Abstract
Durante batteriemia Streptococcus pneumoniae può traslocare attraverso l'endotelio vascolare nel miocardio e formare batteri-riempite discrete lesioni microscopiche (microlesioni) che sono notevoli per l'assenza di infiltrarsi cellule immunitarie. Grazie alla loro rilascio di prodotti cardiotossici, S. pneumoniae entro microlesioni si pensa di contribuire allo scompenso cardiaco che è spesso osservato durante fulminato malattia pneumococcica invasiva negli adulti. Qui è dimostrato un protocollo per infezione sperimentale del mouse che porta alla formazione di riproducibili microlesion cardiaco entro 30 ore. L'istruzione è fornita sull'identificazione microlesion in ematossilina e eosina sezioni cuore colorato e le distinzioni morfologiche tra inizio e fine microlesioni sono evidenziati. L'istruzione è fornita su un protocollo per la verifica di S. pneumoniae entro microlesioni utilizzando anticorpi contro pneumococco polisaccaride della capsula emicroscopia a immunofluorescenza. Infine, è previsto un protocollo di intervento antibiotico che salva i topi infetti e per l'individuazione e la valutazione di formazione della cicatrice nel cuore dei topi convalescente. Insieme, questi protocolli faciliteranno lo studio dei meccanismi molecolari alla base dell'invasione cardiaco pneumococco, la morte dei cardiomiociti, rimodellamento cardiaco a seguito di esposizione a S. pneumoniae, e la risposta immunitaria al pneumococchi nel cuore.
Introduction
Ricovero di adulti per polmonite acquisita in comunità (CAP) comporta un rischio documentato per eventi avversi cardiaci che contribuisce alla mortalità 1-4. In un recente studio condotto da Corrales-Medina et al. Sono risultati associati con e / o responsabile del 27% dei decessi polmonite associata 3 complicazioni cardiache. Streptococcus pneumoniae (pneumococco), la causa più comune di PAC e sepsi 5, è stata direttamente associata ad eventi avversi cardiaci a ben il 19% dei pazienti adulti ricoverati 6. Eventi cardiaci avversi associati con polmonite includono insufficienza nuovo o peggiorata cardiaco congestizio, aritmie, infarto del miocardio e in ordine decrescente di frequenza 6.
In un recente articolo PLoS Pathogens da Brown et al., S. pneumoniae è risultata capace di traslocazione attraverso l'endotelio vascolare cardiaca, l'ingresso nel myocardium, e la formazione di discrete lesioni microscopiche non purulente (microlesioni) pieni di batteri nei ventricoli durante la malattia pneumococcica invasiva (IPD) 7. Prove di formazione microlesion cardiaca è stata osservata in campioni cardiaci dai primati non umani e gli individui che avevano ceduto alle infezioni da pneumococco. Allo stesso modo, i topi infettati sperimentalmente riproducibile sviluppato microlesioni cardiaci. Nei topi, le dimensioni e il numero microlesion stata positivamente correlata con la durata e la gravità di batteriemia, livelli di troponina cardiaca nel siero, e aberrante elettrofisiologia cardiaca. Traslocazione batterica nel cuore è stato trovato per avvenire attraverso gli stessi meccanismi responsabili traslocazione del pneumococco attraverso la barriera emato-encefalica e lo sviluppo della meningite pneumococcica, vale a dire, la proteina-Colina legame Un'invasione mediata delle cellule endoteliali vascolari in un recettore laminina e piastrine modo dipendente recettore del fattore di -activating 8. Microlesformazione di ioni richiesto anche il pneumococco formano pori tossina pneumolysin che è stato trovato per uccidere cardiomiociti 7.
Microlesioni cardiaci pneumococco sono distinti dal purulenta dei tessuti molli e ascessi cardiaci che sono causate da altri batteri Gram-positivi, tra cui Staphylococcus aureus. Questi sono caratterizzati da un unico foci di batteri circondato da neutrofili e deposizione di fibrina 9,10. Microlesioni formata da S. pneumoniae sono di dimensioni più piccole, distribuiti su tutto il cuore colpito, e la mancanza di infiltrati di cellule immunitarie. Durante le prime fasi dell'infezione, microlesioni causate da S. pneumoniae appaiono come aree di tessuto danneggiato o infiammato ricorda i segni patologici di cardiomiopatia. Alcuni monociti possono essere osservati durante questo tempo, ma la loro presenza è di breve durata e lesioni rapidamente diventa necrotico nell'aspetto e riempito con batteri contemporaneamente continuando a grow dimensioni fino alla morte dell'animale o interventi antimicrobica. È importante sottolineare che, entro 3 giorni di intervento antibiotico, profusa infiltrazione di cellule immunitarie si osserva presso l'ex sede della lesione e questo è accompagnato da una robusta deposizione di collagene. Simile rimodellamento cardiaco è stato riscontrato dopo infarto insieme con conseguenze permanenti sulla funzione cardiaca 11-15. Così, microlesioni sono una potenziale spiegazione per gli eventi avversi cardiaci che si verificano durante IPD e forse la maggiore incidenza di mortalità cardiaca correlata in individui di convalescenza che sono sopravvissuti l'episodio di malattia.
Qui, l'istruzione è disponibile sul modello sperimentale murino di IPD e formazione della lesione cardiaca e la visualizzazione delle microlesioni cardiaci a precoci e tardive fasi dell'infezione. Il protocollo per la rilevazione di deposizione di collagene in animali che sono stati salvati da un intervento antimicrobico è dimostrata. L'obiettivo di questo articolo è quello di facilitate ricerca di altri investigatori su questo importante e nuova patologia pneumococcica.
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Protocol
NOTA: Tutti gli esperimenti del mouse sono stati esaminati e approvati dalla cura degli animali e Istituzionale Usa Comitati presso l'Università del Texas Health Science Center a San Antonio (protocollo # 13032-34-01C). La cura degli animali e protocolli sperimentali aderito Diritto Pubblico 89-544 (Animal Welfare Act) e successivi emendamenti, Servizi pubblici Salute linee guida, e la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (US Department of Health & Human Services).
1. Infezione
- Ottenere topi BALB / c di entrambi i sessi di età compresa tra 10-12 settimane di età tra.
GLI APPUNTI. pneumoniae sierotipo 4 ceppo TIGR4 è un isolato clinico virulenta che è stato sequenziato 16. - Grow TIGR4 in Todd-Hewitt brodo a 37 ° C in 5% CO 2 fino a raggiungere una densità ottica (OD) 620 0,5 (corrispondente a 1,0 x 10 8 unità formanti colonie [CFU] / ml). Pellet cultura pneumococcica mediante centrifugazione per 10 min a 3, 500 xg e rimuovere il supernatante utilizzando una linea del vuoto. Sospendere e diluire batteri con PBS sterile (PBS) ad una concentrazione finale di 1,0 x 10 4 CFU / ml.
- Usando una camera di induzione, anestetizzare topi con 2,5% isoflurano vaporizzato in ossigeno. Confermare stato anestetizzato dal pizzico punta dolce con le pinzette smussate.
- Tenendo il mouse anestetizzato dal suo nuca e verticale con una mano, iniettare ciascun topo per via intraperitoneale (ip) con 100 microlitri della S. sospensione pneumoniae usando una siringa con un ago calibro 27-30 (corrispondente ad una dose di 1,0 x 10 3 CFU). Posizionare la parte posteriore del mouse nella sua gabbia. I topi in genere risvegliano 30-40 secondi dopo l'iniezione.
- Lasciare che l'infezione di procedere per almeno 24 (presto) o 30 (avanzato) h.
- Euthanize i topi da CO 2 asfissia. Eseguire dislocazione cervicale per garantire il mouse è deceduto. L'eutanasia è ulteriormente confermata dalla rimozionedel cuore nel passo 1.6.
- Disinfettare la coda con un batuffolo imbevuto di alcool e tagliare una sezione di 2-3 mm. Raccogliere 2 ml di sangue e serialmente diluire il sangue 10 volte in PBS contenente eparina sodica 1 U / ml cinque volte. Diluizioni seriali piastra su un piatto trittico di agar sangue soia e incubare una notte a 37 ° C in 5% CO 2. Il giorno successivo estrapolare dalla colonia conta il livello di batteriemia.
- Immobilizzare il mouse in posizione supina su una piattaforma chirurgica. Spruzzare il petto con il 70% di etanolo e asciugare. Utilizzando forbici chirurgiche e pinze aprire la cavità toracica, rimuovere la gabbia toracica, e transetto il diaframma per esporre il cuore ei polmoni. Utilizzando forbici tagliare i vasi sanguigni collegati al cuore e alle accise delicatamente cuore con cura per evitare lividi con una pinza.
- Sciacquare il cuore con PBS e poi mettere in campioni di tessuto cassette di raccolta di tali sezioni coronali che sarebbero stati ottenuti durante il sezionamento dei tessuti. Per embedding di paraffina, plaCe le cassette in soluzione al 10% di formalina tamponata-e il giorno successivo invio per paraffina.
- In alternativa freeze flash utilizzando ottobre Compound entro un cryomold che è stato immesso sul ghiaccio secco.
2. Visualizzazione cardiache lesioni e pneumococchi all'interno lesioni
- Ridurre le sezioni cardiache in paraffina tale che i 4 camere del cuore sono visibili in ogni sezione di tessuto. Tagliare vetrini a spessore di 5 micron.
- Deparaffinare e macchia diapositive con ematossilina e eosina (H & E) usando metodi standard 17.
- Vista H & E macchiato sezioni cardiache utilizzando un microscopio ottico a bassa (100X, 200X) e alta (immersione in olio: 400X, 1,000X) ingrandimenti. Caratterizzare cuori per la presenza di microlesioni nel miocardio. Qui, l'acquisizione di H & E le immagini utilizzando un microscopio Zeiss Axioskop 2 dotato di 100X 1.3 numerica obiettivo dell'apertura Plan-Neofluar.
NOTA: nelle fasi iniziali l cardiacoesions sono discriminati per il loro aspetto colorato differenziale e in alcuni casi la presenza di cellule immunitarie (monociti e granulociti) che sembrano essere monociti. In lesioni avanzate, in particolare quelli visti a 30 ore, le cellule immunitarie sono lesioni vacuolo come assenti e grandi sono stati osservati nel loro posto. È importante notare che, mentre afflusso cellule immunitarie durante le prime fasi di sviluppo lesione cardiaca può verificarsi non risulta essere un requisito.
3. immunofluorescente Microscopia per pneumococchi all'interno microlesioni
- Cuore Sezione in cryomolds con microtomo ad uno spessore di 5 sezioni micron e posto su vetrino carica positiva. Consenti sezioni cardiache decongelamento e aria secca. Fissare sezioni per 10 min a 10% formalina tamponata neutra (pH 6.8-7.2 a 25 ° C).
- Lavare slitte (3x) in PBS per 5 min, permeabilize per 15 min in 0,2% Triton X-100 in PBS, poi lavare di nuovo in PBS.
- Secti tessuto Block su su vetrini con siero di capra 10% in PBS per 1 ora.
- Sciacquare i vetrini con PBS, coperchio e incubare sezioni cardiache con coniglio anti-pneumococco sierotipo 4 antisiero a 1: 1000 in PBS con siero di capra 10% per 2 ore a 37 ° C.
NOTA: Per i controlli negativi investigatori dovrebbero utilizzare antisiero di coniglio ingenuo - Dopo lavaggio con PBS, coperchio e incubare sezioni con 10% di siero di capra-PBS con capra anti-coniglio FITC anticorpo coniugato a 1: 2.000 per 30 min a 37 ° C.
- Seguendo le istruzioni del produttore, utilizzare DAPI (4 ', 6 Diamidino-2-fenilindolo) a 5 mg / ml per la visualizzazione dei nuclei eucariotiche. Lavare e montare sezioni di tessuto con FluorSave.
- Acquisire le immagini fluorescenti utilizzando un sistema di microscopio confocale sia a bassa che ad alta ingrandimento. Regolare l'apertura numerica di conseguenza per ottenere risultati ottimali. Qui, acquisire immagini fluorescenti utilizzando un sistema confocale con un obiettivo 60X apertura numerica 1.42.
- Inizia con i topi infettati con ip 1.0 x 10 3 CFU di TIGR4 come precedentemente indicato al punto 1.
- Con inizio alle 30 ore dopo l'infezione, amministrare grado farmaceutico ampicillina ip (80 mg / kg di peso corporeo) in 100 ml di soluzione salina ogni 12 ore per 36 ore. Raccogliere i cuori al punto desiderato e di processo come descritto al punto 1.6 per paraffina e il tessuto, il sezionamento.
5. deposizione di collagene Detection
- Utilizzando xilene e lavaggi alcol classificati con acqua, Deparaffinare e idratare le sezioni di tessuto deionizzata utilizzando metodi standard 17. Trattare sezioni con acquosa 0,2% di acido fosfomolibdico per 5 minuti e risciacquare con acqua deionizzata per 5 min.
- Sezioni Macchia con 0,1% di Sirius Red in acido picrico per 2 ore a temperatura ambiente.
- Lavare le sezioni in 0,01 N acido cloridrico per 3 minuti e risciacquare con etanolo al 70% per 1 min.
- DisidratazioneTE sezioni con l'identico ma l'ordine di lavaggi a quello delineato in 5.1 invertire, disidratare le sezioni cardiache in aumento e graduale delle concentrazioni di etanolo poi xilene.
- Sezioni di Monte di tessuto con una soluzione di montaggio per la valutazione microscopica.
- Per identificare le regioni di deposizione di collagene, esaminare sezioni di tessuto colorate per le zone di profonda colorazione lettura in condizioni di scarsa e alto ingrandimento con un microscopio ottico. Ogni area all'interno dei ventricoli del cuore che è il rosso è un settore in cui il collagene è stato depositato. Aree senza questa macchia rosso sono siti di tessuto sano privi deposizione di collagene. Qui, acquisire Picro Sirius Red immagini colorate utilizzando un microscopio equipaggiato con un obiettivo apertura numerica 20X 0.5.
NOTA: Le macchie rosse Atrium in tessuti sani.
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Representative Results
Visualizzazione di microlesioni da H & E
Microlesioni cardiaci sono stati osservati nei ventricoli di H & E macchiato sezioni cardiache di topo con IPD seguenti la loro sfida ip con TIGR4. Figura 1 dimostra l'aumento delle dimensioni di queste lesioni tra 24 e 30 ore dopo l'infezione (HPI), con maggior numero di ematossilina -stained (cioè, viola-blu) pneumococchi visibile all'interno della lesione. Microlesioni sono stati caratterizzati da una morfologia vacuolo-like, denso eosina (rosso) colorazione dei cardiomiociti nelle cellule immediatamente adiacenti al sito della lesione, diplococchi all'interno delle lesioni, e un'assenza generale di cellule immunitarie. Circa la metà delle lesioni erano adiacenti ai vasi sanguigni visibili. Tra 24 e 30 HPI microlesioni diventati sempre più numerosi e sostanzialmente più grande. Al 30 hpi batteri extracellulari possono spesso essere visto in streaming da una lesione tra le cellule.
Visualizatisu S. pneumoniae Utilizzando immunofluorescenza microscopia
Per visualizzare e confermare che S. pneumoniae fosse effettivamente entro lesioni, è stato utilizzato per la colorazione di immunofluorescenza sierotipo 4 polisaccaride capsulare che viene prodotto da TIGR4 (Figura 2). Le immagini acquisite hanno evidenziato la presenza di aggregati, serrato e denso di S. pneumoniae all'interno dei siti microlesion.
Prove di cicatrici Cardiac
Picro Sirius Red colorazione è stata eseguita su sezioni cardiache da topi che erano stati salvati con ampicillina e controlli non infetti. In antibiotici salvato topi convalescenti, c'è stato un drammatico aumento della presenza e l'intensità della macchia Picro Sirius rosso con bande in streaming da quelli che sembrano essere gli ex siti di lesione nei ventricoli (Figura 3). Al contrario, i ventricoli in sezioni di controllo sono state senza macchia che indica che la deposizione di collagene era assente (Non mostrato).
Insieme, questi risultati dimostrano la capacità di visualizzare microlesioni cardiaci nei topi con grave IPD e di accedere a formazione di cicatrici risultante nei ventricoli utilizzando procedure istologiche standard. È importante sottolineare che, microlesioni cardiaci sono sempre legati a titoli elevati di S. pneumoniae e il tempo necessari per mediare la loro formazione.
Figura 1: Rilevamento di microlesioni nelle sezioni cardiache H & E macchiato Immagini rappresentative (1,000X) di microlesioni cardiaci osservati a 24 Hor e 30 ore dopo l'infezione.. Barre di scala nera corrispondono a 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2: rilevazione immunofluorescente di S. pneumoniae all'interno microlesioni cardiaci. microscopia a immunofluorescenza utilizzando anticorpi contro il sierotipo 4 polisaccaride capsulare (verde) ha confermato la presenza di S. pneumoniae all'interno microlesioni cardiaci. I nuclei sono stati colorati blu con DAPI. Bar Bianco scala corrisponde a 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la deposizione di collagene in un ex sito microlesion cardiaco in un topo di convalescenza un'immagine rappresentante (200X) che mostra una Picro Sirius Red macchiato microlesion cardiaca nel ventricolo di un mouse 5 giorni dopo l'intervento antibiotico per in.malattia pneumococcica invasiva. Il rosso indica deposizione di collagene. Barra della scala nera corrispondono a 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo rapporto, un metodo altamente riproducibile per indurre S. pneumoniae mediata microlesioni cardiaci nei topi durante IPD e le tecniche per la loro visualizzazione è dimostrata. I topi sono infettati con una dose di batteri che supera la soglia del sistema immunitario di attestazione, portando a batteriemia alta qualità, simile a quella che si verifica durante la sepsi umana, e conduce ad eventuali traslocazione batterica nel miocardio. Per ragioni ancora sconosciute, S. pneumoniae nel cuore è in grado di replicare undeterred dalla risposta immunitaria dell'ospite. Questo è l'oggetto di indagini in corso e di questa pubblicazione può facilitare altri ricercatori nei loro sforzi per partecipare.
H & E colorazione consente la visualizzazione microlesion utilizzando microscopio ottico di serie dal cardiomiociti macchia rosa al rosso, mentre le microlesioni cardiaci e batteri all'interno macchia blu al viola intenso. Questo forte contrasto consente una facile detectisu delle microlesioni nelle fasi successive di infezione quando le lesioni sono più grandi. Al fine di verificare la presenza di S. pneumoniae nei microlesioni cardiaci, è stata eseguita microscopia a immunofluorescenza utilizzando antisiero contro il sierotipo 4 polisaccaride capsulare che viene portato da TIGR4. È importante sottolineare che l'anticorpo anti-capsulare specifica da utilizzare dipende dal sierotipo del ceppo pneumococco che viene utilizzato per la sfida sperimentale. In alternativa, gli investigatori possono anche utilizzare gli anticorpi monoclonali disponibili in commercio contro pneumolysin, la tossina poro formazione di S. pneumoniae, o che rilevano componenti della parete cellulare pneumococco (cioè, TEPC-15). Mentre questi anticorpi rilevano pneumococchi nel cuore, l'esperienza passata suggerisce che gli anticorpi contro polisaccaride capsulare forniscono le immagini più avvincenti 7.
S. pneumoniae mediata formazione microlesion cardiaco richiede l'interazione dila adesina pneumococco colina binding protein A con la proteina ospite laminina recettore per l'adesione dei batteri alle cellule endoteliali vascolari e l'interazione di batteri cellule fosforilcolina muro con ospite Platelet-attivazione del recettore del fattore di trasmigrazione batterica attraverso la cella 7,8. È quindi importante notare che la formazione microlesion è strettamente legata al peso e tempo infettiva, che aumenta la frequenza e la durata di queste interazioni e permette di tempo per i batteri replicare e lesioni visibili sviluppare. Abbiamo stabilito in precedenza che una dose infettiva ip maggiore di 1,0 x 10 3 CFU di S. ceppo pneumoniae TIGR4 provoca troppo rapida morte del mouse e di conseguenza scarsa formazione di lesioni. Sotto questo infettiva dose di gioco spontaneo si verifica in alcuni topi e in altri insorgenza ritardata di malattia grave si osserva. Eppure, per i topi sfidato con 1,0 x 10 3 CFU di TIGR4 tra 24 e 36 ore,lesioni rapidamente si accumulano in numero e crescono in dimensioni continuamente fino a quando il mouse diventa moribondo. Pertanto, la dose infettiva del ceppo infettante deve essere titolata per replicare un simile stato di malattia con uno stato moribondo sviluppo in non meno di 30 hpi. È importante sottolineare che, abbiamo più volte osservato la formazione di lesione cardiaca nei topi che sono stati infettati intranasale con 1.0 x 10 7 CFU e tracheale con 1.0 x 10 5 CFU di TIGR4. A seguito di questi sfida percorsi di sviluppo di malattia grave si è verificata in momenti successivi. Abbiamo anche osservato formazione microlesion con altri ceppi virulenti di S. pneumoniae, come sierotipo 2 isolare D39, sebbene a differenti frequenze. Pertanto, le lesioni non sono il risultato del percorso dell'infezione ip o specifici per TIGR4, ma invece legati a durata e gravità della patologia puntata. Qui vi consigliamo di infettare topi ip poiché questo percorso sfida offre il più alto grado di riproducibilità. Se un diffceppo erente di S. pneumoniae è usato o una rotta infettiva diverso si desidera, gli investigatori dovrebbero mirare a batteriemia a livelli> 10 5 CFU ml di sangue per almeno 24 ore.
Intervento antimicrobica permette lo studio degli eventi che si verificano durante la convalescenza, modellare un essere umano nella regolazione Unità di Terapia Intensiva. Vale la pena notare che non tutti i topi sopravvivono nonostante il trattamento antimicrobico e confermato la clearance batterica. Gli investigatori devono aspettarsi tassi di sopravvivenza tra il 50-60% e come tale dovrebbe regolare le dimensioni di coorte di conseguenza per affrontare la perdita di animali. Monitoraggio regolare degli animali dopo 24 ore si consiglia vivamente di garantire il rispetto istituzionale approvato i protocolli di animali. Picro Sirius Red colorazione è una tecnica semplice e standard utilizzati per la visualizzazione deposizione di collagene. Qui, si è dimostrato come questa macchia può essere utilizzato per esaminare rimodellamento cardiaco nei ventricoli del cuore a seguito di un infectiou traumaticas episodio. Picro Sirius Red stata scelta rispetto ad altre tecniche comunemente utilizzate per visualizzare deposizione di collagene, come "di Masson tricromica Stain", a causa della forte contrasto offriva tra il collagene depositato e tessuto circostante. Questo ha dimostrato di essere estremamente utile nel valutare il grado di infarto deposizione di collagene dopo antibiotico in maniera quantitativa utilizzando software come ImageJ.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
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