Abstract
人体皮肤具有重要的屏障功能，并包含有助于从病原体组织稳态和保护各种免疫细胞。由于皮肤相对容易获得，它提供了一个理想的平台，研究外周免疫调节机制。免疫固有细胞在健康的皮肤进行免疫监视，而且还起到炎性皮肤疾病，如牛皮癣的发展中起重要作用。尽管新兴的见解，我们对生物学基本各种炎症皮肤病的了解仍然有限。有必要从皮肤活检样本中分离出质量好（单）的细胞群。到目前为止，隔离程序已经严重缺乏获得足够数量的活菌的阻碍。隔离和随后的分析也已受到的免疫细胞谱系标志物的损失，由于引起的电流离解过程来获得机械和化学应力单细胞悬浮液。在这里，我们描述了一种改进方法，通过使用一种自动组织离解器和胶原酶处理组合机械皮肤分离以分离从健康的和涉及银屑病人类皮肤T细胞。这种方法在单细胞悬浮液的制备保持最免疫谱系标记，例如CD4，CD8，Foxp3的和CD11c的表达。成功的CD4 + T细胞的分离和随后的表型和功能的分析的例子被示出。
Introduction
皮肤，因为身体和环境之间的主要接口，提供了针对外部的物理，化学和生物损伤如伤人，紫外线辐射和微生物防御的第一道防线。皮肤由两个主要隔间，表皮和真皮层，并含有多种免疫细胞包括Langerhans细胞，巨噬细胞，树突细胞（DC），以及约20十亿记忆T细胞，本近两倍的数量在整个血容量1 ，2。数据越来越多支持皮肤有重要的免疫功能，无论是在组织的动态平衡和各种病理状态的概念。驻留在正常皮肤的免疫细胞被认为以进行免疫监视3，并已显示出在炎性疾病如牛皮癣4的发展中的作用。在银屑病皮损部位，CD4 +和CD8 +浸润T细胞OBServed并且它表明CD4和CD8的比例的变化取决于疾病状态5。但是，细胞的这些群体是很难研究，因为现有技术仅允许少数细胞的分离。
从人体皮肤T细胞分离当前广泛使用的技术相结合的机械皮肤解离酶处理。人体皮肤活检被广泛切碎，并与像胰蛋白酶，胶原酶和/或EDTA 6-8酶的培养。考虑到皮肤的阻挡薄纸这对拉力和机械解聚高度抗T细胞分离的确立方法产生非常少的细胞，并且甚至活细胞数目降低，这使得这些细胞群的体外细胞培养困难和具有挑战性的。
在这里，我们报告的改进方法结合mechan隔离来自健康和参与的银屑病人的皮肤淋巴细胞使用自动组织离解，而不是广泛的切碎建立的方法，一起用胶原酶酶消化皮肤的iCal分离。制备单细胞悬浮液后观察到的各种可行的免疫细胞亚群，包括DC和T细胞。重要的是，表面标记CD3，CD4和CD8的表达保存完好。由此制备的细胞，是准备用于体外细胞培养物或流式细胞分析使用。此协议已被成功地用于从牛皮癣患者的皮损衍生的单一皮肤活检（直径4 mm）的分析。结果表明，皮肤驻患者的T细胞产生更多的炎性细胞因子如IL-17和IFNγ在比较健康志愿者9。
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Protocol
注：从发生后科学运用口头或书面的知情同意择期整形手术个人腹部皮肤剩获得来自健康人的皮肤活检。利用人体皮肤的批准，并按照医学伦理委员会的Radboud大学医疗中心，奈梅亨，荷兰和德国埃森大学人类研究机构的规定。
1.准备从人体皮肤的单细胞悬浮液（工作在无菌流柜如果后续细胞培养是必需的）
- 制备细胞培养基：RPMI 1640 +青霉素/链霉素（最终浓度100单位/ ml和100μg/ ml时，分别为）+丙酮酸（0.02毫摩尔）和Glutamax的（0.02毫摩尔），无血清加入。
- 制备完全培养基：在步骤1.1±10％人合并的血清（HPS）中制备培养基;存放于4℃。摆在我们面前把中到20℃±2ING。
- 使用4mm的圆形活检穿孔仪器获得的皮肤活检，并在20℃±2保持在RPMI 1640完全培养基长达4小时或在4℃下为ON。在实验室抵达后尽快处理活检。
注：较长皮肤的存储将影响细胞产量和细胞活力。 - 标签的蓝色皑皑分离管加入5 ml完全培养基到的标记管。
- 加2ml完全培养基的每孔（共3个孔）的无菌的6孔培养板的。用消毒工具活检放入一个单井，冲洗，将其移动到第二个好，重复此步骤，一个更多的时间，从而实现一共有三个冲洗。
- 转移阱漂洗皮肤活检到无菌培养皿中，活检的顶部添加100μl的完全培养基中，并小心地刮去使用不锈钢一次性无菌解剖刀皮下脂肪组织中。
注：钍是是关键的一步。 - 切割每个皮肤活检插入无菌培养皿4小块。转移样品（最多每管4毫米活组织检查四）含有5ml完全培养基的制备离解管。
- 盖紧管的帽子，倒挂连接到自动组织离解的袖子。确保所有的样品材料位于转子的面积。
- 通过执行“程序m_spleen _01”（由仪器的内部存储器或由伴有程序卡提供一个预先定义的节目）以解离活检在适当的旋转速度为56秒开始的解离过程。
- 处理后，从离解器分离的解离管，确保所有的解离的材料在管的底部收集。
- 添加150微升胶原酶IA（80毫克/毫升）到解离管孵育样品在振荡水浴中于37°下60分钟。添加抗酶的100微升（5 MU / ml）倒入thedissociation管，拌匀。
注：胶原酶或更长的温育时间将改变细胞生存力的浓度较高。 - 附加离解管到自动组织离解的套筒和运行“ 程序M_脾_01”解离 活检一次。
- 放置一个70微米尼龙细胞过滤器上的50ml Falcon管中的顶部。应用分离的样品材料，这个细胞滤网去除细胞团块/组织碎片。
- 用5ml完全培养基洗细胞过滤一次。 C±2离心机在20℃，450×g离心10分钟，吸出上清液。
- 重复该洗涤步骤一次。悬浮细胞沉淀在300微升完全培养基。单细胞悬液是准备用于进一步数据;继续与体外细胞培养协议或流式细胞分析。
- 在进一步的情况下，我ntracellular细胞因子染色，刺激细胞用PMA（12.5毫微克/毫升）中，离子霉素（500纳克/毫升）和布雷非德菌素A（5微克/毫升）4小时，在37℃，5％CO 2培养箱用于执行流之前4小时仪分析。
2.皮肤驻留性T细胞的活化多克隆（ 离体细胞培养）
- 等份加入100μl单细胞悬液（在步骤1.15中制备）成圆底96孔板中。
注：对于每个4毫米皮肤活检，所获取的单细胞悬液可分成一个96孔板的至少两个孔中。 - 添加抗CD3 /抗CD28单克隆抗体包被的微珠（每孔25000珠），重组人细胞因子的rIL-2（最终浓度25U / ml）和重组IL-1β（最终浓度为50ng / ml）中。
- 覆盖良好的标记板盖培养板，孵育在5％CO 2，100％湿度，37 °C培养箱。当介质的颜色变成黄色更改网上平台。
3.主要的流式细胞仪分析/培养的皮肤驻留性T细胞
- 准备FACS缓冲液：PBS + 0.2％BSA。
- 转移的目标细胞成V形底96孔板中。离心机在20℃±2，450×g离心2分钟，并吸出上清液。
- 重悬在100μlPBS中的沉淀。离心机在20℃±2，450×g离心2分钟，并吸出上清液。
- 染色的细胞用100μl缀合可定影活力染料制备eFluorescence780的：在4℃，30分钟（1 1000稀释使用PBS）中。添加100μl的FACS缓冲液，离心机在20℃±2，450×g离心2分钟，并吸出上清液。
- 选择所需的细胞表面标记的单克隆抗体，例如：CD45-BV421（HI30，1:20），CD3-ECD（UCHT1，1:50），CD4-PC5.5（1388.2，1：200），CD8-APC-AlexFluo700 （B9.11，1：400），CD14-FITC（TUK4，1:50），CD19-APC-AlexFluo750（13-1191:50），CD56-PE（MEM-188，1:50），CD25-PeCy7（BC96，1:50），CD11c的-PeCy7（BU15，1:10），以及CD1C-APC（AD5-8E7， 1:10），根据测试的每种mAb稀释因子使用FACS缓冲液制备的单克隆抗体混合物。定义使用抗体的同型对照与非染色样品一起大门设置。
- 添加25微升制备的单克隆抗体混合物的进每个孔中。孵育20分钟，在20℃±2，避光。
- 添加100μl的FACS缓冲液，离心机在20℃±2，450×g离心2分钟，并吸出上清液。
- 如需样品只需要细胞表面染色，继续执行步骤3.16。
- 在细胞内的Foxp3染色的情况下：
- 通过用3份的稀释剂的混合浓缩物中制备的固定和透化缓冲液。
- 准备1个通透缓冲区：部分10X 1通透缓冲区+ 9份无菌H 2 O.的
- 在100微升固定和通透性的悬浮颗粒zation缓冲，拌匀，并在4孵育 °下进行30分钟。
- 100μl的透化缓冲液添加至每个孔，离心在RT 450 xg离心2分钟，并吸出上清液。
- 洗细胞用透化缓冲液一次。
- 选择所需的细胞内的mAb，例如，Foxp3的-eFluo450（PCH101，1:50），IL-17A-AlexFluo488（eBio64DEC1，1:50）和IFNγ-PeCy7（4S.B3，1：400）。使用根据测试每种mAb稀释因子含有2％正常大鼠血清透化缓冲液制备的单克隆抗体混合物。定义使用抗体的同型对照与非染色样品一起大门设置。
- 加入20μl制备的单克隆抗体混合物的进每个孔中。孵育4 °℃，30分钟，避光。
- 孵育30分钟后，加入100微升透化缓冲液到每个孔。离心机在20℃±2，450×g离心2分钟，并吸出上清液。
- 洗净用透buffe细胞ř一次。重悬沉淀在110微升FACS缓冲液中，并转移细胞悬液到microFACS管。
注：样品是准备用10色流式细胞仪测量。 - 在需要精确的细胞数的情况下，立即用流式细胞仪进行测量前加10微升fluorospheres的充分混合均匀的悬浮液到每个样本。
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Representative Results
这里介绍的协议将产生2200±178000 760之间的615（平均值±SEM，健康志愿者的皮肤）至±用一个4 mm皮肤活检时（平均值±SEM，牛皮癣患者的皮损）从人体皮肤可行的淋巴细胞。
不同类型的 CD45 +细胞在来自健康个体包括CD4 + T细胞（〜45％），CD8 + T细胞（〜30％）的皮肤衍生的单细胞悬液进行鉴定，和的CD11c +树突状（〜5％ ），而少数B细胞（CD19 +），NK细胞（CD56 + CD3 - ），或单核细胞/巨噬细胞（CD14 +或CD1C +）中观察到（ 图1A）。该方法还允许对CD4 + CD25 + Foxp3的+细胞的人皮肤活检的分析。通过使用固定和透化后细胞内染色，有可能证明转录FAC的表达器的Foxp3在CD25 + T细胞（ 图1A）。
从人皮肤活检衍生的单细胞悬浮液表现出FL1（FITC），FL2（PE），FL3（ECD），FL9（太平洋蓝）和FL10（铬橙），使用流式细胞仪信道的高自发荧光背景（数据未示出） 。对于淋巴细胞群的适当的分析，因此，我们建议使用抗人CD45单克隆抗体与一个亮紫421荧光的淋巴细胞群体和自发荧光细胞群（ 图1B）的排斥门控缀合。在人的皮肤的大多数居民细胞是CD3 + T细胞（ 图1C）。细胞活力分析，建议使用一个可固定活力染料从死/死的细胞（ 图1C）区分是可行的。通常该协议导致65.3％±7.7（平均值±SD）的活细胞。用于流式细胞术数据的进一步分析，它是advis编到门上的活细胞群中，由于死的或死的细胞失去其细胞膜完整性，并可以非特异性地结合结合的抗体，从而提高了背景染色。
由这个协议分离的T细胞是非常适合用于进一步的功能分析。通过使用牛皮癣患者的皮损的一个4 mm活检，它表明，活检衍生的T细胞产生的IL-17A和IFNγ以下4小时刺激在布雷菲德菌素A存在PMA /伊屋诺霉素（ 图2）。
从涉及银屑病皮损新鲜制备的单细胞悬浮液的皮肤也可以用于进一步的体外细胞培养物中和随后的功能分析。以下与促炎细胞因子IL-1β或IL-23 8天的存在抗CD3 /抗CD28单克隆抗体包被的微珠多克隆刺激后膨胀，细胞可以例如用于分析其cytokINE生产能力（ 图3）。通过这样做时，观察到从健康和银屑病的个体的皮肤来源的细胞的细胞因子产生电位之间的明显的差异。银屑病个体的T细胞表现出更高的能力产生银屑病相关的细胞因子IL17A和IFNγ。这意味着，即使在体外培养后原型银屑病细胞因子的表型被保持，不存在于健康对照的情况。
图1：不同类型的白细胞中使用文中所述的协议分离皮肤驻地淋巴细胞健康个体皮肤衍生的单细胞悬液被识别用的兴趣加定影活力染料的荧光标记的单克隆抗体染色，并立即通过分析流式细胞仪。 （A）流量CYtometric检测单核细胞（CD14），DCS（CD11c的），B细胞（CD19），NK细胞（CD56 + CD3 - ）的，CD4 +，CD8 +和CD25 + Foxp3的皮肤驻淋巴细胞在+亚群。抗人CD45 / BV421单抗区别于自发荧光的细胞的淋巴细胞。用于CD45 +细胞门控策略示于（B）中 。分离后可行的CD45 + CD3 + T细胞（C）的百分比。数字显示阳性细胞的百分比。代表性的实验了三个不同的实验/供体所示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：从牛皮癣患者的皮损衍生的T细胞可机生产线CE IL-17A和IFNγ。一个4 mm皮肤活检是从牛皮癣患者的皮损经口服或科学使用知情同意书。使用文中所述的协议皮肤驻地T细胞中分离得到。产生IL-17A和IFNγ的皮肤驻地T细胞。响应于4小时刺激在布雷菲德菌素A存在PMA /离子霉素的细胞因子的细胞内积累通过流式细胞术测定。细胞因子阳性细胞的百分比示出。三种不同的患者的数据显示， 请点击这里查看该图的放大版本。
图3：皮肤驻留的T细胞能够产生IL-17A和IFNγ以下 体外
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Discussion
在这里，我们提出了一个协议，以有效地隔离人体皮肤活检的皮肤驻地T细胞。这个协议的优点是相对高的数字可行淋巴细胞的隔离，并表示相关的表面标记。确定的细胞亚群为：的CD11c +树突，CD4 +和CD8 + T细胞和Foxp3 + CD25 +细胞。重要的是，孤立的皮肤驻地T细胞的体外培养是很好的可行性，并允许进行后续功能分析。
人体皮肤可以通过机械解离与细胞外粘附蛋白，其功能，以保持组织的结构完整性的酶降解组合来解离成单细胞悬液。虽然表皮和真皮的中性蛋白酶基础层的分离是一种广泛使用的方法，以确定这些各自的皮肤层细胞浸润，我们注意到，中性蛋白酶处理LED TOA（未示出）的CD25和CD27的细胞表面表达的主要减少。由于这些标记是重要表征淋巴细胞亚群，我们认为，分散酶处理影响随后的免疫。这是不太可能的除去真皮的是负责在CD25或CD27表达细胞所观察到的减少，因为在健康个体的大多数T细胞在真皮是局部的皮肤而分钟的T细胞数目是存在于表皮10 -12。分散酶的离体角质形成细胞的增殖能力的不利影响以前已经13报道。因此，如果细胞的功能是研究的目的谨慎使用分散酶是必要的。在我们的协议中，我们已经使用胶原酶I型，以获得皮肤活检的单细胞悬浮液。虽然相对于胶原酶胶原酶我有很高的胰蛋白酶的活性，从而更加苛刻，我们选择了这个特殊的胶原酶因为它已经TESTED其适合细胞培养物。使用胶原酶IV的适合于细胞培养物可能是未来的步骤，以进一步优化我们目前的协议。
由于其性质，皮肤拉伸力和机械分解高度耐药。到目前为止，免疫细胞的人类皮肤全面分析已经阻碍了在使用相对苛刻消化协议时获得足够的细胞数量的技术挑战。因此，迄今发表的大多数研究依赖于免疫组化分析。 CD4 + T细胞从皮肤活检直接分离通常被认为是麻烦的。另一种方法是使用皮肤外植体爬出来的文化10。然而，这些都需要2-3周的文化，而且皮肤外植体培养基中含有一组选定的细胞因子和趋化因子，可能导致优惠爬出来的特异性T细胞亚群。此外，文化时期可能affect是细胞的表型。目前的协议不使用添加的细胞因子或趋化因子，和CD4（以及其它细胞标记）的表达被完好地保存了分离后，使两者的表型和分离后直接的T细胞群的功能研究的。
市售的自动化组织离解他们是用胶原酶孵化，对于降解细胞外基质之前需要用于皮肤片段的解离。对于来自细胞外基质的细胞的随后释放，自动离解器被再次使用。虽然皮肤的广泛手动切割可以产生类似的细胞数目（数据未示出），结果是不太一致和更依赖于表演者的经验。使用由仪器提供的预先定义的程序皮肤的离解将产生更可再现的结果。与以往的研究显示，皮肤一致的包含各种升eukocytes子集2,14，的CD11c +树突，CD8 +和CD4 + T细胞，并在通过这里提出的方案制备的单细胞群中观察到的Foxp3 +细胞。重要的是，协议产生可行的淋巴细胞的相对高的产率。由于该协议的效率，它是特别有用的研究病人物质，其中经常只能获得一个4 mm皮肤活检时。使用该方法，我们能够显示，从牛皮癣患者的皮损分离的T细胞显示出较高的容量，以产生IL-17A和IFNγ相比健康的皮肤9的。
根据不同的研究的问题，可能有必要单细胞悬浮液的制备后，以进一步纯化某些细胞亚群。在这种情况下，较大的皮肤片可以用来确保足够的细胞的产量为亚组分析。这样做时，请确保皮肤上应被切割成更小的圆周率开始隔离协议之前的约2mm×2mm的欧洲经委会。
总之，本协议提供以隔离皮肤固有细胞的改进的方法，有利于在单细胞水平有意义的表型和功能分析，从而提高了在皮肤免疫应答的洞察力。
在当前的协议的关键步骤是适当的去除皮下脂肪组织和皮肤的切割为更小的碎片，在解离管加工多个活检时尤其如此。脂肪组织和/或大的组织片将导致离解器不正当地工作，要求重新运行。这将严重损害细胞活力。该技术的限制在于从一个4 mm皮肤活检的细胞数是不足够的细胞亚群的随后分离。
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Acknowledgments
从牛皮癣患者的皮肤活检好心由Andreas Koerber博士经过科学使用口头或书面的知情同意书（在德国埃森大学皮肤科）提供。
XH也由国家自然科学基金委员会61263039和国家自然科学基金委员会11101321的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman - Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman - Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman - Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman - Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman - Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman - Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
References
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