Introduction
Os fungos filamentosos são excelentes sistemas de modelo para o estudo dos processos de desenvolvimento. Eles oferecem vários benefícios experimentais como cultivo barato, um elevado número de descendentes e acessibilidade genética. O último ponto é de particular relevância para a construção de transformantes que permite que se investigue a importância de genes tão longe descaracterizados para vários mecanismos celulares. Os fungos filamentosos têm sido fundamentais para a elucidação de vários elementos e mecanismos de controlo de qualidade das vias celulares, como a actividade de protease para a degradação de proteínas anormais, dinâmica mitocondrial para manter a integridade mitocondrial e autofagia para a remoção de excesso e / ou componentes celulares e para a manutenção disfuncionais viabilidade celular em tempos de fome 1,2,3.
Existem várias técnicas experimentais disponíveis para o estudo da autofagia em fungos filamentosos 2: (i) a investigação das vacúolos if eles contêm corpos autophagic densos quando as proteases são inibidas por microscopia electrónica de transmissão 4, (ii) a visualização de autofagossomas por monitorização focos GFP-Atg8 através de microscopia de fluorescência de 5,6 e (iii) detecção de estruturas autophagosomal acidificadas utilizando o corante fluorescente monodansyl cadaverina 7.
Aqui, um novo método para o crescimento de Penicillium chrysogenum para estudos autofagia é apresentado. O elemento principal é o 'pad fome ", que consiste simplesmente de agarose a 1% dissolvido em água de torneira esterilizada. Compostos adicionais (por exemplo, factores de stress, sequestrantes, moduladores autofagia) pode ser adicionado à almofada, enquanto eles não exibem auto-fluorescência. A almofada está localizada em lâminas de microscópio que contêm uma cavidade central raso. Esta almofada em inoculados com uma suspensão de esporos ou com fragmentos de micélio pequenos. O último é aconselhável se a estirpe de interesse não sporulate eficiente (por exemplo, estirpes atg1 Δ 8). As lâminas estão posicionadas em câmaras húmidas (estes podem ser facilmente construídas usando caixas de ponta de pipeta vazios) para evitar a secagem da amostra e incubou-se à temperatura ambiente. P. chrysogenum é capaz de crescer durante alguns dias sob estas condições. Autophagy pode ser observada microscopicamente por alargamento vacuolar que é um marcador positivo para autofagia fúngica. Nesta contribuição, a P. chrysogenum estirpe (Wisconsin 54-1255) é usado, que forma a proteína verde fluorescente que é direcionado para peroxisomes pela sua sequência C-terminal 'SKL «9. Por conseguinte, é possível monitorizar a degradação dos peroxissomas. É possível rotular também outros compartimentos da célula (por exemplo, mitocôndrias) usando os sinais de localização adequados e analisar a sua degradação. Embora os dados de P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) é apresentado aqui, é certamente possívelpara usar o método de 'almofada de fome ", também para outros fungos filamentosos (por exemplo, Neurospora crassa, Sordaria macrospora, espécies de Aspergillus, etc.).
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Protocol
1. Preparação de P. chrysogenum para os experimentos de fome
- Se o P. chrysogenum estirpe de juros é mantida em arroz ('arroz verde "), coloque 2-3 grãos de arroz cobertos com esporulação micélio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Preenchê-lo com 500 ul YGG (10 g / l de KCl, 20 g / l de glucose, 10 g / l de base azotada de levedura, 5 g / l de K 2 HPO 4, 20 g / l de extracto de levedura).
- Vortex o tubo durante 30 segundos de modo a que os esporos podem separar de forma eficiente o arroz.
- Incubar o tubo durante 1 dia a temperatura ambiente (por exemplo, entre 20 e 25 ° C).
- Preparar uma diluição dessa suspensão de esporos na água da torneira estéril 1/50, misture bem.
- Se o P. chrysogenum estirpe de interesse é mantida numa placa de agar (por exemplo, YGG placa de agar), transferir pequenos pedaços de micélio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 400 ul de água de torneira esterilizada e cerca de 100 mg glgrânulos burro usando um palito estéril ou ponteira.
- Vortex o tubo durante 2 minutos de modo que se torna o micélio fragmentado. Utilizar o conteúdo do tubo imediatamente.
2. Passos preparatórios para o cultivo de P. chrysogenum em Pads de fome
- Ligue a placa de aquecimento e configurá-lo para cerca de 60 ° C.
- Dissolve-se 2 g de agarose em 100 ml de água da torneira por cozimento a solução num forno de microondas. Tome cuidado para que esta solução é completamente claro após o aquecimento. Se não for, cozinhá-lo novamente até que a agarose é dissolvido completamente. Deixar a solução arrefecer de agarose a cerca de 60 ° C antes da utilização.
- Encher tubos de 1,5 ml de microcentrífuga (2-4, dependendo o número de amostras) com 400 ul de água estéril (sem toque em cada um adicionados compostos adicionais) ou 400 ul-x (x adição de uL de solução do composto no passo 2.5) e colocá-los sobre a placa de aquecimento durante pelo menos 1 minuto, de modo que o water dentro fica quente.
- Colocar as lâminas de microscópio que contêm uma cavidade central sobre a placa de aquecimento durante pelo menos 1 min.
- Adicionar 400 ul de 2% de agarose para a solução nos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e vortex brevemente. Após este passo, se desejado, adicionar compostos adicionais (ou seja, 1 uM de rapamicina). Se isso for feito, vortex brevemente depois de cada substância adicional é pipetado para o tubo. Colocar os tubos de volta para a mesa de aquecimento para evitar a solidificação prematura.
NOTA: O volume total no tubo de microcentrífuga deverá ser de 800 uL.
3. Preparação de microscópicas Contendo Inanição Pads
- Pipetar 140 uL da solução de agarose para dentro da cavidade da lâmina de microscópio (ainda que está localizado na placa de aquecimento). Tente evitar fazer bolhas, se possível.
- Imediatamente coloque uma lamela para a solução de agarose.
NOTA: Este vai resultar em uma superfície plana. - Coloque o microâmbito deslizante na bancada do laboratório para aproximadamente 4 min para permitir a almofada de agarose para solidificar.
- Remova cuidadosamente a lamela do pad agarose, deslizando-a com a ajuda de um polegar ou o dedo indicador (usar luvas para evitar a contaminação!).
- Coloque a lâmina de microscópio com a almofada em uma câmara úmida para evitar a dessecação. Recomendação: Use uma caixa de ponta vazia que ainda tem o insert para manter as pontas de pipeta. Adicionar água estéril para a caixa de modo que o fundo é coberta. Coloque as lâminas de microscópio para a inserção e fechar a caixa.
4. inoculação da inanição Pads com P. chrysogenum e incubação
- Pipetar 5 ul de uma diluição 1/50 de esporos (se as culturas foram cultivadas em arroz) ou 5 ul da solução não diluída contendo fragmentos de micélio (se as culturas foram cultivadas numa placa de agar) para o centro da almofada de inanição.
- Feche a câmara úmida e envolvê-la em um saco plástico (isso serve comoproteção adicional contra a dessecação das almofadas de fome). Tenha cuidado para não mover a caixa muito, porque de outra forma as gotas de inoculação será perturbado.
- Armazenar a caixa embrulhada à temperatura ambiente durante pelo menos 20 h, antes de analisar as amostras.
5. microscópica análise das amostras
- Após 20 horas de incubação, as amostras estão prontas para análise microscópica; colocar a lâmina de microscópio em papel tecido seco (o fundo tende a ficar molhado).
- Pipetar um pequeno volume de água (cerca de 50 mL) para a almofada de inanição. Coloque uma lamela sobre o bloco e esprema a água excedente. Retire o excesso de água com um lenço de papel.
- Colocar a lâmina do microscópio sobre a mesa de observação de um microscópio de fluorescência. Para obter uma visão geral de crescimento micelial, use um objetivo 20X. Uso objectivos 63x ou 100x para estudar a localização de GFP nas hifas. A fim de evitar a dessecação progressiva da amostra não analisar as amostras durantemais de 15 min antes de colocá-los de volta para a câmara úmida.
- Repita 5,3 em intervalos regulares (por exemplo, depois de 40 horas e 60 horas de crescimento).
NOTA: A amostra pode ser colocado de volta na câmara úmida. Não é necessário retirar as lamelas uma vez que não afecta o crescimento do micélio.
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Representative Results
Para demonstrar a utilidade do protocolo detalhado acima degradação de peroxissoma no P. chrysogenum estirpe Ws54-1255 (GFP-SKL) foi analisada. Nesta estirpe GFP-SKL é geralmente importada para peroxisomes 9. Isto resulta no aparecimento de múltiplas formas esféricas quando a amostra é analisada através de microscopia de fluorescência. Se ocorrer a autofagia, vacúolos ampliar. GFP-SKL é incorporado vacúolos por autofagia (pexophagy). Devido ao facto de que a GFP é resistente à degradação por proteases vacúolo rotula estes organelos 10. Por conseguinte, os dois parâmetros de observação autofagia (pexophagy) nesta estirpe, o alargamento vacúolo e localização de GFP-SKL de vacúolos, estão convenientemente monitorizada por microscopia de fluorescência.
Ao longo de 20 h de incubação, a GFP nunca é observado em vacúolos (Figura 1). Além disso, o alargamento vacúolo não está ocorrendo. No entanto, a 40 h de crescimento marcado com GFP vacúolostornam-se visíveis em algumas das hifas, indicando autofagia (pexophagy) para se tornar ativo (Figura 1). Em 60 horas de crescimento da quantidade de vacúolos marcado com GFP aumentou ainda mais. Como controle negativo atg1 um mutante do P. Δ chrysogenum foi utilizada (Δ atg1 (GFP-SKL)) (Figura 2). Nem vacúolos alargada nem marcado com GFP pode ser observado na presente estirpe. Como controlo positivo, a rapamicina droga estimulante de autofagia é usado (Figura 3). Após 40 h de crescimento vacúolos marcado com GFP tornar-se visível. Em 60 horas, as hifas estão completamente preenchidos com grandes vacúolos contendo GFP (Figura 3). Este resultado indica que, como esperado, a autofagia maciça ocorre aqui. Coletivamente, estes resultados demonstram a validade do experimental set-up.
Figura 2:. Localização de GFP-SKL no Δ atg1 (GFP-SKL) durante o cultivo em almofadas de fome Nos tempos indicados, as culturas cultivadas em almofadas de fome foram analisadas utilizando microscopia de fluorescência. Imagens representativas são mostrados para cada ponto de tempo. Correspondente áreas de campo brilhantes são mostrados abaixo de cada fluorescênciaimagem do canal. Barras de escala: 10 um. 
Figura 3:. Localização de GFP-SKL no Ws54-1255 (GFP-SKL) tratados com rapamicina para a indução de autofagia nos tempos indicados culturas cultivadas em almofadas de fome suplementado com 1 fiM de rapamicina foram analisadas utilizando microscopia de fluorescência. Imagens representativas são mostrados para cada ponto de tempo. Correspondentes áreas de campo brilhantes são mostradas cada imagem canal de fluorescência abaixo. Branca "v": GFP-SKL localizada vacúolos indicando degradação peroxisome. Barras de escala: 10 um.
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Discussion
O método aqui apresentado permite o estudo conveniente e reprodutível de autofagia em P. chrysogenum. Por exemplo, ele pode ser usado para o rastreio de a eficácia de vários compostos se eles são capazes de modular a resposta autofagia deste fungo ou não. Os resultados obtidos com rapamicina demonstram que a inibição da sinalização de TOR conduz a uma indução de autofagia pronunciada em P. chrysogenum que foi também demonstrada para outros organismos 11.
É possível utilizar micélios cultivados em almofadas de fome para análise em microscópio mais sofisticados (por exemplo, microscópios confocais laser scanning). Não importa se a amostra é colocada abaixo do objetivo de acima do objetivo (microscópio invertido). Várias proteínas fluorescentes orientados para certos compartimentos pode ser utilizado para monitorizar o destino das diferentes organelas durante autofagia (por exemplo, as mitocôndrias -> mitophagy; r endoplasmáticoeticulum -> ER-phagy, etc).. Em resumo, a técnica aqui descrita estende o espectro de métodos para estudar microscopicamente fungos 12.
O protocolo é geralmente simples e fácil de usar. No entanto, é muito importante que as almofadas de fome nunca desidratar como isto irá resultar em artefactos e morte celular. Por conseguinte, é fortemente sugerido que (i) as lâminas de microscópio que contêm a solução de agarose ainda líquido são removidos imediatamente a placa de aquecimento (passo 3.3), (ii) que a lâmina de cobertura para a tomada de uma superfície plana é removida da almofada depois de um jejum máximo de 5 min (os passos 3.3 e 3.4), (iii) que a lâmina do microscópio é sempre mantido na câmara húmida quando não analisado (passos 3.5 e 5.4) e (iv) que a análise microscópica não leva mais do que 15 minutos (etapa 5.3). Outro aspecto importante é que o montante inicial de esporos ou fragmentos de micélio pipetados sobre a almofada de fome não deve ser muito alto oumuito baixo. Isto pode ser facilmente controlada por diluição do stock usando água da torneira esterilizada. A diluição 1/50 descrito em 1.1.3 funciona bem para P. chrysogenum suspensões de esporos. É a diluição recomendada para uso com nossos fungos, mas pode exigir alguns ajustes.
Uma limitação deste método é que não é aconselhável para experiências de imagiologia de lapso de tempo para mais de 15 min. Isto é devido à dessecação progressiva da almofada de fome, uma vez que é removido da câmara húmida. Se forem necessários tempos de observação mais longos, é possível adicionar pequenas quantidades de água de torneira esterilizada à margem da almofada fome embora isso não impede que alguns dessecação em regiões centrais da pad. Outra limitação é que o método não é estritamente quantitativo. Em organismos unicelulares é possível marcar eventos por célula (por exemplo, a quantidade de células contendo GFP no vacúolo). Em contraste, P. chrysogenum como fungos filamentosos é characterizados por uma arquitetura multicelular. As células são divididas por septos que contêm uma poro central que permite a passagem de citoplasma e organelas. Portanto amostras podem ser analisadas apenas 'semi quantitativamente "(por exemplo, número de hifas contendo GFP localizada vacúolos). Para alcançar significância é muito importante que o número de hifas analisado é suficientemente elevada (pelo menos 80 por ponto de tempo e as condições testadas, mas é definitivamente mais preferível).
A utilização de almofadas de fome para estudar autofagia podem ser facilmente adaptados para utilização noutros fungos filamentosos. Portanto, o protocolo apresentado aqui não se limita apenas a P. chrysogenum. Também deve ser possível adaptá-lo para com unicelular fungos, ou seja, leveduras. Transferência do protocolo para organismos superiores (por exemplo, nemátodos) provavelmente requer adaptações mais especializadas. Será interessante verificar se o método descrito no presente trabalho também encontraa sua utilização em outros campos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
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