Abstract
共聚焦显微镜是用于复杂的组织中的多个细胞类型中的定位的分析选择的方法，如骨髓。然而，细胞定位的分析和定量是困难的，因为在许多情况下，它依赖于人工计数，从而轴承引入评价者依赖性偏差和减少间信的风险。此外，它往往是难以判断是否之间从随机定位两个小区的结果的共定位，特别是当细胞类型在它们发生的频率强烈不同。这里，用于蜂窝共定位于骨髓的无偏量化的方法被引入。该协议描述了用于获得全鼠长骨的组织切片，包括骨髓样品制备，以及在染色方案和获得高清晰度图像。分析工作流程从识别造血和非HEMAT的跨越在2维（2D）的骨髓的图像的那些细胞之间的直接接触的量化opoietic细胞类型呈现。这还包括一个邻域分析，以获得关于周围某一细胞类型的细胞微环境的信息。为了评价共定位两种细胞类型是否是随机的细胞定位的光效或反映了细胞间优先关联，一个模拟的工具，它适用于测试这个假设在造血以及基质细胞的情况下，是使用。这种方法不限定于骨髓，并可以扩展到其他组织中，以允许组织学数据的重现性好，定量分析。
Introduction
由于在显微镜最近快速的技术发展，包括光学成像，整个组织的范围内的细胞的分析已成为免疫学家越来越容易获得。单细胞的悬浮液的表征代表有价值的，不可缺少的方法来了解细胞和分子的功能。然而，该细胞的内它们的（微）-anatomical环境分析对于理解在复杂过程互相协作，如免疫反应的发展各种细胞类型之间的相互作用是必不可少的。
虽然这是相对容易的显微镜，以获得从图像质量信息，但它仍然量化这些数据是一个挑战，部分原因是由于在这个领域的分析方法进行滞后相比，现在有可能在图像采集的事实。许多研究人员仍然依靠耗时在他们的组织学图像手动细胞计数，从而带来了一种偏见之间不同的评价者和其他团体阻碍复制。通常情况下，一个代表图像被选择为强调对细胞的位置或共定位的声明在一个出版物，难以为读者来判断这样的事件的统计相关性。
再加上事实，即图像数据的全部信息内容很少利用，这强调了需要一个更公正，更快速和全面的方法来分析组织的图像。
骨髓是一个复杂的组织，这需要对重要生命功能作为造血在成年脊椎动物的器官。除了 是发源地为造血细胞1,2和打在B淋巴细胞发育3中起重要作用，它也可以作为一个网站，免疫反应引发4和支持成熟，再循环的B细胞5。此外，其在维持我的作用mmunological存储器已经越来越意识到，在过去的十年中，作为多种类型构成免疫记忆细胞已被发现位于那里6-9。
骨髓复杂的组织结构和功能之间的关系仍然难以捉摸。不同于次级淋巴器官，这些组织在宏观室如T和B细胞区，骨髓缺乏明确宏观条块。到目前为止鲜明隔间骨髓由其邻近骨皮质或脉管限定。在骨髓中的多个进程的各个驻地基质细胞群如支持干细胞，B细胞或维护免疫记忆细胞群（如长寿命的浆细胞（PC机），CD4 +和发育的重要性CD8 +记忆T细胞）清楚地表明，存在一定程度的微区室中的骨髓。
目前尚不清楚在何种程度上这些利基相对于它们的细胞和分子构成因素的共同特点n和哪些元素呈现一定的利基独特。除了基质细胞，造血细胞类型已经显示通过提供某些信号的至少一段的壁龛中发挥关键作用。显然，小生组合物的复杂性，需要他们的原位分析，它已成为日益重要的免疫学家和血液科放大对骨髓微， 例如，通过分析其细胞成分之间的空间关系。
这里，一个策略来量化在骨髓中的自动化和无偏方式蜂窝共定位和邻里关系呈现。详细的工作流程，包括嵌合小鼠的产生，窝藏荧光基质细胞和非荧光的造血细胞，制备从脱钙骨，采集覆盖整个骨的共焦图象的组织切片，以及蜂窝C的自动图像分析邻定位及验证/从随机定位由一个模拟工具判别被设置（ 图8）。
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Protocol
动物实验批准动物福利（Landesamt献给GESUNDHEIT UND Soziales，柏林）适当的状态委员会，并按照现行准则和条例（动物实验许可G0194 / 11）进行。
1.产生荧光骨髓嵌合体小鼠
注：荧光骨髓嵌合小鼠的产生可视化的骨髓基质细胞被作为9之前所述进行。
- 开始治疗德尔-酶Cre X ROSA-tdRFP小鼠（小鼠表达串联红色荧光蛋白（tdRFP）无所不在11-13）让他们做好准备的照射。另外，使用任何其他菌株荧光蛋白无处不体现。照射前两天施用新霉素经由饮水1毫克/毫升和1毫克/毫升的维生素（A，D3，E，C）。
- 小鼠照射两次3.8灰色与铯-137伽玛辐照无线瘦3小时的间隔。对于此，将小鼠在适合于各自的照射的照射馅饼笼。
注：对于小鼠的辐射，我们的研究所不需要麻醉。按照有关麻醉照射本地机构的政策。如果有疼痛的迹象的照射后治疗的动物用5mg / kg每天卡洛芬皮下（SC）的。 - 第二天，通过静脉内注射，从长骨的C57BL / 6供体小鼠中转移缓冲器9中制备3×10 6个骨髓细胞重建的小鼠。继续新霉素小鼠和维生素长达2周，在此期间，监测他们的幸福和重量。等待至少4周，以允许免疫系统的重建开始具体实验处理之前（ 例如 ，免疫）9。
- 牺牲老鼠，并把它们放在夹层板，消毒腿用70％乙醇。 EuthanizË小鼠按照当地机构的政策。我们的研究所进行颈椎脱位。
- 使用镊子和剪刀，从大腿取出皮肤。除去肌肉组织以暴露股骨。 Luxate从髋关节和膝关节使用镊子和剪刀的股骨。小心不要折断或切骨。
- 小心地取出剩余的大块肌肉组织和软骨的使用剪刀骨。通过摩擦与实验室棉纸骨除去剩余的肌肉组织。收集的清洗骨头在培养皿用磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 整个修复股骨头骨在4％多聚甲醛（PFA，电子显微镜级）4 - 6小时。
- 放弃PFA和孵化骨头在PBS O / N 10％的蔗糖。第二天，孵化的骨头20％的蔗糖O / N。后的第二天，孵化的骨头30％的蔗糖O / N。
2. Cryosectioning骨骼
注：1后，6 - 24小时，在30％的蔗糖，冷冻骨骼和根据川本的磁带方法14,15冷冻切片它们。
- 准备一个大烧杯（2000毫升体积）用干冰和丙酮（约2：1的体积比， 例如400毫升无水冰和200毫升丙酮的）下一个通风柜。放置一个小烧杯（150 - 250 ml，此）用己烷内（30 - 50毫升约）。等待混合降温（大约10分钟，直到霜出现在大烧杯中的外侧）。
- 充满超级Cryoembedding中等（SCEM）标记cryomold的¾;小心地将里面挑骨头，直到他们完全沉浸，小心他们不接触模具的边缘。与大钳握住cryomold与刚好接触己烷的表面的模具底部的烧杯中。
- 让SCEM冻结的外边缘（由不透明度表明，这需要大约15秒）。然后完全放下模具放入正己烷和让它FRE结1 - 2分钟。取出冷冻的样品和包装玻璃纸，然后铝箔（以保护样品，从干燥并避免暴露于光）。储存在-80°C，直到cryosectioning。
- 股骨骨头cryosectioning使用标准的切片机切片机和刀片硬组织。
- 设置切片的样品和叶片温度至-24℃。让切割前的切片机内的样品静置约15分钟。
- 固定样本块与SCEM或最佳切削温度（OCT）中的金属样品架。必要时可以调节该块的方向。修剪的样品，直到骨完全打开和骨髓是可见的。调整部分厚度为7μm（丢弃所述第一部分）。
- 修复了一块川本磁带上使用鹿皮革覆盖的木制压舌板样品块顶部的粘性的一面。接着，切取试样，并打开带，使得该节定位在顶侧。磁带传送到使用镊子载玻片。固定胶带将载玻片用透明胶带。
- 让切片干燥至少30分钟，并且将它们存储在-80℃直至使用。存放在塑料载玻片盒与单个幻灯片之间间隔物未染色和未安装的滑动，以避免它们粘在一起。染色并安装幻灯片可以存储长达一个星期在纸板幻灯片文件夹中，在4℃。
3.图片集
- 按照常理免疫协议9解冻和染色冰冻切片。包括核染色剂， 例如，4'，6二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）的可视化的组织的完整性。
注：色漆，例如用于RFP形象化基质细胞（抗RFP生物素抗体和链霉抗的Alexa Fluor 555），染色嗜酸性粒细胞与大鼠抗主要碱性蛋白（MBP）抗体和抗鼠的Alexa Fluor 647抗体细胞，B细胞用大鼠抗B220-的Alexa Fluor 594抗体和PC用抗κ轻链荧光素异硫氰酸酯（FITC）和抗λ1轻链FITC抗体（染色过程的细节在9中描述）。 - 贴装染色切片：放一滴fluoromount的上部分，然后盖上＃1盖玻片，同时小心避免空气气泡的形成。接着，进行激光扫描共聚焦显微镜用装有适用于染色的激光线的工具。
- 为了记录影像的骨髓造血细胞与使用Wimasis工具间质细胞，应用以下设置自动共定位分析：
- 使用20X物镜和视的708.15 X 708.15微米的场。用于自动分析，保持在2048 X 2048像素（PX）相一致的所有图像的大小，以保持其结果媲美。
- 记录一个通道的基质结构（ 例如， 例如，DAPI，405纳米）和附加信道为所关注的造血细胞（ 如，3路，488/594/633毫微米为嗜酸性粒细胞，B细胞和PC）。
- 用行平均4月16日创纪录的图像。理想的情况下，覆盖整个股部分采取单相邻图像。可替代地，采取从骨髓（骨干以及骨骺）的各个区域不相邻的图片。
注意：要小心，不要产生相邻图像（以避免细胞重叠区域反复分析）之间的重叠。
- 将图像保存在显微镜的图像文件格式。检查和，如果需要的话，调整对比度在图像查看器/分析软件的所有通道。
- 每幅图像的文件导出3 .jpg文件：用于DAPI通道（红/绿/蓝（RGB）格式，假彩色编码黄），用于信道间质1 .jpg文件（灰度）和一个.JPG 1 .jpg文件包含文件渠道造血细胞（最大3通道，RGB格式， 例如，FITC（电脑，假颜色：绿色）/的Alexa Fluor 594（B细胞，假的颜色：蓝色）/的Alexa Fluor 647（嗜酸性粒细胞，假的颜色：红色）） 。
4.自动图像分析
- 使用图像分析工具来执行图像分割，共定位和邻里的分析（见讨论 ）的量化。
- 如果使用Wimasis工具，步骤如下：
- 上传的每个图像3 .jpg文件集具有相同的文件名后加下划线和一个数字，表示图像的类型。
- 使用_1与造血细胞.jpg文件，_2为的DAPI通道，_3为基质通道.jpg文件.jpg文件。例如：Image1_1.jpg（造血细胞），Image1_2.jpg（DAPI通道），并且Image1_3.jpg（基质信道）。通过客户帐户上传图片。
- 对于细胞接触定量通过单击在相应字段中的细胞接触的工具。对于细胞附近的量化，选择单元附近工具，并进入在微米的优选半径附近（这是从该单元的边缘测量）。
- 下载的结果。
注意：该结果被提供为.jpg文件表示的造血细胞，并与所检测的对象的边界的信道间质高亮，以及含有该测量对每个图像单一的.csv文件中，除了一个摘要.csv文件即包含所有上传的图片数据。
- 从接触测量确定与基质细胞，或红色，绿色，或蓝色的细胞接触的其他造血细胞类型的频率触点（造血细胞（红色，绿色，或蓝色的细胞）的示例中示出代表结果的频率， 图4）。为了确定频率，通过划分每个图像在给定接触计数每幅图像的总细胞计数。
- 用于与个体小鼠的实验中，总结了所有的图像的总接触计数为单个小鼠和由所有图像的总细胞计数的总和除以它们。
- 从附近的测量，确定如在步骤4.3（描述从基质细胞和/或红色，绿色或蓝色中的细胞优选接近其他造血细胞类型的频率的选择的距离内的红色，绿色或蓝色的细胞的频率也看到代表结果， 图4）。
5.随机模拟骨髓的定位
- 执行的随机细胞定位在模拟上所分析的骨髓组织学图像之前，预先准备了以下文件：由细胞接触工具机，原.jpg文件为DAPI通道和原始.jpg文件所提供的单个的.csv文件为基质的通道。
- 为了进行在一系列图像批量模拟（ 例如，从一个股部分中的所有图像），收集在一个文件夹中的所有原始.jpg文件（_1，_2和_3）和相应的单的.csv文件。
注：模拟工具随机骨髓细胞定位可应要求提供。 - 启动仿真工具，勾选“自动加载图像数据”。
注：该程序会自动读取.csv文件中的细胞计数及平均细胞大小。这些值显示在框“小区号”和“细胞大小AVG”（ 图5A）。 - 输入常用的标签将.csv文件， 即在他们的名字的共同因素。输入应用于批处理模式模拟图像集的数目。
- 加载从基质通道生成.jpg文件（文件名为结束_3）。
- 输入用于产生从DAPI通道掩模设置：
- 勾选“？申请掩模“为DAPI图像转换成二进制掩模10（ - 255范围0）设定阈值。
- 勾选「8位？“勾选”扩张？“，并设置扩张的档次，以5像素。勾选「W /糜烂？“。
- 输入的附近半径（邻域半径），用于模拟图像的分析所需的值。为708.15 X 708.15微米的大小为2048 X 2048像素的图像（像素缩放XY：0.346微米），29像素对应于10微米。
- 复选框“使用大津？”用大津算法17自动检测基质结构。
注意：这是一个用于通过接触和附近的工具相同的算法。在所记录的图像和模拟图像的自动分析使用相同的图像分割算法是至关重要的，以保持该数据具有可比性。 - 输入设置为造血细胞，其中ArË模拟为圆形。
注：对于红，绿，和蓝单元的细胞数直接从.csv文件加载（也参见步骤5.6）。- 使用仿真工具来计算红，绿和蓝单元的像素的平均直径。确定单个小区作为在图像中不同的细胞类型中像素由每幅图像的总细胞数除以该总面积的平均面积。使用的平均面积来计算使用下式的光盘的半径。一倍的半径来确定的平均直径。
- 测量所分析的细胞类型与任何图像分析软件，包括对象分割功能的细胞大小分布。确定σ为所有的造血细胞类型（18和图5B）。
注意：由于所记录的细胞的细胞大小分布不被自动图像分析测定，使用高斯分布作为真实分布的近似。吨的宽度他分布曲线由σ描述，并且可针对各种细胞类型完全不同。 （详情请参见图5B）。- 从这些测量中，确定了“小区大小截止”：描述仍确认为通过图像分析工具的完整细胞的最小对象像素的直径。
- 在图形用户界面（ 图5A）上的各框中输入参数。
- 进入细胞的大小切断， 即，在模拟允许的最小单元尺寸，如直径在像素。
- 输入σ在像素为红色，绿色和蓝色的细胞（来自步骤5.9）中的细胞大小分布的模拟。
- 检查小节“的面具细胞”中的“删除”复选框。通过此设置，程序就会选择一个新的位置为一个单元，如果它与至少一个像素与掩模的不走区域重叠。勾选「避免细胞重叠？̶1;在小节“细胞排斥”。
- 输入两个细胞在像素的中心之间所允许的最小距离。
注：最小距离需要从所记录的图像来确定。错误地测量最小距离会导致偏见/人工结果记录和模拟图像的对比。 - 重叠的最大面积设定为100％，如果该重叠是由最小距离从中心定义为中心。
- 设置模拟工具1000重复。
- 勾选“自动保存细胞？”保存模拟对象的坐标批为.rect文件（文本格式）的每个图像的所有重复。勾选“自动保存图像？”保存.TIFF文件中为每个模拟图像。输入一个共同的标签保存的文件。
注：“？自动保存细胞”选项可减少模拟运行时间和整体数据的大小，节省了比较实际的模拟IMA时GES。所述.rect文件模拟细胞的坐标保存为矩形，如果需要，可因此被转换成模拟图像。
- 通过点击“运行模拟”开始模拟。
注：仿真工具自动生成.csv文件为1000模拟每个图像，其中包括平均接触计数和附近计数为红，绿和蓝单元以红，绿，蓝，和间质细胞的每个组重复模拟。此外，对于所有的这些值，被设置在1000模拟与标准偏差（STD）和平均值的标准误差（SEM）的平均值。 - 确定平均接触频率和一组1,000个模拟图像附近的频率。为此，除以每幅图像的记录细胞计数的平均接触及周边地区计数。比较的频率，以所记录的图像的自动的共定位分析的结果。
- 应用适当的为static根据分析19 stical方法（ 图7中 ，我们使用了双尾Wilcoxon符号秩检验）。
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Representative Results
切割脱钙骨的冷冻切片与川本磁带方法允许整个骨进行切割作为一个完整的部分，与仍连接到矿化骨内膜区域的骨髓，无论是在骨干以及与骨骺区域其高密度骨小梁（ 图1）。各部分的核染色显示，尽管在制备小裂缝不能完全避免，该正弦和动脉的结构，以及实质的网状网络保持不变。
作为红色荧光嵌合骨髓的免疫荧光染色的一个例子，它的随后的分析中，示出对嗜曙红细胞染色（主要碱性蛋白，MBP），个人电脑（κ和λ轻链）和B细胞（B220）。小鼠用100微克的4-羟基-3- nitrophenylacetyl半抗原偶联到鸡γ球蛋白（NP-CGG）的明矾的ip，4周后重建，在PBS IV提振，50微克NP-CGG 21天后和升压后的第30天进行分析。自动图像分析产生了一个非常精确的识别的基质的结构，也包括网状过程非常小的碎片。自基质细胞的细胞数不能与这里提出的系统来确定（也见讨论），以检测图像中的所有片段（ 图2），没有大小阈引入为基质通道。 PC和嗜酸性粒细胞比B细胞体积较大，也表现出更多的异构的形状。所有这三种类型的细胞已被公认的第一眼。特别是B细胞的细胞群，被很好地分离。上述分析工具优化用于上述的细胞类型（嗜酸性粒细胞，个人电脑，B细胞）。对于其它类型的细胞，调整可能是必要的。通过细胞接触工具生成该.csv文件包含以下相关测量造血细胞：细胞计数每个细胞群体;总面积为每个细胞群中像素;红细胞的接触计数（在这种情况下嗜酸性粒细胞），绿色细胞（这里PC）或蓝色的细胞（这里B细胞）与红色，绿色，蓝色或灰色的细胞（基质细胞）。由细胞附近工具生成该.csv文件包含造血细胞下列测量：细胞计数的每个细胞群;总面积为每个细胞群中像素;红，绿和蓝单元以红，绿，蓝和灰的细胞（基质细胞）的附近计数。
为了验证的图像分析工具的质量，自动分析的结果进行了比较，该手动计数由6训练有素评价者（ 图3）的。所有的评价者收到相同的图像进行分析。基质的结构和造血细胞进行了仔细概述与图像分析工具和感兴趣的这些区域被保存和分析。为基质的结构，每幅图像的总面积是自动和人工分析进行比较。基质的结构似乎是困难的训练有素评价者识别精确地说，它反映在观察到的基质手动计数（ 图3A）的总面积的大小的大的方差。这里，自动分析确定的值接近由受过训练的评估者检测出的平均面积。对于所有的细胞中，自动分析工具测定细胞稍低量比手动计数。然而，对于个人电脑和嗜酸性粒细胞，数量还在观察手动计数者间方差的范围内。通过自动分析检测B细胞的数量，然而，稍低于该范围（ 图3A）。平均泡孔尺寸（面积单位：像素），通过自动分析测定为512像素为个人计算机，436像素为嗜酸性粒细胞，和317像素为B细胞，而训练的评估者来确定的515像素为个人计算机，464像素的尺寸为嗜酸性粒细胞，和291像素为B细胞。因此，平均CELL大小为B细胞，个人电脑，并通过自动分析测定的嗜酸性粒细胞比得上通过手动评价者（ 图3B）中确定的平均泡孔尺寸。这个自动图像分析工具，现在可以用来量化候选骨髓龛细胞类型的直接接触。此外，某些细胞类型邻近基质细胞或其它造血细胞类型的细胞的频率可以被确定。骨髓PC和他们的联系人的分析基质细胞，嗜酸性粒细胞，B细胞，和其它PC所示，个人电脑在10和20微米（ 图4A）相邻这些细胞类型，以及频率。另外，与基质的各种造血细胞类型的接触频率可以被量化（ 图4B）。
之前与仿真工具进行仿真的这些细胞的随机骨髓定位，描述该细胞大小分布作为GAUS参数西安分配必须确定。对于高斯分布，这可以看作一个对称和“钟形”曲线中，只有两个参数需要确定：曲线（该模式， 即，其中，曲线的峰位于中心的位置）和对称曲线的宽度（这是由上述的σ参数描述）。此过程示出在这里为PC，嗜酸性粒细胞，和B细胞（ 图5B）。测定细胞大小分布表明，对于B细胞，通过σ描述的分布曲线的宽度比PC及嗜酸性粒细胞小。对于仿真，σ测量三个细胞群的相对值维持（ 即，B细胞总是由一个两倍窄的尺寸分布比的PC'和嗜酸性粒细胞“模拟），而在像素定义的σ值分别集相匹配的记录的单元的视觉外观（ 图6B）。这使我们申请的2像素对B细胞的σ和4像素为PC和嗜酸性粒细胞一σ。小区大小截止，从所测量的小区尺寸分布确定。 PC及嗜酸性粒细胞，截止，在300像素的对象大小，从而导致20像素直径的圆形的物体（大约7微米）和B细胞的截止，在220像素，从而导致17像素的直径（约6μm），使用仿真。
为了在允许的细胞被置于由所述模拟工具，模拟随机图像定义区域的掩模，从在骨髓组织学图像（ 图6A）的信道的DAPI核信号而生成。 10的值被确定为用于产生二值图像（上图，右图像）的最佳强度阈值。由大津的算法所确定的阈值不导致充分识别图像中的所有核的（上面板，中央图像），与固定的强度的50或150的阈值（下面板，左侧和中央图像），使用仿真工具（ 图7）。该个人电脑，嗜酸性粒细胞，或B细胞与基质细胞（ 图4B）的触点的相关性进行了测试。该分析显示，在记录的图像显著较高的接触率相比，与基质壁龛支持这些群体的概念模拟PC和B细胞（ 图7A），在行。这在5个体荧光嵌合体小鼠（ 图7B，D）中得到证实。与此相反，没有明显的差异在嗜酸性粒细胞（ 图7A，C）的情况下进行测定。
鼠股骨冰冻切片与川本的磁带方法的纵向截面的图1概述的荧光图像。该带方法允许cuttin克部分具有完整内膜区域，无论是在骨干以及在骨骺领域，从脱钙骨。的幼稚C57BL / 6小鼠阿7微米厚的骨切片染色的细胞外基质蛋白层粘连蛋白（红色），为的Sca-1来可视化动脉（绿色）和细胞核（蓝色，DAPI）。 47瓦的1446 X 1088微米，分辨率为1360×1024像素，记录和缝合创造概述形象。此图片被收购上的宽视场荧光显微镜，用10X物镜（0.45 NA）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.自动检测基质和造血的骨髓细胞。红色荧光志的股骨节MERIC鼠标升压后第30天被染色RFP（灰色）可视化基质，MBP（红色，嗜酸性粒细胞），κ和λ轻链（绿色，PCS）和B220（蓝色，B细胞）。左：获取关于共聚焦显微镜原始图像，用20X物镜（0.8 NA）和来看708.15 X 708.15微米的场。右：分割图像。识别出的对象的轮廓中突出显示。白色矩形标志着底部的图像显示的区域。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.验证由经过培训的评价者自动图像分析。 （A）基质的结构和训练有素的评价者计数造血细胞的总细胞数在1（基质结构）总面积，10相比通过自动图像分析得到的细胞数（如PC），2（嗜酸性粒细胞），以及一个图像（B细胞）。点代表个人评价者（N = 5 - 6）。横道平均值或者自动确定的值。（B）的对象的大小手动计算的对象的分布与通过自动分析测定的平均对象的大小。为了解释的各种细胞类型的不同频率，个人电脑是在10中的一个图像进行计数，嗜酸性粒细胞在2和B细胞。点代表单个对象。线表示均值。（C）基质结构由训练有素的评价者手册大纲。左：原始图像。中间：人工分析的图像的例子。右：通过自动分析检测基质结构，请点击这里查看此图的放大版本。
“图4”SRC =“/文件/ ftp_upload / 52544 / 52544fig4highres.jpg”WIDTH =“700”/>
个人电脑，嗜酸性粒细胞，B细胞和基质细胞中的股骨骨髓图4.自动化共定位分析。 （A）左图：与间质结构，嗜酸性粒细胞，B细胞或荧光嵌合体小鼠的免疫后30天其他PC直接接触电脑的频率。中间和右边：电脑在10微米附近或20微米附近的间质结构，嗜酸性粒细胞，B细胞或其它PC的频率。该图（直接接触，为10μm附近）的部分从Zehentmeier 等修改。电脑，嗜酸性粒细胞和B细胞中与基质的结构直接接触9（B）的频率。 52-515电脑，918-3179嗜酸性粒细胞，4146-13063 B细胞在10-21图片来自5荧光嵌合小鼠进行计数第30天升压后，从两个独立实验汇集。点代表单个小鼠。线表示位数。：//www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图5.测定骨髓电脑，嗜酸性粒细胞和B细胞的细胞大小分布。的仿真工具的图形用户界面（GUI）的（A）的屏幕截图。电脑（B）中的细胞大小分布（面积单位：像素）（κ和λ轻链，绿色），嗜酸性粒细胞（MBP，红色）和B细胞（B220，蓝）中示出的直方图由Volocity软件（上图）的物体识别后测得。在股骨骨髓图像（下图），检测到的个人电脑被标记为红色（叠加黄色），蓝色（紫色覆盖）嗜酸性粒细胞和B细胞中的黄色（覆盖灰色）。图像分割是通过设置180像素的最小尺寸门槛为个人电脑进行，300像素为嗜酸性粒细胞和220像素为B细胞。测量了PC 250的对象，650对象嗜酸性粒细胞和3000对象B细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.生成掩模的模拟随机细胞定位。 （A）中的DAPI的原始DAPI通道（黄色），以及与通过将各个阈值产生的二进制图像叠加显示。从二值图象（阈设置为10）所产生的掩模被显示在下面（下面板，右图像）。黑色区域代表不走区域，白色区域表示允许细胞被放置的区域。（B）中记录的图像（左）和对应的模拟图像（右）示出了高视觉相似性。嗜酸性粒细胞（MBP），个人电脑（κ和λlight链），B细胞（B220）和基质细胞（RFP）显示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7.直接与基质结构造血细胞类型的记录与模拟图像的接触。个人电脑，嗜酸性粒细胞和B细胞的（A）的与基质直接接触频率模拟相比荧光嵌合小鼠的第30天，升压后的记录图像。线路从相应的模拟和记录的图像（点）。一个代表性的鼠标图像显示在每个情节。电脑，嗜酸性粒细胞和B细胞与基质直接接触的（B）频率在模拟相比，5录制的图像个别小鼠来自两个独立的实验。 Wilcoxon符号秩检验，双尾（个人电脑：*** P = 0.0001; * p = 0.0371; * p = 0.0161; ** p = 0.0012; **** P <0.0001;嗜酸性粒细胞：*** P = 0.0007 ; P = 0.1055; * p = 0.0161，P = 0.4143; *** P = 0.0007; B细胞：**** P <0.0001; ** p = 0.0020; *** P = 0.0005; ** p = 0.0012 ; **** P <0.0001）。点代表单个图像。横道平均。 P值0.05顷认为显著的差异。在数字星号表示如下P值：NS：P> 0.05; *：P 0.05; **：P = 0.01; ***：P 0.001; ****：P 0.0001。这一数字（与电脑间质结构直接接触）的部分由Zehentmeier 等进行修改。9 ，请点击这里查看此图的放大版本。
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。造血细胞的量化方法的图8.完整的工作流程-在小鼠骨髓基质细胞相互作用的方法分为三个主要部分组成：1，小鼠骨髓切片准备和原始数据由激光扫描共聚焦显微镜，收集2 。进行记录的图像的自动分析和骨髓细胞的随机定位的仿真，3.从记录和模拟图像所获得的接触和附近的计数进行比较。该输入（图像文件）和自动分析的输出（文本文件）被表示为蓝色，所述输入（图像文件）和输出（文本文件和任选地，图像文件）的模拟工具中指示绿色。 请这里查看这个数字的放大版本。
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Discussion
尽管在现代光学成像方法的进步，组织学数据的分析仍经常因缺乏适当的量化工具和方法，或偏颇的分析，重点关注小面积的阻碍。这里介绍的协同方法结合图像分析覆盖整个骨髓区域，自动分割和识别物体的各种造血和间质细胞类型，共定位分析，并通过了新的定做提供的非随机发生的接触最终验证工具设计仿真软件。
整个骨骼包括骨髓组织学一直难以进行，由于各种组织密度存在于一个节 - 一方面的很硬，矿化骨，另一方面极其脆弱骨髓，这将会轻易破坏时切连同骨。作为替代方案，在磁带方法用于切割骨段PRESented这里14,15具有其稳定的组织，从而留下内膜区域完好（ 图1）的优点。除了 是富含成骨细胞，这些方面已经提出了打在干细胞维持20的作用。
基质细胞在发育过程和在骨髓细胞维持的关键作用变得越来越明显。然而，这些罕见的，脆弱的细胞的分析已被证明是困难的，原因有两个：第一，它们难以从骨髓分离;第二，非均质的基质人口中的程度是不知道的，因此人们可以通过使用已被描述为基质细胞的某些标志物错过重要的人口。产生荧光的骨髓嵌合体的方法，是非常有用的荧光标记，并随后分析骨髓基质细胞群体作为一个整体。但是，应该指出的是，在这些英里骨髓CE所有的间充质细胞被可视化，包括内皮细胞和成骨细胞。这需要考虑到如果从这样的嵌合体小鼠的数据进行分析。即使有也收件人原点的造血细胞存活的辐照的危险，这些细胞通常只包括每视场相比，供体的CD45 +细胞非常小的区域，因此不影响组织学分析9。显然，这种方法应在随后的步骤与基质（分）种群的更具体的检测进行组合。目前，这些细胞的分析主要是通过组织学由于上述原因而作出的，重要的是可以在同一时间进行分析的参数的数量强加限制。在显微镜多参数的发展分析，将有助于克服这些限制。
期间的图像分析，使用原来的大津的算法进行分割。实质上这个聚类的基于阈值的方法自动确定对于前景（信号）和背景（噪声）的像素的最佳分离成两个组具有最低的统计差异在给定的信道的强度阈值，从而产生一个二进制图象17。这里，大津算法被应用到原始图像的自然对数的版本，即：
对于大津输入图像= LN（输入图像）
这适用于荧光图像更好，因为大津算法可以识别昏暗的细胞作为背景。加入的对数函数允许更好地分离细胞和背景分成两个不同的类别由大津的算法。然而，单独强度阈值是不够的，精确地检测单个物体。它的工作原理有效地检测图像中的良好分离的物体时，但它不足以单独的单细胞位于簇内。由于一些细胞类型的进行的，我们的兴趣，如嗜酸性粒细胞或B细胞，常常聚集在一起，在组织中，它们在信道的DAPI细胞核使用基于第k-means聚类的强度直方图其中k = 10 21的一个算法进行分割细胞分割算法将绘制最亮到最暗像素（集中在10箱），并不断寻找细胞外形酷似物体的形成。这些对象将被定义为细胞。当所有像素已经被使用时，所得到的核被扩张，以产生，然后将其应用到其它信道集群分离的掩模。
应当注意的是，该分析可以很好地用于造血细胞，其结构紧凑，但它是有限的相对于基质细胞，因为它是无法确定这些大，扩散出细胞的边界，由于互连的形成一个网状网络树枝状扩展。因此，细胞计数为基质细胞不能提供的。的基质特异性启动子控制下的标记经由命运映射记者单个细胞将解决此问题，根据什么已发表 了神经元（使用“Brainbow”系统22）和滤泡树突状细胞的标记在淋巴结23。
除了施加降噪步骤所有通道通过排除低于30像素的对象，大小排阻在造血对象识别的方法涂布，但尚未基质细胞。通过切片可以排除被切断的细胞的小碎片;然而，损失可以忽略在此情况下，赞成的明确识别的单元组成。从二到三个维度延伸的分析和模拟将克服此限制。方法的开发，研究在整个坐骑细胞分布， 例如，通过多光子显微镜或光片显微镜/ SPIM，将在日一定的帮助是尊重。为了研究多组分龛的复杂的细胞组成，它也将成为必要延长被就地被分析参数的个数。有前途的方法对与流式细胞仪定量分析相结合的组织学信息多参数分析近期已发表24，25。
通过定量两个对象的重叠进行接触的分析。直接接触被定义为至少一个像素的重叠。重要的是，这分析是由显微镜图像的分辨率的限制，因此，取决于波长和激发的模式，以及对在显微镜中使用的物镜的数值孔径，及针孔的大小。在此处示出的分析，0.8的NA，20X物镜与荧光组合激发与488，561，594，并使用一个光子激发633nm的施加。因此，横向分辨率之间的值0.372和0.483微米得以实现。这允许断言来进行关于各种细胞亚群的并置;然而，它不提供有关参与的细胞相互作用的推定分子机制的任何信息。此外，还需要有其他的方法，例如双光子活体显微镜，以改善这些细胞间接触9的表征。福斯特共振能量转移（FRET）的系统可以帮助确认是否这些相互作用实际上是功能26。
为了评价组织龛的细胞微环境，它不仅是至关重要的，分析的直接细胞接触，但也以量化的细胞类型中的感兴趣的特定细胞类型（“附近的分析”）的附近。以前发表的测定细胞和组织结构之间的距离研究，例如基于该核27的位置的血管。既然我们有兴趣determin荷兰国际集团的各种细胞类型的具有不同核的比率细胞质体积的距离，部分地，我们优选以测量表面之间的距离。为了达到这个目的，我们通过确定从微米转换值PX之后从cell's边界的欧几里得距离算出的附近半径。欧几里得距离是两个像素，并且可以由式28来描述之间的直线距离： 
细胞与它们的边界的例如的欧几里德距离，为10μm距离的一个目标小区的边界中的像素内的像素被计算为邻近该细胞。
在其当前形式中，该分析只确定一个细胞是否被接触或由相同或不同类型的另一种细胞接触，从而提供了仅一个二进制YES / NO表征。细胞的实际数看得太从它与感兴趣的细胞或有一定的半径范围内，不计算。下一步骤将是扩展当前分析中可以被检测，并且在同一类型的不同的靶细胞之间比较接触或相邻小区的组的大小的方法。这将导致约骨髓龛，如生存利基骨髓浆细胞，其中造血辅助细胞的变化的贡献已经讨论29-33的组合物的重要的附加 信息。
物体识别算法进行了优化，再加上使用他们的商用定制的解决方案和服务，可应要求提供从Wimasis专家。另一种选择是，以使用图像分析，如Definiens的，Volocity，或者了Imaris，或免费软件如CellProfiler市售的软件。
该自动细胞分割和图像分析工具，我们重新验证通过他们的结果与两个参数，即对象大小和细胞的各种细胞群体的数量提供了6相对于训练有素图像评价者手动分析的数据进行比较。 如图3B所示 ，对造血细胞（如PC，嗜酸性粒细胞和B细胞）的平均对象大小是这两种方法之间的相似，具有手动尺寸确定为浆细胞和嗜酸性粒细胞更高的方差，可能是由于它们的更不规则的形状相比到B细胞。细胞数的自动检测，得到比手动检测那些稍低的值。值得注意的是，他们仍然在嗜酸性粒细胞和PC的情况下，手动值的范围内，而它们均低于在B细胞的情况下，这些值，可能是由于较高的异质B220的表达，将其用作标记对于B细胞。 B220是已知的上调时在骨髓B细胞分化，和B细胞具有低以及高我ntensity染色B220可以观察到。 B细胞具有低B220信号跌破施加的阈值，这可能导致的最早阶段的B细胞的排斥。用于自动检测门槛较低可能会解决这个问题。对于基质细胞，这是由于他们比较小巧，更树枝状更难检测，并延伸出的形态，人工检测导致个别评级机构之间的高差异。有趣的是，基质的平均总面积相对于自动确定的总面积，这表明在分析非常适合于补偿各个偏压由评价者。总之，这些数据表明，该自动化结果一般表示手动分析的平均值，并非常适用于减少者间变异性的分析。
为了区分内的组织的结构的限制单元的随机和非随机定位，一个模拟工具被开发了。杜尔荷兰国际集团的模拟，人工图像随机定位的造血细胞的每一个记录的骨髓组织的形象创造。首先，信道间质图像被用在其原始格式。掩模从所述的DAPI图像生成通过施加一个固定的基于强度的阈值，从而将图像转换成二进制格式;二进制掩模然后进行多个步骤的基于像素的膨胀和腐蚀。掩模定义了允许模拟细胞被放置在图象场的区域。由一个均匀的随机数发生器被设置在模拟的单元的中心的坐标，其边界，其中由所述图像尺寸确定何处。有关细胞数和平均泡孔尺寸为通过所记录的图像的自动图像分析确定的各人口信息被用来定义在模拟造血细胞群。模拟气泡直径被假定为遵循一维高斯分布从其中实际泡孔直径是随机选择的：直径然后修饰使得细胞大小切取舍为允许的最小对象尺寸进行了介绍。在情况下，模拟的细胞将被定位成使得一个或多个像素重叠的无去区或将是从另一个已经放置细胞（4微米，从中心到中心作为记录图像确定的），新的随机坐标的预定距离内将被选择，而直径保持不变。这将重复进行，直至模拟的细胞的数目等于小区中所记录的图像的数量。
该工具是基于这样的假设的造血细胞可自由骨髓内被定位，而基质结构充当组织内的固定矩阵。该工具被优化，以在那里实质区由正弦的复杂系统交叉的情况中的骨髓。类似的建模方法最近被Frenette和同事发表以分析的造血干细胞的定位相对于基质细胞和血管结构，从而弥补了约30％的总股骨骨髓体积25。为了校正这种效应，仿真工具这里提出是基于区域的掩模被允许细胞被放置。这是通过使用核染色图像，其中表示细胞核中的对象是由5步扩张膨胀来实现（参见图6）的二值化之后。具有低的细胞密度， 即，晶核如骨和正弦的密度低，区域将不向掩模，因此，成为不通过的区域。为了避免人为减少这些由扩张过程不走领域中，有5步骤侵蚀随后施加，从而重新打开更大的排除区域，而在离开高核密度（因此“允许”）的区域不变。这种方法可以容易地适用于其他淋巴器官。在这些吨问题是这种方法可能无法正常工作（ 例如，在地区的细胞具有高细胞质/细胞核比例存在），其他方法，如细 胞质标记可用于创建掩膜。
造血细胞被模拟为圆形物体，其尺寸通过使用高斯随机数发生器，它的意思一致与每个细胞类型的计算的平均直径确定的。该分布的宽度是根据如通过图像分析软件来确定记录图像测定细胞大小分布。为了考虑到小蜂窝片段被排除在自动图像分析，细胞大小的截断引入作为从每种细胞类型的测量的小区尺寸分布来确定（参见图5）。
自然，这非常适用于那些在它们的尺寸和形状相对均匀的，但可能会导致问题的细胞中一个的情况下的细胞类型再相对于这些参数高度异质性。应当注意的是，这分析是在骨髓（粒细胞，造血祖细胞和淋巴细胞）中的主要的造血细胞类型，其具有的共同之处在于它们具有有规律的，近圆形形状优化。但是，这种方法还没有被测试的树突状细胞或巨噬细胞，强烈地与不规则细胞体的细胞类型。分析这些细胞将提出了新的挑战，以我们的自动图像分析以及对模拟方法，包括需要改善的细胞群分离算法24，以及详细的形状的分析和仿真不仅不同尺寸的，而且不同形状的细胞。另一种方法是模拟方法，具有确切形状，记录工作。然而，必须注意的是，这种方法会显著增加模型系统的确定的行为。
为模拟EXPEriments，产生了1000次重复模拟，每拍摄的影像的。使用这种多次重复将减少贡献的模拟过程本身的相对误差约3％。即，如果该细胞-细胞共定位值从模拟，是随机的计算，则该模拟过程本身的特点将是一个N -1/2误差函数，其中N是每个测量图像的模拟数。这是通过模拟过程本身所测量的共定位的值的累积误差的贡献。因此，对于N = 1000的贡献误差为3.16％。这里显示的模拟运行了20至每幅图像60分钟每1000次重复当时只有保存模拟图像作为.rect文件（一个简单的文本格式），而不是实际的图像或.JPEG格式.TIFF（也可以在软件的选择）。
总之，这种方法允许一个不带偏见，高通量的组织学图像分析s和允许的统计学相关的数据的生成。这可能是在不同的条件下进行比较细胞定位是有用的。此外，可以在将来的时间分量被集成到的骨髓细胞的运动建模方法，随着越来越多的数据对各种细胞类型的骨髓中的蠕动变为可用。该方法然后可以用于模拟系统中，扰动如细胞的动员从骨髓进入循环， 例如，在急性炎症34的情况下，嗜中性粒细胞。为了进一步阐明骨髓作为存储地点免疫记忆细胞的功能，可以还想象延伸到模型生存竞争的因素。此外，不同的壁龛之间可能的串扰是可以解决的，以及龛的诱导。总之，这将有助于理解的生理变化（ 如触发器在干细胞再生的行为）为WELL作为系统的自身免疫疾病，瘤形成，或急性炎症的情况下病理扰动作为一个整体，例如。作为实验和建模的迭代概念的一部分，可以基于模拟，这反过来又可以再次进行实验测试来产生新的假设，从而有助于进一步理解各种细胞类型的内组织的复杂的功能和交互。
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Acknowledgments
我们感谢安德烈亚斯·拉德布鲁赫的有价值的讨论。我们感谢萨宾Gruczek，帕特里克Thiemann和曼努埃拉Ohde援助与动物护理和罗伯特·冈瑟优秀的技术援助。我们感谢我们训练有素的评价者劳拉OEHME，Jannike巴亚特（Bayat） - Sarmadi，Karolin模特肖像权，卡特琳·罗斯，佛罗伦萨帕什和卡塔琳娜喇叭的组织学样品的评估和兰迪·林德奎斯特的手稿校对。我们感谢J.和N·李，梅奥诊所，斯科茨代尔，亚利桑那州，美国的MBP特异性抗体。
这项工作是支持的DFG HA5354 / 4-1，以JIMI - 一个用于活体显微镜DFG核设施网络补助和TRR130 / TP17和DFG FOR 2165（HA5354 / 6-1），以AEHSZ由国际马克斯·普朗克支持学校传染病和免疫（次展示-IDI），柏林。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neomycin |  Sigma |
N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08 |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) | Sigma |
P4333, H3375 | |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland |
D602-0100 | |
| 20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-sucrose | Carl Roth |
4621.1 | |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma-Aldrich |
179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07 |
| Hexane | Sigma-Aldrich |
208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09 |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura |
4557 | 25 x 20 x 5 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura |
4583 | |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP |
||
| Microtome blade MX35 premier plus, low profile | Thermo Scientific |
3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01") |
| Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland |
600-406-379 | |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies |
S-32355 | |
| Rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies |
A-21247 | |
| Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| Mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| Rat anti-k light chain - FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma |
D9542 SIGMA | |
| Fluorescent mounting medium | DAKO |
S3023 | |
| Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth |
H875.2 | |
| Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) | VWR |
48311-703 | |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich |
The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request. | |
| VC2012 runtime | Microsoft | free download | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download) | ||
| Fiji image analysis software | free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
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