En Time Differential Målningsteknik Tillsammans med Full Bilateral Gill denervering att studera Ionocytes i Fish

Abstract

Branchial ionocytes (IC) är de funktionella enheter för jonisk reglering i fisk. Hos vuxna, de finns på filamental och lamellär epitel av gill där de transport joner såsom Na ^+, Cl ^- och Ca2 ⁺ via en mängd olika jonkanaler, pumpar och värmeväxlare. Den teleost gill är extrinsically innerveras av den ansikts (VI), glossofaryngeal (IX) och vagus (X) nerver. De IX och X nerver är också den yttre källan branchial IC innervation. Här används två tekniker som används för att studera innervation, proliferation och distribution av IC beskrivna: ett tidsdifferentialfärgningsteknik och en fullständig bilateral gill denervering teknik. I korthet är guldfisk utsätts för en vital mitokondrien specifik färgämne (t.ex. MitoTracker Röd) vilka etiketter (röd fluorescens) pre-existerande IC. Fisk antingen fick återhämta i 3 - 5 dagar eller omedelbart genomgick en fullständig bilateral gill denervering. Efter 3 - 5 dagars återhämtning, gills skördas och fastställts för immunohistokemi. Vävnaden färgades sedan med ett α-5 primär antikropp (mål Na ⁺ / K ⁺ ATPas innehållande celler) i samverkan med en sekundär antikropp som märker alla (både nya och existerande) IC grönt. Använda konfokal avbildning, visades att befintliga IC verkar gula (märkt med både en livskraftig mitokondrien specifik färgämne och α-5) och nya IC verkar grönt (märkt med α-5 endast). Båda teknikerna som används i tandem kan tillämpas för att studera innervation, spridning och fördelning av IC på gill glöd när fisken exponeras för miljöutmaningar.

Introduction

IC är den funktionella enheten för jonisk reglering i fisk och finns på epitelytor hos gälar trådar och lameller ^4,6-8,10. Även om en mångfald undertyper har beskrivits som besitter unika egenskaper, många av de IC kännetecknas av en hög täthet av mitokondrier (alltså de är också kända som Mitochondrion rika celler) och / eller ett överflöd av enzymet Na ⁺ / K ⁺ ATPas (NKA). Typiskt är dessa IC hus en mängd andra pumpar, jonkanaler och växlarna involverade i jon reglering (t.ex. Na ⁺ / H ⁺ växlare, Na ⁺ / Cl ^- sam-transportör, H ⁺ pump) ^2,10,11. Den omfördelning och spridning av IC som en kompensationsmekanism är central för att upprätthålla jon homeostas särskilt under jonisk stress (t.ex. exponering för jon fattiga vatten) ^4,8,9.

Denna studie beskriver en tidsskillnad färgning tekque ¹ identifiera nya förökade ionocytes (IC) i fisk gälar. Denna teknik är kopplad till en fullständig bilateral denervering av gill bågar. Goldfish (Carassius auratus), de arter som används i dessa studier, är väl lämpad för att studera spridningen av bottengarn epitelceller eftersom de har en märklig förmåga att strukturellt omforma sina gälar ^2. Gill remodeling hänvisar till tillväxt eller tillbakadragning av en interlamellär cellmassa (ILCM) när fisken (normalt hålles vid 15-30 ° C) är acklimatiserade till kallt vatten (<15 ° C) eller hypoxi, respektive ^3. Tidigare studier med hjälp av tidsskillnaden färgningsteknik på guldfisk har fokuserat på omfördelning, innervation och spridning av IC på gill i samband med gill remodeling ^4,5. Katoh och Kaneko ¹ utvecklat denna nya teknik för att studera omvandlingen och ersättning av branchial IC i killifish (Fundulus heteroclitus) överfrred från havsvatten (SW) till färskvatten (FW). I denna studie ligger fokus på spridningen och innervation av IC i guldfisk acklimatiserad till 25 ° C.

Använda tidsskillnaden färgningsteknik visades att, inom ramen för gäl ombyggnad, guldfisk upprätthålla ett konstant antal IC under hypoxisk exponering och efterföljande normoxisk återhämtning, dock andelen innerverade celler minskade under normoxisk återhämtningsperioden ^5. Det föreslogs mer än 70 år sedan som joniska upptagsmekanismer i fisk är under neural styrning ^12. Den teleost gill innerveras av de ansiktsbehandling (VII), glossofaryngeal (IX) och vagus (X) nerver också kallas de "branchial nerverna" ^13,14. Studier av Jonz och sjuksköterska (2003) på sebrafisk (Danio rerio) gill innervation visade att ursprunget till innervation är yttre (cellkroppen av nervfibrer är yttre till gill) samt inneboende (cellkroppnervfibrer är inneboende i gill). Samma författare visade också att branchial IC är extrinsically innervated ^7.

I denna studie var tiden differentialfärgningsteknik i kombination med full bilaterala gill denervering används för att undersöka spridningen av IC som saknar yttre innervation i guldfisk. Full bilaterala gill denervering avser avskilja kranialnerver IX och X. Dessa två tillvägagångssätt är möjliga i guldfisk eftersom deras relativt stora storlek (30-200 g) förenklar den känsliga kirurgiska ingrepp, och ionocytes lätt genom användning av normala immun histokemisk tekniker. I föreliggande studie var IC visualiserades med användning av en vital mitokondrien specifikt färgämne (t.ex., MitoTracker Red) eller en primär antikropp mot α-subenheten av Na ⁺ / K ⁺ -ATPas (α-5; Develop Studies Hybridoma Bank, University Iowa, Iowa City IA). Protokollet ger en enkel metod för att visualisera och analysera omfördelning och spridning av IC på fisken gill.

Protocol

Båda protokollen överensstämde med riktlinjerna i den kanadensiska Rådets Djurvård (CCAC) och genomfördes med godkännande av universitetet i Ottawa Djurvård kommittén (protokoll BL-226).

1. Tids Differential Målningsteknik: Mitochondrion rika Dye Bath

1. Bered en mM MitoTracker Red förrådslösning genom att lösa 50 pg i 94,0 | il dimetylsulfoxid (100% DMSO). Förvara stamlösning i mörker vid -20 ° C när de inte används. Undvik frysning / upptining.
2. Förbered mörka boxar (3-6 lådor) med en maximal volym på 600 ml. Fyll i rutorna med 400 ml Vatten (vatten fisken hålls normalt i) och placera en luft sten i varje ruta för att utgöra en källa för _O2. Skaffa guldfisk (30-40 g) och placera dem i lådor med 400 ml vatten och en luft sten. Efter 30 minuter, tillsätt den viabla mitokondrien rika färgämne för att ge slutliga koncentrationer av 0,1 ^ M och 0,01% DMSO. Bada fisken i 4 timmarr.
   1. Om dessa är kontroll fisk (dvs ingen denervering), slå på vattenflödet till rutorna, tillåta färgämnet att spola ut och återvinna fisk för den tid delas i protokollet. Fiskar är vanligtvis återvinns i 3 - 5 dagar.
3. Efter återhämtningsperioden fortsätt till Avsnitt 3: Tid Differential Målningsteknik: Immunhistokemi. Om dessa fiskar ska denerverade fortsätt till Avsnitt 2: Full Bilateral denervering ordningen.

2. Full Bilateral denervation Procedur

1. Skaffa 1 par elev Vannas våren sax (böjda), 1 par vanliga mönster pincett-raka, 1 par vanliga mönster pincett-böjda, 2 par No. 5 pincett, 1 par vävnads upprullningsdon små bomullstussar (1 - 2 mm i diameter), och bomullspinnar (Q Tips eller motsvarande).
2. Förbered anestesi vattenbad. Först upplöses 10 g bensokain till en slutvolym av 100 mlav 99% etanol för att framställa en stamlösning. För att förbereda narkos vattenbad, upplösa 15 ml av stam bensokain lösningen i 30 liter kolsyrat systemets vatten vid önskad temperatur. Vädra vattnet genom att placera en luft-stone ansluten till en luftpump eller en central air-line i vattentanken.
   1. Placera fisken i anestesi vattenbad (Figur 1A).
   2. När andningen har upphört, placera fisken på en operation bord och intuberas den som visas i figur 1B. Gör detta genom att sätta in ett rör i sin munhålan att bevattna gälarna med luftad bedövningsmedel lösning. Bevattning av gälarna säkerställer att fisken matas med en tillräcklig mängd av O ₂ och bedövningsmedel under denervering förfarandet. Placera fisken så att huvudet lutar något nedåt. Detta möjliggör bättre tillgång till området bakom den fjärde gill bågen.
3. Lyft försiktigt kapseln med de raka standardmönster pincettoch placera vävnaden retraktorer mellan kapseln och insidan av huvudet. Öppna försiktigt vävnads upprullningsdon att hålla gällocket borta från huvudet och hålla gälarna utsatta.
4. Se till att narkos lösningen bevattning gälarna under denna procedur. Vila upprullningsdonet hanterar bredvid huvudet som ger tillgång till alla fyra bottengarn valv.
5. Placera de böjda standardmönster pincett mellan den fjärde gill valv och baksidan av huvudet och försiktigt öppna dem för att skapa spänning i ligamentet fäster fjärde gill valv till huvudet. Med ett par av nr 5 pincett skapa en liten öppning (2-3 mm) genom att genomborra epitelet ansluter den dorsala änden av gäl valv till opercular kaviteten. Var noga med att inte gå in för djupt eftersom det finns risk för att skada ett större blodkärl.
6. Med en liten bomullstuss som hölls med nr 5 pincett långsamt och försiktigt expandera snittet att exponera IX (glossofaryngeal) och X (vagus) nerver. Gratis förnerver från någon bindväv med hjälp av No. 5 pincett, återigen noga med att inte skada blodkärl.
   OBS: Den branchial IX och X nerver i guldfisk vila djupt bakom den fjärde gill båge och är i närhet till stora blodkärlen som matar in gälen bågar.
7. När nerver har identifierats användning de böjda fjäder sax för att noggrant skära nerverna medan du håller snittet öppen med de böjda vanliga formen pincett. Efter avskiljande nerverna, försiktigt dra tillbaka de böjda pincett. Det finns ingen anledning att stänga snittet med suturer eftersom epitel är mycket tunn och snittet stängs oftast på egen hand inom 24-48 timmar. Ta vävnadssårhake.
8. Upprepa samma procedur på den andra sidan av huvudet.
9. Slå bevattning av gälarna från bedövningsmedel till frisk kolsyrat vatten för att återhämta sig fisken från anestesi. När opercular rörelser har återupptagits flytta fisken i experimentella tankar att återhämta minst 24 tim.

3. Tid Differential Målningsteknik: Immunhistokemi

1. Först förbereder 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 4 g PFA i 96 ml PBS). PFA inte löses lätt i PBS vid RT. Värm lösningen i ett vattenbad för att upplösa PFA. Utför detta i ett dragskåp. När PFA är i lösning låt svalna före användning. Förvara vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
2. Innan euthanizing fisken och extrahera gäl vävnad, placera 3-4 ml 4% PFA i en scintillationsflaska för totalt 8 scintillationsfläskor (1 flaska per gill arch). Dessutom tar en liten väger båt och fyll den med 1x PBS. Detta kommer att användas för att tvätta vävnaden efter att den har skurits ut. Håll alla lösningar på is.
3. Efter livskraftig mitokondrien rika färgexponeringexperimentet är klar, euthanize guldfisk genom att placera den i ett vattenbad med en överdos av bensokain.
4. Använd trubbig pincett för att lyfta operculum på ena sidan av huvudet och böjd sax för att skära varje ände av brankiala gäl korgen. Plocka försiktigt upp gälarna av de rakers använder trubbiga pincett och lyft dem ur opercular hålan. Tvätta omedelbart gälarna i iskallt 1x PBS för att avlägsna överskott bensokain och blod.
5. Placera utskurna gälar i separata flaskor (en injektionsflaska för varje gill båge) fyllda med 4% PFA och fixa O / N vid 4 ° C.
6. Efter fixering, tvättas överskottet PFA i 1X PBS och placera vävnaden i en 2 ml kula rör fyllt med 1,5 ml av 1% Triton-X på en skakare under 6 h vid RT eller O / N vid 4 ° C. Detta steg permeabilizes vävnaden. Om hela gill är för stor för att placera in i ett 2 ml rör sedan skära vävnaden i sektioner små nog att passa röret noga med att inte skada trådarna.
   1. Förbered de primära spädantikropps av Mixing 4 pl av stamlösningen av varje primär antikropp (totalt 8 ^ il) i 992 ^ il 1 x PBS. Se till att NKA (etiketter NKA-rika celler) och Zn-12 (etiketter nervceller) primära antikroppar har uppkommit i samma värd. Detta är viktigt om forskarna väljer att identifiera specifika IC subtyper samtidigt som de kommer att behöva använda primära och sekundära antikroppar som tagits upp i en annan värdarter.
   2. Avlägsna Triton-X-lösning och utan att tvätta vävnaden till en 1: 250 spädning (utspädd i 1 x PBS) av en NKA monoklonal antikropp (α-5) för att detektera NKA-rika celler och en zebrafisk specifik neuronal antikropp (Zn-12) att detektera nervfibrer (primära antikroppar) och inkubera på en skakare under 6 h vid RT eller O / N vid 4 ° C.
7. Tvätta den primära antikroppen tre gånger för 3 min vardera med användning av 1 x PBS. För att göra detta, ta bort den primära antikroppen lösningen från röret genom att suga ut det med hjälp av en pipett.
8. Förbered sekundär antikropp vid en1: 200 späd genom att blanda 5 ìl av lager sekundär antikropp i 995 pl 1x PBS. Applicera sekundär antikropp (Alexa Fluor 488) och inkubera under 6 h vid RT eller O / N vid 4 ° C på en skakapparat.
   OBS: MitoTracker Red är upphetsad på en ~ 594 nm våglängd och kommer fluorescerar rött. En sekundär antikropp som exciteras vid en ~ 488 nm våglängd och fluorescerar grönt måste användas för att märka NKA och Zn-12 primära antikroppar.
9. Avlägsna överskott sekundär antikropp genom tvättning av vävnaden tre gånger under 5 min vardera (såsom beskrivs i steg 3.7).

4. Imaging

1. Efter tvättar, montera vävnad på en konkav bild för hela montera konfokal avbildning av celler och nervfibrer. För att montera den vävnad, först placera den i en droppe (200 | il) av 1 x PBS på ett plant mikroskopobjektglas. Detta säkerställer att vävnaden inte uttorka.
2. Separera gäl hemibranchs med de böjda mikro-sax. Placera en droppe 1x PBS och en droppe monteringsmedia till en konkav slide.
3. Placera de separerade hemibranchs in i den konkava glid med framkanten av filamentet uppåt och täck med ett täckglas. Dab kanterna på täckglas med nagellack för att förhindra locket glida från att röra sig runt och förskjuta vävnaden. Låt vävnaden sedimentera till botten av den konkava objektglas för 10-15 minuter innan avbildning.
4. För varje gill båge, väljer sex bottengarn trådar på måfå för avbildning, producerar sex bilder per gill båge. Använd konventionella konfokalmikroskopi till bilden vävnaden genom att ta 1 - 3 ìm optiska skivor.
   OBS: Alla redan existerande celler kommer att märkas med MitoTracker Röd och positivt för NKA visas gult bara. Celler som bara ser röda är pre-existerande IC som inte innehåller NKA. Alla nya frodats cell kommer endast att vara positivt för NKA och visas grön bara. Nervtrådarna visas också grönt.

5. Bildanalys för Ionocyte Kvantifiering

1. För each gill filament som har avbildats, kvantifiera IC och tillhörande innervation genom att bläddra igenom de avsnitt i Z stacken och räkna antalet lamellära och filamental IC närvarande och huruvida de är nyligen differentierade, redan existerande, och / eller innerverad .
2. Kvantifiera ICS per filament eller per område ^(mm2) av filament. Gör detta genom att använda ritverktygen i samband med den programvara som används för att förvärva de bilderna för att beskriva lamellerna av glödtråden omfattar området tråden där IC kvantifierades. De flesta konfokala imaging program har möjlighet att beräkna area av ett skiss region på bilden. Använd alternativet i bildbehandlingsprogram som tillåter dig att göra detta för att få området.
3. Fördela de räknade IC av området beräknas av programvaran för att få ett mått på IC per ytenhet (t.ex. per mm ^2).

Representative Results

Figur 1 illustrerar operationen tabell som fastställs (Figur 1A), placeringen av fisken under kirurgi (Figur 1B), och de tre viktigaste stegen för tidsdifferentialfärgningsteknik (Figur 1C). I steg 1, är fisken bevaras under 30 min i en väl luftad vattenbad vid 25 ° C i mörker. Under 30 minuters period, kan forskaren förbereda mitokondrien rika färgämne alikvot i DMSO som sättes till vattnet under Steg 2 (Figur 1C). Inkubationstiden i Steg 2 möjliggör upptag av mitokondrien rika färgämne från vattnet i mitokondrien rika celler (dvs IC). Fisken kan sedan antingen genomgå det fullständiga bilaterala denervering förfarande eller en bluff förfarande där fisken bedövas och opercula manipuleras men nerverna förblir intakta. Den inrättades i steg 3 representerar en återhämtning kammare försedd med rinnande vatten för en fisk som har either genomgått fullständig bilateral denervering eller ett förfarande "bluff".

Efter återhämtningsperioden, var fisken avlivas och gälarna skars och fastställts för immunohistokemi. Den totala fördelningen och innervation av IC på Gill filament av en fisk som hade genomgått en procedur "bluff" visas i figur 2. ICS finns på den filamental epitel samt vid basen av de interlamellära regioner visar Figur 2A. redan existerande IC märkta med mitokondrien rika färgämne (dvs, fanns dessa IC innan denervering / sken procedurer utfördes). Figur 2B visar nervfibrer innervating de redan befintliga och nybildade IC (identifieras av NKA immunreaktivitet) hos filamental och lamellär epitel. Slutligen sammanslagning av de två bilderna (figur 2C) tydligt avslöjar befintliga IC (visas gul) och de nya integrerade kretsar (visas grön).Figur 2D är en representativ kurva av IC-kvantifiering för glöd avbildas i fig 2A-C. På detta specifika filament, verkar det finnas ett större antal nya förökade IC per mm ² än pre-existerande IC (N = 1). För att ta bort källan till yttre branchial innervation ades IX och X kranialnerver (extrinsic innervationsområden) avskurna. Figur 3A visar rygg regionen av opercular hålrummet efter gälar trådar och epitel täcker nerverna avlägsnades för att exponera IX och X kranialnerver (indikerade med romerska siffror), som spänner från två stora nervstammar att innerverar alla fyra valv (Figur 3A); Gill valv är numrerade 1 till 4. Figur 3B-E illustrerar selektiv denervation av första gäl bågen. Den första gill båge innerveras av både IX och X kranialnerver (Figur 3B), vilka kan avlägsnas utan att påverka innervation till resten of de gäl bågar (Figur 3C-E). Full bilaterala denervering leder gradvis förlust av yttre innervation till de gäl trådar (Figur 4A-C). Kontroll fisk uppvisar en uppenbar nervknippen som sträcker sig över längden av filamentet (Figur 4A). Full bilaterala denervering medfört en viss förlust av yttre innervation efter 2 dagars återhämtning (Figur 4B). Ytterligare försvinnande yttre innervation noterades efter 5 dagars återhämtning från denervering (Figur 4C). Eventuellt kvarvarande innervation till IC efter 5 dagars återhämtning förmodligen härrör från nerver med cellkroppar inom gill glödtråden (inneboende innervation; Figur 4C).

Figur 1. Experimentell inrättas för denervering förfarandet och stegsekvens som används itidsdifferens färgningsteknik. (A) Kirurgi tabell för denervering förfarandet visar anestesi och återvinningstankar. (B) Exempel på placering av en nedsövd, intuberad fisk. (C) Viktiga steg som används i tidsskillnaden färgningsteknik. I steg 1, är fisken placeras i ett temperaturreglerat, statisk luftad vattenbad under 30 minuter. Mitokondrien rika färgämne tillsätts i steg 2 till en slutlig koncentration av 0,1 pM och fisken tillåts bada i lösningen under minst 4 h. Vattenflödet startas i steg 3 vid vilken punkt fisken genomgår antingen en fullständig bilateral denervering av gill eller en bluff operation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

/>
Figur 2. Ljus micrographs representerar skillnaden i tid färgningsteknik i en guldfisk (acklimatiserade till 25 ° C) 2 dygn efter full bilateral denervering. (A) Fördelningen av befintliga ionocytes (IC, pilar). På ett enda gill filament avslöjas av mitokondrien rika färgämne färgning (B) Fördelningen av IC (nya och redan existerande) och branchial nerver (streckade pilar) avslöjas genom färgning med α-5 och Zn-12-antikroppar, respektive. Pilarna anger IC (C) Överlappningen av (A) och (B) skiljer redan existerande IC. (Ser gulaktiga, angiven med pilhuvuden) från nyligen förökade IC (visas grönt; anges med pilar). Sätt i (C) är en förstoring av en innerverad befintlig ionocyte. (D) Representativa diagram över IC-kvantifiering för glödtråden som visas i paneler (AC). N = 1. Skala bar i panelen (C) är 50 pm och gäller alla paneler./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Representativa bilder som skildrar olika skeden av gill innervation. (A) Dorsal bild av munhålan visar IX och X kranialnerver innervating alla 4 gill valv. Gill valv är numrerade 1-4. Gill filament och vävnad som täcker nerverna avlägsnades för att bättre visualisera innervation. (B) Den ^{1: a} och ^{2: a} gäl valv separeras för att avslöja sinnesorgan och grenar IX och X kranialnerver innervating den ¹ gill båge. (CE) Sekvens av bilder som visar den selektiva denervering av den ¹ gill båge genom att bryta grenar av IX och X kranialnerver. För en schematisk representation av gäl innervation av teleost fisk, se figur 1 i Milsom et al ²⁶ De vita linjerna i bilderna är vatten reflektion från mikroskopet ljusen. att de inte definierar någon morfologiska strukturen. Skala bar i panelen (E) är 4 mm och gäller för alla paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Ljus micrographs skildrar fördelningen och innervation av ionocytes på en glödtråd av den ^1: a gill båge av en guldfisk acklimatiserade till 25 ° C. Ionocytes (anges med pilhuvuden) färgades med α-5 antikropp och nerver (indikerade by pilar) färgades med zn-12 antikroppar. (A) Gill filament av en kontroll fisk som uppvisar en central nerv bunt förmodligen härrör från IX och X nerver (extrinsic innervationsområden) med omfattande lamellär förgrening. Några av ionocytes angivna också innerveras (insert). (B) En gill filament 2 dagar efter full bilateral denervering. Det fanns en minskning av den centrala nervknippet medan lamellära innervation verkade i stort sett intakt. (C) En gill filament 5 dagar efter full bilateral denervering visar att yttre innervation var i stort sett frånvarande. Kvalitativ analys tyder på att fullt bilaterala denervering orsakar nedbrytning av yttre gill innervation bibehållen nerver med cellkroppar inom gill glödtråden (inneboende innervationsområden) skapa ett nätverk av nerver genom tråden och in lamellerna. Vänligenklicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Tiden differentialfärgningsteknik kan vara ett användbart verktyg för att förstå den dynamiska reglering av jon upptag och undersöka den tidsmässiga omfördelning av IC i gill epitel. Även en enkel procedur, det finns ett antal viktiga punkter som är avgörande för framgången för tidsskillnaden färgningsteknik. Guldfisk måste utsättas för mitokondrien rika färgämne för den tid som avsatts i protokollet. Kortare exponeringar kommer att resultera i dålig upptag av färgämnet från mitokondrien rika celler (dvs ionocytes). Under fixeringen måste gäl vävnad excideras snabbt och hållas i mörker för att undvika fotoblekning. Vävnaden måste bearbetas för avbildning inom 2 veckor fixering. Under det bilaterala nervsektioneförfarandet se till att fisken är väl bedövad; nerver och blodkärl är tydligt identifierade; och fisken återupptar fullt opercular funktionen innan den flyttas till en återvinningstank.

"> Den FW miljö presen fisk med den dubbla utmaningen att balansera passiva jon förluster och osmotisk vatten vinna ^14. Avvägningen av passiva jon förluster sker via aktiva upptaget av salt över IC som är lokaliserade till filamental och lamellär epitel där de kan ta direkt kontakt med den yttre miljön ^2,4,8,9,16. Dock är inte statisk placeringen av IC på gill. Under de senaste tre decennierna ett antal studier har visat att flera FW fiskarter, när man står inför med en jonisk och / eller temperatur utmaning, omfördela branchial IC från filamentet eller basen av lamell till de mer distala regionerna av lamellen ^{1,2,4,5,17-21.} Sådan omfördelning kan öka tjockleken på lamellerna som kan äventyra gas överföring (O _2, CO ₂₎ över gill epitel ^22. Forskare har använt tiden differentialfärgningsteknik som beskrivs i detta manuskript för att spåra flytten och emergence av nya IC på gill epitel under dessa olika experimentella förhållanden (Figur 1C) ^1,4,5.

Gälarna, och förmodligen de branchial IC, är innerveras av IX och X kranialnerver ^7,23-25. Dessa nerver bära både efferent och afferenta ingångar till och från Gill, respektive. De ligger på ryggsidan av munhålan bakom ^{4: e} gill båge. Tillgängligheten av nerver och den lätthet med vilken kan utföras den bilaterala denervering förfarandet är artspecifik. I öring, till exempel, den spetsiga och tillplattas anatomi av huvudet tillåter för nerverna att ligga i ett enda plan bakom ^{4: e} gäl båge under ett tunt lager av vävnad. Detta gör nerverna synliga och lättillgängliga för forskaren att utföra denervering förfarandet. Däremot guldfisk ha en kortare nos och en rundare huvud. De IX och X kranialnerver av guldfisk ligga djupare in i rygg side av hålrummet efter den ^{4: e} gill arch ockuperar olika plan. Denna orientering begränsar lättillgänglighet på nerverna och kräver en mer noggrann metod för att identifiera och avskilja lämpliga nerverna. Syftet med denervering förfarandet är att avlägsna sensorisk afferent och efferent ingång till och från Gill, respektive. Denervation av gäl bågarna kan även kopplas med jonflöde experiment med användning av radioisotoper (t.ex. ²² Na). Dessa tekniker kan användas i tandem för att studera bidraget av nervös ingång på jon rörelse över gäl epitel. En annan begränsning till denervering förfarandet är oförmågan att skilja mellan sensoriska och motoriska nervceller, alltså när bryta nerven bunta det är möjligt att båda typerna av innervation tas bort. Avskilja eventuella motoriska nervceller kan påverka gill och opercular rörelse fisken. Således när du utför bottengarn denervering experiment är det viktigt att även övervaka ventilation efterfisk har återhämtat sig från det förfarande för att se till att det finns tillräckligt med gill rörlighet för både gas och jonbyte.

Protokollen i detta manuskript bruk vuxna djur som hålls på en 00:12 ljus: mörker-cykel och utfodrade kommersiella livsmedel pellets. Dessa metoder kan modifieras på flera sätt. Först kan återhämtningsperioden efter mitokondrien rika färgexponering anpassas till de krav som forskarens protokoll (t.ex. 1, 3, 5, eller 14 dagar). Den längsta period av återhämtning efter mitokondrien rika färgexponering i labbet har varit 14 dagar ^4,5. Det var inte en signifikant minskning i intensiteten av fluorescens av mitokondrien rika färgämne efter 14 dagars återhämtning. För det andra, är användningen av α-5 primär antikropp begränsad till endast identifiera NKA-rika celler och skiljer inte mellan de olika subtyper av branchial IC. Lyckligtvis i guldfisk konstaterades att majoriteten av IC är båda mitochondrjon-rika (etikett med MitoTracker) och NKA-rika (etikett med α-5) celler som kanske inte fallet i alla fiskarter ^4,27. Framtida experiment kan fokusera på att följa tids omfördelning av specifika IC subtyper med hjälp av antikroppar riktade specifikt mot en mängd olika kanaler, pumpar och värmeväxlare (t.ex. NHE, H ⁺ pump). Tidigare studier fann att majoriteten av ionocytes färgade med mitokondrien rika färgämne uppvisar NKA immunoreaktivitet ^4. Innervation av IC kan detekteras med hjälp av en primär antikropp mot zebrafisk-härledda neuron-specifikt antigen (zn-12). I denna studie, α-5 och Zn-12 primära antikroppar detekterades genom användning av samma sekundär antikropp (Alexa Fluor 488) för båda. Denna begränsning beror på både primära antikroppar höjs i en musvärd och övervinns av det faktum att NKA-rika celler och nervceller kan särskiljas morfologiskt trots att de fluorescerar i samma färg. Sekventiell färgningmed olika sekundära antikroppar (t.ex., första α-5 med Alexa Fluor 488 sedan zn-12 med Alexa Fluor 594) kan också användas för att eliminera problemet med att ha båda markörerna fluorescerande samma färg. Slutligen kan det fullständiga bilaterala nervsektioneprotokoll modifieras för att rikta nerver till specifika gäl valv. Till exempel kan selektiv nervsektione utföras på det första gill bågen genom att försiktigt separera det första och andra gäl valv att exponera nerver som leder till den första gill bågen på den dorsala änden av glll korgen (Figur 2B-E). Tidsdifferential Tekniken kan också användas för att studera fördelningen av ionocytes i larvzebrafisk fisk som de utvecklas och jon transport övergångar från huden till gill.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MitoTracker Red	Life Technologies	M-7512
Dimethyl sulfoxide	Sigma Alrdich	D2650
α-5 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	a5
zn12 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	zn12
Alexa Fluor 488 (anti mouse)	Life Technologies	A-11001
Benzocaine	Sigma Alrdich	E1501	4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-10
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	straight
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11001-12	curved
Dumont No. 5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
Tissue retractor	Fine Science Tools	17009-07
Paraformaldehyde	Sigma Alrdich	P6148
Triton X	Sigma Alrdich	X100
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200