CD4 +.
- Ordenar CD4 + células em CD45RB alta e CD45RB populações de baixa usando um histograma simples para as células marcadas com PE em tubos com 2 ml de Meio Completo. O CD45RB alta + CD45RB + células (CD45RB alta), e a população de baixa CD45RB é o mais baixo de 20% das células CD4 + CD45RB + (CD45RB baixo; Figura 1B).
Figura 1: citometria de fluxo representativas parcelas de populações de células T CD4 + CD45RB durante a análise FACS (A - C) com FITC e CD4-PE esplenócitos CD45RB-corados de dadores murganhos C57BL / 6 foram classificadas por FACS em células CD4 + CD45RB high e CD4 +. populações de células T CD45RB baixo. Eventos (A) Doublet foram excluídos do gráfico de dispersão para a frente. (B) Os linfócitos foram fechado na trama dispersão frontal e lateral. (C) CD4 + (D) CD4 + CD45RB + T foram plotados em um PE contra Eventos histograma. As células T CD4 + CD45RB baixas foram consideradas ser a mais baixa de 20% de células + CD45RB. As células T CD4 + CD45RB elevados foram definidos como a mais alta de 40% de células + CD45RB.
- Executar uma alíquota de cada população de células sobre a máquina de FACS para avaliar a pureza das populações.
- Centrífuga classificadas células a 450 xg por 7 min. Ressuspender em 1 ml de PBS. Remover alíquota de células para contar, para avaliar a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano como no passo 2.9.
5. injeção de células em Destinatários
- Ressuspender classificados células a 4 x 10 6 células / ml (alta CD45RB) ou 2 x 10 6 células / ml (CD45RB baixo) em PBS.
- Transferir 100 ml de células de alta CD45RB por beneficiário para novo tubo estéril. Adicionar 100 ul de PBS pordestinatário a este tubo. Assim, o volume total de injecção por animal é de 200 l, e valor total de células por beneficiário é de 4 x 10 5 CD4 + CD45RB células T naive elevados.
- Se o grupo experimental receber células T reguladoras é desejada, transferir 100 ml de células de alta CD45RB por beneficiário para novo tubo estéril. Adicionar 100 ul de células de baixa CD45RB por recipiente para o mesmo tubo. O volume total de injecção por animal é de 200 uL; proporção de CD45RB alta: células de baixa CD45RB é 2: 1.
- Injectar 100 ul de CD45RB alta ou CD45RB alta CD45RB baixo CD4 + células / intraperitoneal em o lado direito e esquerdo do abdômen (total de 200 ul) de cada destinatário.
6. Monitoramento da progressão da doença em animais receptores
- Para avaliar o estado clínico dos animais receptores, atribuir escores clínicos agregados para o seguinte parameters 8 no dia da injecção, decorrida uma semana, e no momento do sacrifício:
- Determine desperdiçando medindo a perda de peso: 0 - sem perda de peso; Perda de 0,1-10% do peso corporal inicial - 1; 2 - A perda de mais de 10% do peso corporal inicial (Figura 2A).
Figura 2: sinais patológicos clínicos e brutas de inflamação ocorrem após a transferência de tipo selvagem CD4 + CD45RB células T em alta RAG1 - / - e ratos destinatário NRDKO 11 (a) destinatários NRDKO perderam, em média, 10% do seu peso corporal inicial por 5. semanas após a transferência, enquanto RAG1- / - Os beneficiários não apresentaram sinais clínicos da doença neste momento. Cada ponto representa a média percentual do peso corporal inicial para a coorte ± SEM. **, P <0,005. (B) Alguns ratos desenvolveram inflamação intestinal grave, como demonstrado pela presença de prolapso retal. Esta é uma imagem representativa de prolapso retal em um mouse destinatário NRDKO. (C) Grosseiramente, a partir de dois pontos, tanto RAG1 - / - e ratinhos receptores NRDKO são espessadas e menor do que os dois pontos de RAG1 - / - e ratinhos NRDKO sem transferência adoptiva de células T. Colons de ratos receptores NRDKO mostrar inflamação grave e aumentou o peso dos dois pontos (dados não mostrados). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Determinar a qualidade das fezes dos animais, colocando em recipiente limpo até que ele passoubanquinho: 0 - none; 1 - fezes moles; 2 - fezes aquosas e / ou com sangue.
- Determinar a saúde geral do animal através presença dos seguintes sinais da doença: 0 - nenhuma postura arqueada, eriçou pele, ou pele lesões; 1 - qualquer um de presente o seguinte: debruçado postura, eriçou pele, ou lesões de pele.
- Determinar a presença de prolapso retal: 0 - ausente; 1 - presente (Figura 2B).
- Sacrificar animais por inalação de CO2 seguido por deslocamento cervical, quando eles perderam 20% do seu peso corporal inicial ou no ponto de tempo desejado, o que ocorrer primeiro. A doença clínica é tipicamente evidente a partir de 5 semanas de pós-repletion.
- Avaliar para a gravidade da doença, como descrito anteriormente 5,7.
- Atribuir escores clínicos como no passo 6.1 8.
- Medir o comprimento do cólon e do peso (Figura 2C).
- Realizar análise histológica de inflamação5.
- Determine a expressão das citocinas espontânea em intestinais culturas de explantes tecido 9, linfa mesentéricos 10, e / ou soro 11.
- Resumidamente, para culturas de explantes 9, remover dois pontos após o sacrifício, aberta longitudinalmente, e limpo, com PBS. Incubar dois pontos, num agitador orbital a 250 rpm, em Meio Completo, durante 30 min à temperatura ambiente.
- Picar o tecido em pequenos pedaços e incubados a 37 ° C em Meio Completo, durante 24 h. Recolhe-se o sobrenadante e utilizar para a quantificação de citocinas por 100 mg de tecido por ELISA.
- Realizar ex vivo caracterização de fenótipos de células T e / ou função 10.
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Representative Results
Aproximadamente 10 x 10 6 de células T CD4 + CD45RB high T de baços de 10 adultos C57BL / 6 murganhos dadores são seguramente isolado. Este número variará, dependendo da idade e estirpe do rato dador e a proficiência do investigador. Quando 4 x 10 5 C57BL / 6 células CD4 + T CD45RB alta são transferidos para C57BL / 6 RAG1 - / - ratinhos receptores, sinais clínicos da doença surgir em torno semana 5 pós-repletion ou antes, se os ratos são geneticamente suscetíveis à doença mais grave ( Figura 2, 3) 11,12. Células T CD3 + são vistos acumulando em dois pontos de RAG1 - / - destinatários logo em 3 semanas (Figura 3A) 12.
Figura 3: Transferência de tipo selvagem CD4 + células CD45RB alta T em RAG1 - / - e destinatários RKO / δ KD induz inflamação intestinal crônica 12 (A) (ampliação Original 10X, H & E e CD3 imuno-histoquímica).. H & E coloração (painéis superiores) ilustra hiperplasia epitelial, infiltrados de células inflamatórias, e abscessos da cripta (seta) presentes na RKO / δ destinatários KD mas não RAG1 - / - destinatários. Colons de RKO / δ camundongos KD beneficiários demonstrou acumulação acentuada das células T CD3 + por CD3 IHC (painéis inferiores) em comparação com os dois pontos de RAG1 - / - destinatários. (B) Colons da RKO / δ KD ratos destinatário demonstrou inflamação mais grave em comparação com cólons from RAG1 - / - ratos destinatário no histológico de pontuação. (C, D) de culturas de explantes do Colo / δ camundongos RKO KD beneficiários secretadas menos IL-10 (C) e mais IL-12p40 (D) do que fizeram culturas de explantes de cólon de RAG1 - / -. Ratos destinatário Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nós publicado anteriormente que a transferência adotiva de células T em Nfil3 - / - / RAG1 - / - destinatários knockout duplas (NRDKO) desenvolver colite mais grave em comparação com RAG1 - / - ratinhos receptores (Figura 2) 11. NFIL3 regula negativamente a IL-12p40 em macrófagos do cólon murino, independentemente dos seus efeitos de IL-10 induzindo-13. A desregulação de IL-12p40 e IL-10 está implicado no caminhoogenesis de humano IBD 1. Assim, não verificada IL-12p40 produção em adotivos transferência NDRKO resultados ratos destinatário em progressão mais rápida da doença, como mostrado pela perda de peso (Figura 2A). Alguns ratos destinatário NRDKO desenvolveram doença grave, resultando em prolapso retal (Figura 2B). Grosseiramente, dois pontos de ratos receptores NRDKO são engrossados e encurtado, o que representa um grande afluxo de células inflamatórias para o cólon, em comparação com RAG1 - ratinhos receptores (Figura 2C) - /.
Comparativamente, em RAG1 - / - ratos com um não-funcional PI3K p110δ subunidade catalítica em populações não-linfócitos (RKO / δ KD), CD4 + CD45RB repleção célula T f elevada induz um curso clínico semelhante rápida e grave da doença, em comparação com os ratinhos (Figura NRDKO 3) 12. A análise histológica em 3 semanas demonstra a hipertrofia do tecido do cólon, inflammainfiltrados celulares tory, e abcessos da cripta (seta) em RKO / δ destinatários KD comparada com RAG1 - / - receptores (Figura 3A). Os ratinhos receptores nesta experiência foram sacrificados às 3 semanas devido a um número significativo que tinha perdido 20% do seu peso corporal inicial. Escores histológicos, como determinado por um patologista que desconhecia os grupos experimentais e com base em critérios específicos desenvolvidos em nosso laboratório de 12, foram maiores no RKO / δ camundongos KD beneficiários em relação ao RAG1 - / - ratinhos receptores (Figura 3B). Além disso, a produção de citocina espontânea a partir de culturas de explantes do cólon demonstrou redução da IL-10 e IL-12p40 melhorado de produção por RKO / KD δ ratinhos receptores em comparação com RAG1 - / - ratinhos receptores (Figura 3C e D) de 12. Mais uma vez, o aumento de IL-12p40 e IL-10 diminuiu a produção está implicado na patogénese da DII humana 1.
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Discussion
Aqui nós descrevemos um protocolo passo-a-passo induzindo a inflamação do cólon em camundongos por transferência adotiva de células CD4 + T + CD45RB em ratos imunodeficientes. Usamos baços C57BL / 6 doadores e RAG1 singeneico - / - ratinhos receptores, embora outras estirpes (por exemplo, BALB / c, 129S6 / SvEv, não-obesos diabéticos (NOD)) modelos e genéticos da imunodeficiência (por exemplo, SCID, RAG2 - / -) também pode ser utilizado 4,14-16. Já está bem estabelecido que o fundo tensão afeta gravidade colite experimental em camundongos 1. Além disso, a microbiota entérica em uma população murina varia amplamente entre as instalações, mesmo entre aqueles dentro da mesma instituição 6,17. Enquanto figuras 2 e 3 não mostram o desenvolvimento de colite em RAG1 - / - ratos em quatro semanas de pós-transferência, em nosso e as experiências dos outros RAG1 - / - destinatários desenvolver clidoença nica entre 6 e 9 semanas após a transferência de células T CD4 + CD45RB high T 18-23. Esta variabilidade de evolução clínica e expressão da doença e deve ser levado em conta no estabelecimento desse modelo de colite experimental para minimizar a inconsistência intra e inter-experimental.
Um passo fundamental para a reprodutibilidade desta experiência é FACS isolamento de populações puras de células de alta CD4 + CD45RB sem ativados memória / células residuais / T reguladoras. Trata-se de uma compreensão proficiente de citometria de fluxo. É importante seleccionar primeiro negativamente as células não viáveis e CD4-. Em seguida, utilizando um simples histograma para células CD45RB-PE, seleccionar o maior de 40% das células para representar as células T de alta CD45RB e 20% mais baixos que as células T de baixo CD45RB. Outros marcadores para considerar o uso de isolamento das células CD4 + T naive são CD62L e CD25, embora em nossa experiência CD45RB alta baixo separação é suficiente e reprodutível 5. Além disso, é possível variar a proporção de CD45RB high para CD45RB células T baixas transferidos para recipientes para estudar os efeitos de populações de células T reguladoras no fenótipo da doença. Trabalhar com alguém que esteja familiarizado com a citometria de fluxo, inicialmente, para configurar o protocolo de FACS e em seguida, usando esse protocolo em experimentos futuros. Além disso, uma etapa onde a variação significativa pode influir no resultado neste protocolo é a injeção intraperitoneal de células T em ratinhos beneficiários. Aqui, a variabilidade intra e inter-experimentador pode impactar significativamente o resultado da experiência. Sugere-se que a pessoa que realiza este passo é confortável com ratinhos de manuseamento e com a técnica de injecção, de modo a minimizar a variabilidade na qualidade e quantidade de células transferidas adoptivamente. Além disso, é importante mudar de agulhas entre os ratinhos, como agulha de embotamento pode afectar a eficácia daa injecção intraperitoneal.
Passos do protocolo que exigem otimização incluem Seção 3: Enriquecimento de células CD4 + T e Secção 4: rotulagem e Classificando Cells. Optimização do enriquecimento de células CD4 + T depende do sistema magnético utilizado e devem seguir as instruções dos fabricantes. Opções para sistemas de separação de células magnéticas são listadas na Tabela de Specific Reagentes / Equipamentos. É aconselhável para enriquecer as células T CD4 + por selecção negativa, a rotulagem como directamente esta população pode afectar o fenótipo das células. Há muitos clones de anticorpos disponíveis para marcação das células para FACS. A concentração de anticorpos (passo 4.4) devem ser otimizadas para garantir coloração específica e obter uma separação adequada das populações de células CD4 + T CD45RB durante FACS.
O desenvolvimento deste protocolo pode exigir solução de problemas. Em primeiro lugar, o sucesso de cada experiênciadepende da competência do pesquisador e vai aumentar com a melhoria da habilidade nesses métodos. No entanto, a obtenção consistente baixos números de células T para a transferência adoptiva pode ser causada por não manter as células em gelo durante o isolamento, ressuspender as células centrifugadas demasiado agressiva, ou o uso de esplenócitos de ratos jovens com pequenas baços. Além disso, optimizar a concentração de anti-CD4 e anticorpos anti-CD45RB de rotulagem para a coloração, para evitar a coloração da célula deficiente ou não específica (ver acima). Se os destinatários desenvolver graus muito diferentes de inflamação intestinal, a causa mais provável é imprecisa técnica de injeção intraperitoneal. Isto deve melhorar com a prática e pode ser monitorizada por coloração immunohistologic de células CD3 + no intestino dos ratos receptores. Outras coisas a considerar incluem o sexo de ratos doadores e receptores e variações normais de penetração doença. Quando ratinhos receptores masculinos são usados quer ratinhos dadores do sexo masculino ou do sexo feminino são umppropriate. No entanto, se os ratos fêmeas receptoras são para ser utilizados, os ratinhos dadores devem ser do sexo feminino 5. Em nossos e os outros 'experiências, a penetração da doença neste modelo é de 85-90% 5. Assim, espera-se que alguns ratos podem não desenvolver a inflamação intestinal, dadas outras causas da variabilidade acentuada na severidade da doença foram descartadas. Tenha em mente há uma variabilidade acentuada na fenótipos entre as instalações dentro de uma organização e fora dela em relação a microbiota e práticas que influenciam a microbiota 6,17 gastrointestinal murino. Assim, a robustez do fenótipo ou cinética da doença em RAG1 - / - ratos receptores podem variar amplamente baseado em sua localização. Portanto, é importante para determinar os melhores parâmetros para estas experiências baseadas na linha de tempo e os resultados obtidos a partir de cada instalação individual.
Aqui descreve-se a metodologia da transferência adaptativa de murino bem caracterizadosmodelo do intestino delgado crônica e inflamação do cólon que se assemelha IBD humano 5. Este protocolo passo a passo ilustra técnicas fundamentais para o sucesso no desenvolvimento deste método para fins de investigação. Este é um modelo animal particularmente útil de IBD humana, uma vez que permite a sincronização da doença e manipulação de várias populações de células. No entanto, os ratos imunodeficientes destinatários são geneticamente modificados para desenvolver sem células imunes adaptativas maduros, o que provavelmente afetar a evolução das doenças a jusante. Apesar disso, o método descrito aqui será muito útil em estudos futuros que determinam o impacto da microbiota entérica, as células imunes inatas, e reguladores de células imunes adaptativas na patogénese do IBD humana.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Associação Americana de Gastroenterologia (AGA) Research Award Scholars e Doença de Crohn e Colite Foundation of America (CCFA) Desenvolvimento de Carreira Award (a ENS), NIH NIDDK F30 DK089692 (a ECS) e University of North Carolina Centro de Biologia Gastrointestinal e Doença Grant P30 DK34987 (Histologia Core). O Mecanismo UNC Citometria de Fluxo Core é apoiado em parte por uma NCI Centro de Suporte Grant Núcleo (P30CA016086) à Comprehensive Cancer Center UNC Lineberger. Agradecemos Luke B. Borst da North Carolina State University College de Medicina Veterinária por sua ajuda com a análise histopatológica e imuno-histoquímica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10x PBS | Gibco | 14200075 | |
| 12 mm x 75 mm round-bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 15 ml conical | Corning | 430790 | |
| 26 G x 3/8 Needle | BD Biosciences | 305110 | |
| 50 ml conical | Corning | 430828 | |
| 70 μm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363548 | |
| BD IMagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 35602 | |
| CD4-FITC IgG2b | eBioscience | 11-0041 | |
| CD45RB-PE IgG2a | BD Pharminogen | 553101 | |
| Complete Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME | ||
| FACS tube + strainer | BD Falcon | 352235 | |
| Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Heat-inactivated FBS | Gemini | 100-106 | |
| Labeling Buffer | 1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | ||
| Lysis Buffer | 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA | ||
| MoFlo XDP | Beckman Coulter | ||
| Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM | BD Biosciences | 558131 | |
| Mouse IgG2a-PE | BD Pharminogen | 553457 | |
| Mouse IgG2b-FITC | eBioscience | 11-4732 | |
| Pasteur pipet | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-CI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Fisherbrand | 875713 | |
| Pure Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705-HC | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11-875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| Wash Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME |
References
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