Introduction
Kræft er fremadskridende sygdomme præget af ophobning af patologiske mutationer, deletioner og kromosomfejl gevinster over tid. Disse genetiske abnormiteter kan påvirke flere cellulære processer spænder fra cellecyklussen, celledød, energisk metabolisme og samling af cytoskelettet at understrege reaktioner såsom hypoxi. Derfor tumorigenesis afspejler de kollektive aktioner fra flere genetiske afvigelser på tværs af et spektrum af biologiske processer. Seneste integrationsfremmende genomiske forskningsindsats, herunder hele genomsekventering, exome sekventering, målrettet sekventering, dyb sekventering og genom-dækkende associationsstudier, har identificeret et stigende antal nye genetiske ændringer i stort set alle typer af tumorer 1-4. I mange tilfælde, de genetiske læsioner forekommer sammen i et ikke tilfældigt måde 5-8, hvilket tyder på deres samarbejde i sygdom patogenese. Dissekere onkogene roller bred vifte af afvigende udtrykte gener som følge from disse genomiske læsioner er nødvendigt at udarbejde nye terapeutiske strategier og til at forstå svarene fra tumorceller til disse midler, men dette har vist sig at være en skræmmende opgave, der kræver meget robuste dyremodelsystemer for gennemførelsen af high-throughput funktionel genomisk analyse vivo.
Selv pattedyr, især gnavere, er stillede modeller i cancer biologi har zebrafisk begyndt at tiltrække stor opmærksomhed. Den teleost zebrafisk (Dario rerio) er blevet anvendt som en model organisme til udvikling undersøgelse siden 1960'erne og først blev anvendt til studiet af tumor patogenese i 1982 9-11. Nem vedligeholdelse, lille kropsstørrelse, og høj frugtbarhed gør zebrafisk en robust model for store forward genetiske skærme til at identificere mutationer, som bibringer unormale og patologiske fænotyper 10. Den optiske gennemsigtighed zebrafisk embryoner er en anden vigtig funktion understøtter mere udbredt anvendelse af denne kræftform model, somdet giver in vivo imaging, der skal udføres for at lokalisere tumor udvikling i realtid 9, et program, der er relativt vanskeligt i gnavere 12. Seneste komparativ genomforskning analyse af zebrafisk henvisning genom (Zv9) afslørede 26.206 protein-kodende gener, med 71%, der har menneskelige orthologer, hvoraf 82% er korreleret med sygdomsassocierede gener i Online Mendelsk nedarvning i Man database (OMIM) 13, 14. Følgelig har zebrafisk blevet anvendt til at modellere forskellige typer af humane cancere, herunder neuroblastom 8, T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL) 15,16, melanom 17,18, Ewings sarkom 19 rhabdomyosarcom 20,21, pancreatisk carcinom 22, hepatocellulært carcinom 23 og myeloid malignitet 24,25, og er blevet udvalgt som en kræft model for xenotransplantation studerer 11,26.
En stabil transgenfremgangsmåde i zebrafisk er almindeligt anvendt til at undersøge virkningen af gain-of-funktion af gener i normale udvikling eller sygdom patogenese 27,28. At udvikle en sådan model (figur 1A), en injicerer en DNA-konstruktion, der indeholder genet af interesse drives af en vævsspecifik promotor i en celle vildtype-embryoner. Tre til fire måneder efter injektionen, da de injicerede embryoner bliver kønsmodne, bliver de udkrydsede med vildtype-fisk til at screene for dem, der viser integration af DNA-konstruktionen i deres kimcellelinje, som licenser dem som grundlægger fisk. Mange faktorer, såsom antallet kopi og integration site af transgenet, påvirker ekspression af transgenet i stabile transgene linjer. Således at udvikle en transgen tumormodel, flere stabile transgene linier, som overudtrykker en enkelt onkogen skal genereres først og screenes for linjen udtrykker transgenet på et niveau, der kunne føre til tumor induktion. Hvis overekspression af en kandidat oncogene er toksisk for kimceller, er det vanskeligt at frembringe en stabil transgen linje ved direkte overudtrykker transgenet 29. Derfor kan denne fremgangsmåde være tidskrævende, med en høj risiko for fejl for at generere en egnet cancer model.
Her illustrerer vi en alternativ strategi baseret på mosaik forbigående transgenese (figur 1B), som tilvejebringer unikke fordele i forhold til traditionelle stabil transgenese til funktionel genomisk undersøgelse in vivo. I denne fremgangsmåde er en eller flere transgene konstruktioner injiceres i en celle stadiet af transgene eller vildtype-embryoner. De injicerede DNA-konstruktioner, der indeholder transgener er så mosaically og tilfældigt integreret i den primære indsprøjtet fisk, hvilket resulterer i blandede genotyper indenfor flere cellepopulationer i de enkelte fisk 30. Desuden injektion af flere DNA-konstruktioner i en celle embryoer fører til co-integration i den samme celle på tilfældige steder, tillader en at TRAce cellerne med ekspression af transgener og udforske samspillet mellem forskellige gener under sygdom patogenese i mosaik dyr 31. Som bevis principielt vi transient overudtrykt mutation aktiveret ALK (F1174L) med mCherry reportergen i det perifere sympatiske nervesystem (PSNS) under kontrol af dopamin beta hydroxylase (d βh) promotoren i vildtype fisk og transgene fisk overudtrykker MitCN. ALK, der koder for et receptortyrosinkinase, er den hyppigst muterede gen i høj risiko neuroblastom 5-7,32,33. ALK (F1174L), som en af de hyppigste og potente somatiske aktiverende mutationer, er overrepræsenteret i MYCN- forstærket neuroblastom patienter med høj risiko og synergistisk med MitCN overekspression at fremskynde neuroblastom tumorgenese både stabile transgene mus og transgene zebrafisk modeller 8,34,35. Ved mosaikforbigående overekspression af ALK (F1174L) med mCherry i MitCN transgene fisk, vi gentaget fremskyndelse af tumor indtræden observeret i den stabile transgene fisk overudtrykker både ALK (F1174L) og MitCN, tyder på, at mosaik transgenese strategi kan anvendes til hurtigt og effektivt vurdere de relative bidrag fra flere onkogener i tumor initiering in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle zebrafisk undersøgelser og vedligeholdelse af dyrene blev udført i overensstemmelse med Mayo Clinic Institute IACUC-godkendt protokol # A41213.
1. DNA-konstruktioner til Transgenese
- Amplificere et 5,2 kb dopamin beta hydroxylase (d βh) promotorregionen 8 ved hjælp af CH211-270H11 BAC klon (fra BacPac midler center (BPRC)) som en DNA-template. Brug et PCR-system egnet til lange og præcis PCR-amplifikation af lange DNA-templates og følgende cyklus programmer for PCR: 94 ° C i 2 min, 10 cyklusser af (94 ° C, 15 sek, 50 ° C, 30 sekunder, 68 ° C, 8 min), efterfulgt af 30 cykler af (94 ° C, 15 sek, 53 ° C, 30 sek, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (fremadrettet primer 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' og revers primer 5'- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
- Opret d βh -pDONRP4-P1R entry clone 8 ved hjælp af kommercielt rekombinant kloning system som multisite gateway. Bland 1 pi oprensede dβh PCR-produkt (172 ng / pl), 1 pi (150 ng / pl) pDONRP4-P1R donor vektor (sammen med andre gateway vektorer er generøse gaver fra Dr. Chi-Bin Chien, Univ. Of Utah) , 4 pi TE-buffer (pH 8,0) med 2 pi BP CLONASE enzymblanding, inkuberes i 1 time ved 25 ° C og derefter omdanne til One Shot TOP10 kompetente E. coli ifølge producentens protokol.
- Generere d βh: EGFP-MitCN transgene konstruktion 8 ved hjælp af rekombinant kloning, der er nævnt i trin 1.2. Bland 1 pi af hver post klon (150 ng / pl), herunder et 5,2-kb dβh promotoren (dβh -pDONR P4-P1R konstrukt), EGFP mangler et stopkodon (PME-EGFP konstrukt) og humant MitCN cDNA (en generøs gave fra Dr. Hogarty på Børnehospitalet i Pennsylvania, MitCN-pDONRP2R-P3-konstruktion), 1 pi (150 ng / pl) i den modificerede destination vektor indeholdende I-SCEI genkendelsessteder (en generøs gave fra Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Tyskland), 4 pi TE-buffer ( pH 8,0) med 2 pi LR Clonase enzymblanding, inkuberes i 1 time ved 25 ° C og derefter omdanne kemisk kompetente E. coli såsom One shot top 10, og følg producentens protokol.
- Gør MITF: MITF transgene konstruktion 8 ved fordøjelse af PNP-MITF vektor med NotI og Sall-restriktionsenzymer i 2 timer ved stuetemperatur, og ved subkloning af frigivet 2,65 kb (en generøs gave fra Dr. D. Raible, Univ of Washington). DNA-fragment, der indeholder MITF promotoren og den kodende sekvens for zebrafisk MITF genet ind i NotI og Mlul steder af en modificeret pBluescript vektor indeholdende flankerende I-Scel genkendelsessteder (en generøs gave fra Dr. Hui Feng, Boston University), under anvendelse af T4 DNA-ligase ifølge producentens protokol.
BEMÆRK: For at øge effektiviteten af at generere stabile MitCN udtrykkende linjer, d βh: EGFP-MitCN og MITF:. MITF DNA konstruktioner coinjiceret i én-celle stadie Nacre embryoner Nacre betegner en form for mutant fisk mangler en neural crest-afledt Melanophore under udviklingen 36. Således udseendet af pigment celler i de injicerede embryoner antyder integrationen af MITF: MITF DNA-konstruktioner i genomet. Det er blevet påvist, at to eller tre coinjiceret DNA-konstruktioner kan cointegreret ind i fisken genomet 31. Således kan pigmentering forårsaget af MITF udtryk tjene som markør for integrationen af dβh: EGFP-MitCN transgen og for lettere identifikation af MitCN stabil transgen linje. - Bland d βh: EGFP-MitCN og MITF: MITF DNAkonstruktioner på et 3: 1 forhold i et totalt volumen på 15 pi reaktion med 1 pi I-Scel enzym og 0,75 pi buffer. Sørg for, at den samlede mængde DNA i reaktionen ikke overstiger 750 ng.
- Udfør den I-Scel fordøjelse ved stuetemperatur i 4 timer eller O / N. På den anden dag, I-SceI- fordøjet DNA'er er klar til mikroinjektion eller kan opbevares ved -20 ° C til injektion i fremtiden. Opbevar I-Scel enzym ved -80 ° C i små portioner for at bevare sin enzym effektivitet.
- Subklone den menneskelige ALKF1174L og vildtype-ALK-genet fra pCDNA3-vektoren (en generøs gave fra Dr. George på Dana-Farber Cancer Institute) 7 ind i EcoRI- og Notl-steder af pENTRY1A vektor (en generøs gave fra Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Tyskland) under anvendelse af T4 DNA-ligase ifølge producentens protokol.
- Generer d βh: ALKF1174L </ Em> eller dβh: ALKWT transgene konstruktioner ved hjælp af rekombinant-system som nævnt i protokol 1.2. Kort fortalt kombinere tre entry-kloner, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (eller ALKWT -pENTRY1A) og P3e-polyA, i den modificerede destination vektor indeholdende I-SCEI genkendelsessteder (en generøs gave fra Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Tyskland), ved hjælp af LR Clonase enzym Mix, ifølge producentens protokol.
- Bland d βh: ALKF1174L (eller dβh: ALKWT) og dβh: mCherry DNA-konstruktioner på et 3: 1 ratio og linearisere dem med I-Scel enzym som beskrevet i protokol 1,5-1,6.
2. Mikroinjektion
- Brug glas mikropipetter med diameter 1,0 mm for alle injektioner 37. Bræk spidsen af glasmikropipetter med et barberblad før injektion. Kalibrer injektionsvolumenet ved injicereing H2O i en dråbe mineralolie. Mål diameteren af de resulterende dråber og juster mikroinjektor (tryk eller varigheden af trykimpuls) for at sikre, at injektionsvolumen er mindre end 10% af det totale cellevolumen af en celle-embryoer.
- Tilføj yderligere 0,5 pi frisk I-Scel enzym (5 enhed / ul) i 5 pi injektion indeholdende DNA-konstruktioner lige før injektion for at øge effektiviteten af gensplejsning 38. Injicer 50-80 pg lineariseret DNA-konstruktioner ind i cytoplasmaet af en celle embryoer. For at sikre en vellykket injektion Den blandes med 0,25% phenolrødt til visualisering. Hvis celler bliver røde efter injektion, angiver det mikroinjektion lykkes. For at sikre en høj succesrate for at generere transgene fisk, vi typisk injicere så mange som 500 embryoner.
- For at generere transgene fisk stabilt udtrykker MitCN, coinject den lineariserede d βh: EGFP-MYCN og MITF: MITF DNA-konstruktioner (ved et 3: 1 ratio) i embryoner af pigmentering mutant Nacre zebrafisk på én-celle stadiet. Ekspressionen af MITF tjener som en reporter for integration af transgene konstruktioner i fisk genomet.
- For mosaik overekspression af ALK i vildtype- eller MitCN transgene embryoner, co-injicere det lineariserede d βh: ALK F1174L (eller dβh: ALKWT) med dβh: mCherry DNA-konstruktioner (ved et 3: 1 forhold) i en celle embryoner som følge af avl af F1 heterozygote Tg (dβh: EGFP-MitCN) transgene fisk med vildtype AB fisk. Således halvdelen af afkom er transgene for MCYN og halvdelen er vildtype.
3. Skærm til stabile eller Mosaic transgene fisk
- For at øge effektiviteten af identifikation af stabile MitCN udtrykkende linjer, bedøver primært injiceret Nacre embryoner med tricaine (0,02%) at dage 3-5 af postfertilization og skærm til pigmentering. Overfør embryoner med pigmentering til en ny petriskål med frisk æg vand og hæve dem til seksuel modenhed til yderligere screening for grundlæggeren fisk, der bærer d βh: EGFP-MitCN transgen i kimceller.
- For at identificere grundlæggeren med kimlinietransmission af EGFP-MitCN, udkrydsning pigmenteret F0 voksne fisk med vildtype AB fisk og skærm for EGFP-positive fostre på 1-2 dage efter befrugtning til yderligere genotypebestemmelse. Placer et enkelt EGFP-positive F1 foster i et PCR-rør og fjerne al væske. Der tilsættes 50 pi gDNA ekstraktionsbuffer som indeholder 12,5 pi 4x lysepuffer, 35 pi H2O og 2,5 pi proteinase K (10 mg / ml) til en enkelt embryo. Inkuberes reaktionsblandingen i 2-3 timer ved 55 ° C efterfulgt af 10 min inkubation ved 98ºC at inaktivere proteinase K. For at lave 50 ml 4x lysepuffer, tilsættes 500 pi 1M Tris (pH 8,4), 2,5 ml 1 M KCl to 47 ml H 2 O. BEMÆRK: Efter F0 MitCN stabil transgene fisk opdrættes med vildtype AB fisk, alle af afkommet er pigmenterede. Således kan pigmentering ikke tjene som markør for identifikation af MYCN- positive fisk. Mens der i MitCN transgene fisk er EGFP-MitCN fusionsprotein udtrykkes i PSNS, herunder de sympatiske neuroner i den overlegne cervikale ganglier og sekventiel segmental ganglion af det sympatiske kæde og ikke-PSNS dopaminerge neuroner, såsom medulla oblongata og kraniel ganglier 8. Således kan ekspressionen af EGFP tjene som en markør til identifikation af MitCN stabile transgene embryoner.
- Brug 2 pi gDNA ekstraheret fra pigmenteret F1 embryo som skabelon, primere MitCN -test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MitCN R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 "og følgende program with GC-rige PCR System: 1 cyklus på 95 ° C i 3 minutter, 25 cyklusser af 95 ° C i 30 sek, 58 ° C i 30 sek og 72 ° C i 3 minutter. Vi typisk genotype 14-16 pigmenterede embryoner fra en enkelt parring for at bekræfte tilstedeværelsen af integrerede MitCN transgen i pigmenterede embryoner, mere end 6 grundlægger fisk overudtrykker MITF og MitCN blev identificeret ved denne metode.
- Løft op resten af EGFP-positive F1 embryoner. Fin klip og genotype dem på 2-3 måneder gammel ved hjælp af ovenstående protokol til yderligere at bekræfte integrationen af MitCN transgen i fisk. Race F1 MitCN stabil transgene fisk med vildtype AB fisk. Co-injicere lineariserede d βh: ALK F1174L (eller dβh: ALKWT) med dβh: mCherry DNA-konstruktioner ind i en celle embryoer som beskrevet i protokol 2.4.
- Sorter den MitCN udtrykkende embryoner i eksperimentet beskrevet i protokol 2.4 ved hjælp af en stereoskopisk fluorescence mikroskop og screene primært injicerede embryoner på dag 1-3 af postfertilization for ekspressionen af EGFP-MitCN i PSNS. Så i løbet af dag 2-5 af postfertilization, bedøver embryoner med tricaine (0,02%) og sortere dem MYCN- positive eller negative embryoner igen baseret på ekspressionen af mCherry i PSNS ved hjælp af et stereoskopisk fluorescensmikroskop. Ekspressionen af mCherry tjener som en markør for coekspression af ALK i væv af mosaik primære injicerede dyr.
BEMÆRK: ~ 600 afkom som følge af avl af MitCN stabil transgene fisk med vildtype fisk blev injiceret pr gruppe med lineariserede DNA-konstruktioner, herunder d βh: ALK F1174L og dβh: mCherry, dβh: ALKWT og dβh: mCherry eller dβh : mCherry alene, henholdsvis. Kan observeres Mosaic ekspression af mCherry i 70-90% af primært injiceret fisk. En halv til en-tredjedel af den injicerede fisk overlevede larverne fase for tumor ur. - Hæv alle mCherry + MitCN + og mCherry + MitCN - embryoner i henhold til de standard protokoller fra zebrafisk bog 39 og overvåge tumor debut begynder ved 5 uger postfertilization.
4. Tumor Watch i Mosaic transgene fisk
- Overvåg mCherry- positive primært injiceret fisk hver 2. uge starter ved 5 uger postfertilization for tegn på tumor debut.
- Bedøver fisk med tricaine (0,02%) og skærm for tilstedeværelse af mCherry - og EGFP udtrykkende tumorer i PSNS under Nikon SMZ-1500 stereoskopisk fluorescensmikroskop udstyret med en digital syn DS-U1 kamera.
- For at bekræfte, om tumorerne udtrykker ALK transgen, isolere mCherry- og EGFP-positive masser for ALK genotypebestemmelse PCR.
- Ved anvendelse af PCR, at amplificere genomisk DNAekstraheret fra udviklede tumorer med de følgende primere: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 'og ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3' og følgende PCR-reaktion: 1 cyklus 94 ° C i 5 minutter, 30 cykler af (94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 60 sek). Derefter sekvens PCR-produktet med ALK P7 primer til yderligere at bekræfte tilstedeværelsen af mutant eller vildtype-ALK i mCherry-positive tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at undersøge om overekspression af mutation aktiveret ALK F1174L eller vildtype-ALK kunne samarbejde med MitCN i neuroblastom induktion, vi overudtrykt enten aktiveret human ALK eller vild-type human ALK under kontrol af d βh promotor i PSNS af transgene fisk, der overudtrykker MitCN. En af følgende konstruktioner, dβh - ALKF1174L eller dβh - ALKWT, blev co-injiceret med dβh - mCherry i én-celle vildtype eller MitCN transgene embryoner (figur 2A) 8. Ekspressionen af mCherry tjente som markør for coekspression af ALK i væv af mosaik primære injicerede dyr. Alle de forventede genotyper var repræsenteret i den injicerede fisk: (1) MitCN udtrykkende fisk med mosaik coekspression af aktiveret ALKF1174L og mCherry MitCN udtrykkende fisk med mosaik coekspression af vildtype ALK og mCherry, udpeget MitCN, mosaik ALKWT; (3) MitCN udtrykkende fisk med mosaik udtryk for mCherry, betegnet MitCN, mosaik mCherry; (4) vildtype fisk med mosaik coekspression af aktiveret ALKF1174L og mCherry, udpeget WT, mosaik ALKmut; og (5) vildtype fisk med mosaik coekspression af vildtype-ALK og mCherry, betegnet WT; mosaik ALKWT. En tumor ur blev derefter udført hver 2. uge fra 5 uger postfertilization (WPF) på i alt 492 injicerede dyr.
Otte GFP + / mCherry + tumorer opstod i interrenal kirtel, den menneskelige binyrerne tilsvarende, med 9 WPF i MitCN udtrykkende fisk coinjiceret med d βh - ALKF1174 L og dβh - mCherry (figur 2B og 3). Disse tumorer var histolokologisk, immunhistokemisk og ultrastrukturelt sammenlignes med human neuroblastom (data kan findes i reference 8). Derimod blev der ikke tumorer observeret af 9 uger i MitCN udtrykkende fisk coinjiceret med dβh - ALKWT og dβh - mCherry (figur 2C og 3, p = 0,002) eller injiceres med dβh - mCherry alene (figur 2D og 3, p = 0,007). Tumorer opstod i både MitCN, mosaik ALKWT og MitCN; mosaik mCherry fisk med den samme sats for induktion efter 12 ugers alderen. Desuden blev neuroblastomer ikke påvist i nogen vildtype fisk coinjiceret med enten vildtype-ALK og mCherry eller ALKF1174L og mCherry transgener i de sidste 15 uger af overvågning. Tilsammen disse resultater viser, at mosaik overekspression af mutation aktiveret ALK accelererer MitCN induceret tumor onSet uanset integration sted i de enkelte mosaik dyr, og at overekspression af vildtype-ALK på de niveauer, der drives af dβh promotoren synes ikke at samarbejde med MitCN overekspression at inducere neuroblastom i dette modelsystem.
Figur 1: Skematisk oversigt over konventionel stabil og mosaik forbigående zebrafisk transgene strategier i studiet af de kooperative Bidrag kandidatlandenes Oncogener til tumorigenese (A) Stabilt transgen strategi.. Lineariseret transgene DNA konstruktion indeholdende kandidat onkogen injiceres i en celle stadiet vildtype eller Nacre mutante zebrafisk embryoner hvor transgenet kan integreres ind i fisken genomet tilfældigt genomisk loci. Integration af transgen i kimceller er nødvendig for generation stabil transgen linje. Primært injicerede embryoner tage 3 til 4 måneder til kønsmodne (F0 generation af fisk), som vil blive udkrydsede med vildtype eller Nacre mutant fisk at screene for grundlæggeren fisk med transgen kønscelleoverførsel. Den resulterende afkom grundlægger fisk, betegnet F1 generation bærer heterozygotiske alleler af transgenet i deres genom. For at vurdere de kollaborative virkninger af to kandidatlande onkogener, såsom gen "a" og gen "b", i tumorigenese, vi avlet F1 afkom af to stabile transgene linier overudtrykker disse transgener, med kun en fjerdedel af afkom bærer sammensatte transgenerne. På grund af den relativt lave effektivitet frembringelse af stabile transgene linjer, er denne fremgangsmåde ikke muligt for high-throughput funktionelle genomiske analyser. (B) Mosaic forbigående transgen strategi. Svarende til den stabile transgenese, lineariseret transgene DNA co nstructs indeholdende kandidatgener kan injiceres i en celle stage vildtype-embryoner. Fordi transgenet ikke behøver at blive integreret i genomet af kimceller, kan meget tid og kræfter gemmes i processen med at identificere grundlægger fisk. Alternativt, hvis transgene fisk linje overekspression en af ansøgerlandenes onkogener er tilgængelig (i vores tilfælde blev MitCN transgene fisk udviklede), lineariserede transgene DNA-konstruktioner, der indeholder andre kandidatgener kan injiceres i en celle stadie transgene embryoner til at studere deres samarbejde tumorigenese. Op til tre transgene konstruktioner kan coinjiceret og co-udtrykte i primært injiceret fisk 31; Således kan interaktionen af kandidat onkogener i tumorigenese vurderes på primært injiceret fisk. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
"Src =" / files / ftp_upload / 52567 / 52567fig2.jpg "/>
Figur 2: Mosaic Ekspression af aktiveret ALK Accelererer indtræder MitCN induceret Neuroblastom 8 Modificeret figur med tilladelse fra Elsevier (reference 3466510609819).. (A) Approach til konstruktion mosaik gensplejsning. (BF) 2 dage gammel larver af primært injicerede embryoner. Lateral synspunkter stabil EGFP udtryk i dopaminerge neuroner, herunder craniale ganglier (CG, pilespidser) i fusionerede fluorescens-brightfield billeder (øverste paneler). Lateral udsigt over mosaik mCherry udtryk (nedre paneler) i kranie ganglier (CG, pilespidser), medulla oblongata (MO, pile). Observeres Nogle ektopisk mCherry ekspression i ikke-PSNS og ikke-dopaminerge neuroner. (G - K) 7 uger gamle primært injiceret fisk.(B, G) MitCN udtrykkende fisk coinjiceret med d βh - ALKF1174L og dβh - mCherry konstruktioner (MitCN; mosaik ALKmut). EGFP - og mCherry -positive tumorer opstod ved 7 uger (hvide tomme pile i G). (C, H) MitCN udtrykkende fisk coinjiceret med dβh - ALKWT og dβh - mCherry konstruktioner (MitCN; mosaik ALKWT). (D, I) MitCN udtrykkende fisk injiceret med dβh - mCherry konstruere alene (MitCN; mosaik mCherry). (E, J) Vild-type (WT) fisk coinjiceret med dβh - ALKF1174L og dβh - mCherry konstruktioner (WT; mosaik ALKmut). (F, K) Vild-type (WT) fisk coinjiceret med dβh - ALKWT og dβh - mCherRy konstruktioner (WT; mosaik ALKWT). Neuroblastomer blev ikke observeret i MitCN udtrykkende fisk coinjiceret med dβh-ALKWT og dβh - mCherry eller dβh - mCherry alene ved 7 WPF, eller i nogen af de søskende, der ikke arve MitCN transgen og blev injiceret med enten ALKWT genet eller den ALKF1174L genet. Scale barer, 100 um i B - F og 1 mm i G - K. En Nikon SMZ-1500 stereoskopisk fluorescensmikroskop udstyret med en digital syne DS-U1 kamera og et Leica MZ10F stereoskopisk fluorescensmikroskop udstyret med et Leica DFC 345FX digitalkamera blev anvendt til at indfange den fluorescerende images.The erhvervede billeder blev behandlet og kompileret med Adobe Photoshop og Illustrator CS3 (Adobe) software. Klik her for at se en større versionaf dette tal.
Figur 3: indtræder Neuroblastom i MitCN transgene fisk eller vildtype (WT) Fisk som Mosaik coinjiceret med DNA-konstruktionerne. Genoptrykt med tilladelse fra Elsevier (reference 3466510609819) d βh - ALKF1174 L og dβh - mCherry (mosaik ALKmut). Dβh - ALKWT og dβh - mCherry (mosaik ALKWT); eller dβh - mCherry (mosaik mCherry) alene 8. Forskellen mellem tumor debut med 9 WPF i MitCN udtrykkende fisk coinjiceret med dβh - ALKF1174 L og dβh - mCherr y (MitCN; mosaik ALKmut), og at i MitCN linje coinjiceret med dβh - ALKWT dβh - mCherry (MitCN; mosaik ALKWT) eller dβh - mCherry alene (MitCN; mosaik mCherry) er signifikant på p = 0,002 og p = 0,007, henholdsvis af to-tailed Fishers eksakte test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne repræsentativ undersøgelse, brugte vi forbigående coinjektion og co-ekspression af aktiveret ALK med mCherry reporter genet i MitCN udtrykkende transgene fisk at vise, at disse gener samarbejder om markant fremskynde starten af neuroblastom, i overensstemmelse med vores tidligere fund i forbindelse stabil transgene fisk co-udtrykke både aktiverede ALK og MitCN 8. Denne mosaik transgene fremgangsmåde har flere særskilte fordele i forhold til den konventionelle metode. Vigtigst, det muliggør hurtig undersøgelse af virkningerne af co-udtrykke kandidat onkogener i primært injicerede dyr (F0 generation) uden kravet om stabile transgene dyr, såsom at fjerne den overdrevne tid og arbejdskraft typisk involveret i avl og identifikation af ALK udtrykkende stabil transgene fisk. Vi undersøgte også effekten af overekspression af vildtype ALK, med eller uden MitCN løbetudtryk, om tumor indvielse. Resultaterne viser, at forbigående overekspression af vildtype-ALK i vores fisk modellen ikke er tilstrækkelig til at indlede neuroblastom tumorigenese, uanset status MitCN onkogen. Det ville være interessant at teste i fremtiden, om forbigående coekspression af både aktiverede ALK og MitCN i vildtype fisk kunne fremkalde tidligere indsættende tumorigenese i primært injiceret fisk. Denne undersøgelse vil mere trofast efterligne selve sygdommen sammenhæng, hvor somatiske ændringer af begge gener co-forekomme i en undergruppe af neuroblastom patienter 5 højrisiko.
Et vigtigt designelement af mosaik forbigående transgene strategi er inddragelsen af en reporter genet for coinjektion med eventuelle kandidatlande onkogener af interesse, som hjælper med screening for dyr med en vellykket integration af transgener blandt de primært injicerede zebrafisk embryoner og overvåge positive fisk til Tumor debut og progression. For at øge effektiviteten af gensplejsning har vi anvendt den I-Scel meganuklease-medieret transgene tilgang, som øger den ensartede promoter-afhængige ekspression af transgener fra 26% af de primært injicerede embryoner uden meganuklease til 76% af injicerede embryoner med meganuklease 38 . Selvom brug af I-Scel meganuklease-medieret transgene fremgangsmåde har forbedret effektiviteten af gensplejsning bemærkelsesværdigt, hvor stor en procentdel af injicerede embryoner positivt for transgenerne stadig et godt stykke under 100%. Således kan ekspressionen af et co-injiceret reportergen tjene som en markør for at identificere injicerede embryoner med vellykket integration af kandidat transgener før yderligere overvågning af fisk til indtræden af tumorer. I modsætning hertil har en Tol2 transposon-medieret transgene tilgang blevet et populært genetisk værktøj i model hvirveldyr og er med succes blevet anvendt til gensplejsning, insertionsmutagenese, gen fældeping, og enhancer trapping 40,41. Injektion af Tol2 transposoner med transposase mRNA i befrugtede embryoner kan fremme tidlig integration begivenheder, der øger effektiviteten af kromosomal integration og forstærker vellykket kønscelleoverførsel transgenets 42. Men på grund af "cut-and-paste" mekanisme DNA gennemførelse, en enkelt kopi af transgen integreret i kromosomet pr insertion locus 42. Således er co-injiceret kandidatgener sandsynligvis integreres individuelt i fisken genomet på forskellige steder, hvilket kan føre til ekspression af kandidatgener i forskellige celler og en mere kompliceret forbigående og mosaik ekspressionsmønster coinjiceret gener i primært injiceret fisk.
Samlet set den aktuelle undersøgelse understøtter den fremtidige anvendelse af mosaik gensplejsning som en hurtig metode til at vurdere den kollaborative, måske synergistisk, relationer mellem flere onkogener i en high-throughput måde en udfordring, som er vanskeligt at opfylde med andre dyremodeller, herunder gnavere. Hidtil denne strategi har også været anvendt med succes i transgene zebrafisk at identificere gener, der undertrykker aktiverede RAS induceret initiering af rhabdomyosarcom 31 og modificerer stråling følsomhed MYC-induceret T-celle akut lymfoblastær leukæmi 31. Desuden Langenau et al, 15 har vist, at kombinere samtidig injektion tilgang med varme-chok-inducerbare transgene tilgang kan fremkalde transgenekspression ved varmechok i primært injiceret fisk, hvilket ville være meget nyttige i at udforske de kooperative roller onkogener i tumor progression, da det tillader genekspression være aktiveret efter den primære tumor er etableret. For ganske nylig, Langenau og kolleger udviklede den første immunkompromitterede zebrafisk model ved at målrette rag2 gen med manipuleret zink-finger nukleaser 43. Tabaf funktion af rag2 tilladte robust og langsigtet engraftment af flere væv og kræftceller 43, en fordel, der kunne være nyttige i at transplantere de heterogene kræftceller, der overudtrykker kandidat transgener og vurdering af effekten af mosaik transgen ekspression på selvfornyelse kapacitet, terapeutisk svar og vækstraten for disse cancerceller.
Endelig mosaik transgenese giver en anden unik fordel i forhold til stabil transgenese. I stabile transgene dyr, er transgener integreret i genomet af hver eneste celle i kroppen og er arvelige fra generation til generation 27. Imidlertid opstår mange cancere fra genetiske ændringer i somatiske celler i stedet for nedarvede mutationer i kimceller 44. Således mosaik mønster af transgen integration i det primære injicerede fisk og de blandede genotyper inden cellepopulationer enkelte mosaik transgene fisk ville bedre rekapitule- the somatiske defekter fundet i patienter, og ville undgå den kunstige positionelle effekt forårsaget af en enkelt insertionssted i en stabil transgen linje. På den anden side gør mekanistisk forsøg vanskeligere mosaicisme og lille population af celler, der overudtrykker transgenerne i primært injiceret fisk.
Sammenfattende mosaik transgene strategi, giver et robust værktøj til hurtig og effektiv vurdering af den kooperative bidrag onkogener til tumor initiering og spredning. Forventes forhånd at generere skelsættende information om samspillet mellem kandidat onkogener, der er et presserende behov for yderligere produktiv undersøgelse af onkogene mekanismer og veje og for udviklingen af en effektiv målrettet behandling. Øge effektiviteten af cointegration på mere end tre coinjiceret DNA konstruktioner ville åbne mulighed for undersøgelse af de komplekse relationer mellem samtidigt udtrykt multigenfamilier kombinationer i forskellige Cancenter. Udfordringer for fremtiden vil være at ændre mosaik transgene strategi for at imødekomme enhver genomisk eller epigenetisk ændring, der kan spille en rolle i den neoplastiske proces, snarere end begrænse brugen til mutationer, der ændrer kun protein-kodning eller gener overudtrykt, tjente eller forstærkes. For nylig har forbedret genom redigering teknikker, såsom transskriptionsaktivator-lignende effektor nukleaser (Talens) 45 og grupperet regelmæssigt spatierede korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / CRISPR-associerede (CAS) systemer 46, bliver i vid udstrækning anvendes til hurtigere og mere effektivt ændre endogene gener i forskellige typer af celler og organismer 46. Sådanne teknikker vil give os mulighed for at udføre målrettede, højeffektive modifikationer af genom-sekvens og genekspression i zebrafisk model, og for bedre at forstå den mekanisme (r) ligger til grund for rollen af genomiske eller epigenetiske ændringer i tumor patogenese. Disse igen, sandsynligvis anspore the udvikling af nye molekylære lægemidler til en række af cancere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| pCR-TOPO vector | Invitrogen, CA | 451641 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs, MA | M0202M | |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix |
Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Gateway® BP Clonase® II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| GC-RICH PCR System | Roche Applied Science, IN | 12 140 306 001 | |
| Meganuclease I-SceI | New England Biolabs, MA | R0694S | |
| Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope | Nikon, NY | ||
| Nikon digital sight DS-U1 camera | Nikon, NY |
References
- Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
- Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).
- Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).
- Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).
- George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).
- Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Amatruda, J. F., Patton, E. E.
- Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
- Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
- Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).
- Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).
- Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).
- Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).
- Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).
- Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).
- Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
- Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).
- Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. , (2013).
- Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).
- Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E.
- Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
