Abstract
Lever ontsteking als reactie op letsel is een zeer dynamisch proces dat de infiltratie van verschillende subtypen van leukocyten, waaronder monocyten, neutrofielen, T-cel subsets, B-cellen, natuurlijke killer (NK) en NKT cellen. Intravitale microscopie van de lever toezicht immuun celmigratie is een bijzondere uitdaging vanwege de hoge eisen met betrekking monstervoorbereiding en fixatie, optische resolutie en langdurige dieroverleving. Toch kon de dynamiek van inflammatoire processen, alsmede cellulaire interactie onderzoeken kritische informatie om beter te begrijpen de initiatie, progressie en regressie van inflammatoire leverziekte bieden. Daarom werd een zeer gevoelige en betrouwbare methode vastgesteld migratie en cel-cel-interacties van andere immuuncellen in muizenlever gedurende lange perioden (ongeveer 6 uur) door intravitale twee-foton laser scanning microscopie (TPLSM) studie in combinatie met intensive care monitoring.
ent "> Werkwijze ontvangen omvat een zachte preparaat en stabiele fixatie van de lever met minimale verstoring van het orgaan en lange termijn intravitale beeldvorming met multicolor multifoton microscopie met vrijwel geen fotobleken en fototoxische effecten gedurende een periode van maximaal 6 uur, waardoor volgen van specifieke leukocyten subsets en stabiele beeldvorming omstandigheden te wijten aan een uitgebreide controle van de muis vitale parameters en stabilisatie van het verkeer, de temperatuur en de gasuitwisseling.Om lymfocytenmigratie op leverontsteking onderzoeken CXCR6.gfp knock-in muizen werden onderworpen aan intravitale leverbeeldvorming onder basisomstandigheden en na acute en chronische leverschade geïnduceerd door intraperitoneale injectie (s) van koolstoftetrachloride (CCl4).
CXCR6 is een chemokine receptor expressie op lymfocyten, voornamelijk Killer Natural T (NKT) -, Natural Killer (NK) - en subsets van T-lymfocyten zoals CD4 T-cellen maar ook mucosale Associated invariante (MAIT) T-cellen 1. Naar aanleiding van de trekkende patroon en de positionering van CXCR6.gfp + immuuncellen toegestaan een gedetailleerd inzicht in hun veranderde gedrag op leverschade en dus hun mogelijke betrokkenheid bij progressie van de ziekte.
Introduction
De visualisatie van cellen en cellulaire functies geheel organen of zelfs hele organismen is van groot belang voor meer dan 50 jaar, waaronder vrijwel alle delen van het lichaam 2. Daarom zijn sommige vroege studies reeds in dienst intravitale beeldvorming van de lever 3,4. Echter, een aantal beperkingen bestaan op de hoogte over de lange termijn een stabiele hoge-resolutie beeldvorming van leverweefsel.
Door de anatomische positie van de lever in nauw contact met het membraan en het maagdarmkanaal 5, het meest voorkomende probleem voor microscopische beeldvorming intravitale beweging door ademhaling en, in mindere mate, peristaltische van het darmkanaal 6. In vergelijking met andere vaste organen, lever chirurgie is een bijzondere uitdaging. Vanwege de dichte microvasculaire structuur, kan chirurgische manipulatie leiden tot massale hemorragische laesies, verminderde microcirculatie 7 en ook de activering van de ingezeten immune cellen zoals Kupffercellen 8. Daarom mechanische fixatie van het weefsel zoals elders gepubliceerd 6,9 waarschijnlijk interfereren met het opklaren beeldvorming.
In een gezonde lever, 10-15% van het totale bloedvolume bevindt in de lever vaatstelsel en het orgaan ontvangt ongeveer 25% van de totale hartminuutvolume 10, waardoor het orgaan zeer gevoelig voor veranderingen in de bloedsomloop (bijv bloeddrukschommelingen ). Daarom zal storingen in de doorbloeding van de lever als gevolg van bv, shear stress, verplaatsing, verwondingen door overmatige weefsel behandeling of gecentraliseerde circulatie leiden tot kunstmatige veranderingen in leukocyten trekgedrag, verminderde lever- zuurstofvoorziening en daarom verdere beschadiging van de lever, waardoor de lever immuunreacties alsook als orgaanpreservatie en totale levensduur van het dier.
Vroege microscopisch werden gebaseerd op intravitale epifluorescentie microscopy, maar een aantal technische beperkingen, zoals foto bleken en indringdiepte laag beperk het gebruik van deze techniek voor de lange termijn lever beeldvorming 4,11,12. Met de ontwikkeling van multifoton microscopie in de jaren 1990 werden de beperkingen van foto bleken of indringdiepte hoofdzakelijk opgelost omdat deze nieuwe methode technisch staat om imaging studies uitgevoerd in vrijwel alle organen in reële situaties 13-15. De belangrijkste resterende problemen inzake leverbeeldvorming waren: ademhaling bewegingen, autofluorescentie van leverweefsel, vastzetten ongewijzigd bloedstroom in de lever sinusoïden, en vooral stabiele beeldvorming voor langere perioden van enkele hr 16.
Hoewel verschillende studies ingegaan op de functie en de migratie van diverse leukocyten in de lever 17, bijvoorbeeld, NKT-cellen 18-20, T-cellen 21,22, lever macrofagen 23,24 of neutrofielen 25, op lange termijn multifoton microscopy imaging nog niet tot stand is gebracht, een taak nog moeilijker bij dieren met acute of chronische leverziekte door de bestaande schade en derhalve hogere gevoeligheid voor verdere schade 26. Echter, monitoring trekgedrag en cellulaire functie van leukocyten in de lever in real time mogelijk maakt nieuwe inzichten in hun specifieke rol in de lever homeostase en ziekte 27.
De chemokine receptor CXCR6 wordt uitgedrukt op verschillende lymfocyten en natuurlijke killer (NK) cellen, NKT-cellen en een aantal T-celpopulaties 18,28. Voorafgaande studies bij muizen hebben aangetoond dat CXCR6 en zijn verwante ligand CXCL16 het patrouilleren van NKT cellen kunnen controleren op de lever sinusoïden tijdens homeostase. Bijgevolg heeft het gebruik van CXCR6.gfp muizen (die een knock-in groen fluorescerend eiwit [gfp] in de CXCR6 locus) beschreven de migratie van lymfocyten onderzocht in diverse organen zoals hersenen 29alsmede lever 18,20, met verhoogde infiltratie van CXCR6.gfp cellen na ontsteking.
Met de in deze studie methode was het mogelijk deze processen gedurende een lange periode onder stabiele omstandigheden te volgen. De intravitale multifoton gebaseerde procedure toegestaan beeldvorming die zeer reproduceerbaar met minimale verstoring van het dier en het orgel was; geoptimaliseerd voor de lange termijn dier overleven door een uitgebreide controle, gevolgd door een nauwgezette controle van de ademhaling en de bloedsomloop; en zeer flexibel en gemakkelijk te nemen ook andere parenchymale organen zoals nieren en milt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving inzake dierproeven na de 'Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren' (NIH publicatie, 8e editie, 2011) en de Richtlijn 2010/63 / EU betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden (Publicatieblad van de Europese Unie, 2010). Officieel toestemming is verleend uit de gouvernementele dier zorg en gebruik op kantoor (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Duitsland).
OPMERKING: Stappen die kan worden weggelaten voor de korte termijn beeldvorming (bv snap shots, 3-D stapels of ook korte duur time-lapse microscopie) zijn gemarkeerd met een sterretje (*) aan voorbereidingstijd te verminderen en de chirurgische protocol te vereenvoudigen. Visualisatie kan ook worden uitgevoerd zonder uitgebreide bewaking en controle circulatie eventueel echter overlevingstijd wordt aanmerkelijk verminderd.
1. Microscoop Setup en Pre-operatie Voorbereiding (5-10 min)
- Switch systeem op (microscoop, macht Lab, laser, verwarming pad, klimaatkamer, webcam, injectiepomp apparaat, gasmasker).
- Sluit O 2 levering aan Isoflurane Vapor en stel Isoflurane niveau tot 1,5 Vol% (v / v), aan te sluiten op een klein dier gasmasker.
- Voor de korte termijn beeldvorming, onderhouden van de anesthesie met behulp van isofluraan pas na de eerste ip anesthesie inductie (zie stap 2.2). Maak dan gebruik van 2 Vol% (v / v) Isoflurane, en houden de beeldvorming tijd onder de 2 uur tot stabiele lever microcirculatie garanderen.
- Stel ademhaling tot ademhaling 120-140 cycli / min met een volume van 150-200 gl.
- Opgezet muis agarose podium. Maak 100 ml 3% (w / v) agarose, gieten in een schaal (ongeveer 10 cm x 15 cm base) in een hoek van 40 °.
- Opgezet chirurgische werkgebied het verzamelen van de benodigde instrumenten. Om microbiële infectie te voorkomen, desinfecteren instrumenten met een 1% -oplossing van Sekusept Forte S (9,9% w / v) Glutaral 9,8% w / v, Formaldehyde gedurende 5 minuten voor het experiment (figuur 1A).
- Verkrijgen overige bestanddelen: huiddesinfectans (bijvoorbeeld 10% povidon-joodoplossing), lever fase (stacks en bruggen), agarose oplossing (3% (w / v) in PBS), spuitpomp met 5% (w / v) glucoseoplossing (G-5), spuitpomp met anestheticum I (ketamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml), wattenstaafjes, n-butyl-2-Cyanoacrylat en 1x PBS. Zet agarose stadium gerecht in incubatiekamer voor het voorverwarmen.
2. tracheotomie (10-15 min)
- Gebruik C57BL / 6 muizen uit in het huis van de fokkerij met een gewicht van 25-28 g. Het huis van de muizen onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden in overeenstemming met de FELASA richtlijnen, in een temperatuur- en luchtvochtigheid gecontroleerde omgeving met een 12 uur licht / 12 uur donker cyclus. Toestaan dat dieren vrije toegang tot standaard muizen dieet (Sniff Standard knaagdierendieet) en water ad libitum.
- Verdoven van de muis door initial intraperitoneale (ip) injectie van 250 ui van anestheticum II (ketamine 0,1 mg / ml, xylazine 1 mg / ml, Buprenorfine 10 ug / ml).
- * Voor onderhoud tijdens intravitale beeldvorming voortdurend anestheticum I toedienen via continue ip injectie (ketamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml) met een spuit pompinrichting met een stroomsnelheid van 0,2 ml / uur in combinatie met inhalatief isofluraan 0,5 vol% (v / v).
- Controleer reflexen na 5 min (bijv knijpvoet pad met een pincet), ontsmet de huid voor tracheotomie, start de voorbereiding als de muis is in chirurgische tolerant anesthesie staat.
- Solliciteer eye beschermende crème (bv Dexpanthenol 50 mg / g) aan het hoornvlies uitdroogt (Figuur 1B).
- Fixeren muis op de voorbereiding tafel bloot buikzijde met plakband voor de extremiteiten; zacht uitrekken hals, fixeren in deze positie, bijv. door middel van een rubberen band verslaafd to de snijtanden.
- Ontsmet de huid en vacht met behulp van povidonjood-oplossing, door het aanbrengen van een ontsmettingsmiddel met een wattenstaafje.
- Voeren initiële huid gesneden (0,5-1 cm lengte) direct onder de kin (figuur 1C)
- Ontleden bindweefsel tussen de speekselklieren (figuur 1D) voorzichtig.
- Openscheuren spierbuis omliggende luchtpijp (figuur 1E, F) voorzichtig.
- Plaats chirurgische draad onder de luchtpijp voor later ventilatiebuis fixatie (figuur 1G).
- Open luchtpijp met micro-schaar tussen kraakbeen ringen uitvoeren van een T-vormige insnijding (Figuur 1H)
- Plaats ventilatiebuis in luchtpijp door de incisie (-0,5 cm). Aan de buis naar voren te duwen, grijpen caudale einde met kleine anatomische pincet en voorzichtig vooruit de buis in de luchtpijp (Figuur 1I)
- Fixeer buis met chirurgische draad (bv (Figuur 1J, K) te vermijden.
- Verbinding gesneden met weefsellijm (bijvoorbeeld n-butyl-2-Cyanoacrylat) (Figuur 1L).
- Fixeer buis op het hoofd met behulp van plakband.
3. laparotomie (15-20 min)
- Plaats de muis op de verwarming pad om onderkoeling te voorkomen. Scheren buik, verwijder voorzichtig het haar uit de huid. Ontsmet geschoren huid en vacht met behulp van povidonjood-oplossing.
- Voer een kleine huid onder het borstbeen met behulp van chirurgische schaar (Figuur 2A) te snijden. Verleng de snede zijdelings onder de ribben aan beide kanten, alle zichtbare bloedvaten dichtschroeien om het bloeden te voorkomen.
- Voeren voorzichtig een klein sneetje in de linea alba onder het borstbeen, het openen van het buikvlies (Figuur 2B). Verleng de cut om beide kanten met behulp cauterizatie tot bloeden (figuur 2C, D) te voorkomen.
- Plaats de muis in agarose stadium schaal (figuur 2E). Plaats stapels geschikte hoogte aan beide zijden van de muis (meestal 12-14 dekglaasjes) (figuur 2F).
- Plaats respiratoire triggersensor eronder bovenrug om de microscoop met de ademhaling te synchroniseren. Activeer trigger-eenheid (figuur 2G).
- Plaats chirurgische draad (5-0) door het borstbeen ribben (figuur 2I) in te trekken.
- Knip ligament verbinden lever en middenrif (falciform ligament) en lever en het maag-darmkanaal met gekromde chirurgische schaar. Snijd de falciform ligament tot in de aorta (Figuur 2J).
4. Steekproef Setup (10-15 min)
- Plaats muis naar de rechterkant met een hoek van 45 ° voor gemakkelijke toegang tot grote lever kwab.
- Voeg enscenering brug onder de ribben, die de buikholte. Vervaardigen van een brug met behulp van een standaard dekglas met plakband coating om scherpe randen (figuur 2K) te dekken.
- Plaats grote lever kwab op het podium. Zorgvuldig slip dubbele bal stylus sonde of een gewatteerde spatel onder de lever en houd de bovenkant van het orgel met een nat wattenstaafje of nat weefsel. Til kwab op de glijbaan en zachtjes te slepen. Kwab kan worden gebogen of gevouwen. Voorzie extra zorg slechts zachte manipulatie van de lever (Figuur 2L).
- Plaats laterale ondersteuning staken, bijvoorbeeld stapels kleine dekglaasjes (20 mm x 20 mm), ongeveer dezelfde hoogte van de lever kwab ernaast om dekglas ondersteunen.
- Plaats grote dekglas (24 mm x 50 mm) op de lever kwab. Zorg ervoor dat dekglas is gericht zoveel mogelijk horizontaal (figuur 2M).
OPMERKING: Het dekglas moet in contact met het weefsel zonder erin te knijpen. Controleer op zichtbare tekenen van verminderde doorbloeding (wit weefsel). Als Microcircning wordt verstoord, voeg verdere ondersteuning van inzet. - * Plaats twee onafhankelijke intraperitoneale katheters (Figuur 2 N) voor de lange termijn anesthesie en G-5 toepassing. Installeer katheters zijdelings in de onderbuik naast de achterste ledematen.
OPMERKING: De intraperitoneale katheters zelfgemaakte door verbinding 27 G naalden met flexibele siliconen buis (figuur 3) zijn. - * Fixeer de naald met een lus van 5-0 chirurgische draad aan de huid om onbedoelde verplaatsing te voorkomen.
- * Bevestig de spuit pomp met verdoving oplossing die ik tot katheter 1, ingesteld debiet tot 0,2 ml / uur; hechten spuit pomp met G-5 tot katheter 2, ingesteld debiet tot 0,1 ml / uur.
5. Mouse Monitoring
- * Plaats ECG-elektroden in de voorste en achterste ledematen (figuur 4A).
- * Bevestig verstrijken slang aan op 2-niveau sensor co.
- Voeg externe temperatuursensor aangesloten op warmte-pad (Figuur 4C).
6. Inbedding en fixatie van het weefsel (5-10 min)
- Maak 100 ml 3% (w / v) agarosegel in 1 x PBS. Insluiten lever wanneer de temperatuur bij 41 ° C met een 5 ml spuit en een 18 G naald (figuur 5A).
- Giet resterende agarose op dekglaasje en rond de muis (Figuur 5B, C). Wacht tot agarose volledig is ontsloten.
- Verwijder overtollig agarose met de Heidemann spatel bereiden van een Viewfield groot genoeg om de bereide lever kwab (Figuur 5D, E) scannen.
7. Imaging
- Breng de muis naar microscoop klimaatkamer.
- Voeg 50-100 ml 1x PBS (voorverwarmd op 37 ° C).
- Dek de schaal voor monsters om te voorkomen dat de verdamping (Figuur 5F).
- * Aantal inhalatief isofluraan 0,5 vol% (v / v).
- * Start monitoring software, opname ECG, hartslag en expiratoire CO2.
- Start beeldvorming: openen laser rolluiken, identificeren uitzicht aandachtsgebieden, te definiëren bovenste en onderste grens voor Z-stacks, en start time lapse-opname. Bijstellen Z-stacks zo nodig Z-drift corrigeren (bijv. Als gevolg van veranderingen in bloeddruk of temperatuurschommeling figuur (5G).
OPMERKING: Na voltooiing van de beeldvormende periode of wanneer de circulatie of verdoving van de dieren instabiel, offeren muizen door cervicale dislocatie (zonder ontwaken uit de anesthesie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om onze intravitale TPLSM benadering te valideren, we onderworpen CXCR6 GFP / + muizen om intravitale TPLSM beeldvorming. Muizen werden ofwel onbehandeld als basislijn controles of onderworpen aan een enkele intraperitoneale injectie van tetrachloorkoolstof (CCl 4) om acute leverschade 20 induceren.
Video sequenties werden genomen over een periode van 2-5 uur, en cellen werden getraceerd tijd vanwege hun groene fluorescentie. Om algemene cellulaire beweeglijkheid zien, werden alle tracks die tijdens de procedure werden gedetecteerd uitgezet als op een verkleind (figuur 6A). Terwijl de cellen onder de basislijn omstandigheden toonde lange migratie afstand langs de lever sinusoïden naar de centrale ader, 18 uur na CCI4 behandeling de CXCR6 + / GFP cellen toonde al gedeeltelijk verstoorde bewegingspatronen. Hoewel sommige snel bewegende cellen waren nog steeds aanwezig in de lever sinusoïden, diverse aandachtsgebieden zichtbaar waren met cellen diehad veranderd van willekeurige migratie naar lokale scannen, wat wijst op een chemotactische reactie werven van de cellen naar het gebied van de schade. Het effect was zelfs nog meer uitgesproken na 36 uur, waaruit blijkt een bijna volledige arrestatie van CXCR6 + cellen met vrijwel geen actieve migratie. Terwijl onder basisomstandigheden meeste migrerende cellen hadden variabele migratie snelheden willekeurige richtingsveranderingen, toonde CCl4 behandelde dieren cellen die slechts langzaam kropen evenals enkele vrij beweeglijke cellen patrouilleren de sinusoïden na 18 uur maar niet na 36 uur. Met kleurcode migratie tracks kan cel snelheid direct worden gevisualiseerd om het effect van de CCl4 behandeling te beoordelen. De verminderde migratie was ook zichtbaar in de genormaliseerde sporenplan (figuur 6B), waaruit blijkt dat 18 uur na CCl4 de hoeveelheid lange afstand sporen en de gemiddelde baanlengte aanzienlijk verminderd, terwijl na 36 uur geen beweeglijke cellen detecteerbaar geven meer. In lijn wi hierop is de cellulaire verplaatsing, die het vermogen van een cel om de vasculatuur vrij patrouilleren beschrijft verminderde tijd, hetgeen een vangst van de cellen 36 uur na CCl4 behandeling op de plaats van hepatocellulaire beschadiging (figuur 6C).
Om het trekgedrag van CXCR6 + / GFP-cellen in de lever meer in detail te volgen, de migratie snelheid van representatieve individuele cellen werd uitgezet om het niveau van hun beweeglijkheid te visualiseren in de tijd. Wij en anderen eerder beschreven een aantal verschillende bewegingspatronen van CXCR6 + / GFP cellen: Actieve willekeurige kruipen met een knelpunt rollen patroon, waaruit blijkt fasen van cellulaire beweeglijkheid en temporele latente toestanden; geregisseerd cellulaire rekrutering met cellen scannen van een gebied van belang, maar nog steeds in staat is actief kruipen; totale cellulaire arrestatie vergezeld van immuuncelactivatie 18,20. Terwijl muizen zonder behandeling toonde vooral cellen die waren vrij Motile met snelheden tot 15 micrometer / sec, weergegeven CXCR6 + / GFP cellen in muizen behandeld met CCI4 duidelijk verminderd cel migratie snelheid en gedeeltelijke arrestatie al na 18 uur en vol trekkende arrestatie na 36 uur (figuur 7A). In lijn met de single cell analyse, de statistische gegevens van alle cellen in een sequentie onthulde afnemende totale migratie snelheid na CCI4 behandeling (figuur 7B), die ook werd leek door de gemiddelde spoor snelheden (figuur 7C) en volgen de maximale migratie snelheden (Figuur 7D), waaruit blijkt dat de benadering geschikt verschillen in celmigratie en positionering ontwikkelen leverziekte beschrijven.
Figuur 1:. Tracheotomie van de muis (A) Chirurgische apparatuur voor bereiding. 1x standaard getrippeln tang, 1x Semken tang, 1x Dumont No.7 tang, Graefe pincet (gekarteld, 2x rechtdoor / 1x gebogen), 2x Blair retractors (4 fronten (stomp)), dubbele bal stylus sonde (bijvoorbeeld amalgaam burnisher 3PL), Heidemann spatel HD2, naaldhouder (Mathieu of Halsey), 1x kleine chirurgische schaar (scherp / stomp, 1xcurved, 1x recht), micro-schaar (bv Vannas Spring Schaar), 1x klein dier Cauter, wattenstaafjes, oog beschermende zalf, chirurgische thread, n-butyl-2-Cyanoacrylatglue. Worden (B) ogen beschermd met behulp van een oog beschermende zalf. (C) Eerste snede huid voor luchtpijp voorbereiding. (D) Dissectie van bindweefsel tussen onderkaak speekselklieren. (E) Expositie van de luchtpijp. (F) Dissectie van het spierweefsel rond de luchtpijp. (G) Plaatsing van chirurgische draad eronder luchtpijp voor fixatie van de buis. (H) trancheal incisie met behulp microscissors tussen bovenste kraakbeen ringen. (I) Het inbrengen van de ventilatie buis in de luchtpijp. (J) Plaatsing van craniale chirurgische draad vastzetten slang op de huid. (K) dubbele bevestiging van de buis. (I) Afdichting chirurgische incisie met behulp van n-butyl-2-Cyanoacrylat. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2:. Laparotomie en lever preparaat (A) Eerste incisie werden bloedvaten dichtgeschroeid overmatig bloeden te voorkomen. (B) Opening van het buikvlies onder het borstbeen. (C) Uitbreiding van de peritoneale gesneden met behulp van cauterisatie eenheid. (D) Afdichting van epigastrische vaten. (
Figuur 3 "src =" / files / ftp_upload / 52607 / 52607fig3.jpg "/>
Figuur 3:. Intraperitonale katheter 27 G naalden verbonden met flexibele siliconen slang.
Figuur 4: Monitoring van de muis. (A) Plaatsing van ECG-elektroden (groen, rood, blauw kabels). Naalden voor ECG-detectie worden subcutaan geplaatst zoals aangegeven. (B) Monitoring van ECG (rood), expiratoire CO 2 (blauw) en hartslag (rood) zien termijn progressie lang (links) en de werkelijke meting (rechts). (C) Temperatuur power unit gecontroleerd voor warmte pad controle. Temperatuur is ingesteld op 36 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Lever inbedding en beeldvorming. (A) Inbedding van de lever kwab. 3% agarose in PBS wordt geïnjecteerd bij 41 ° C onder het dekglas met behulp van een spuit 2 ml met een 18G naald. (B) lever kwab is volledig geïntegreerd in agarose om bewegingsartefacten te minimaliseren. (C) Afdichting van het buikvlies met de resterende agarose om uitdroging te voorkomen. (D) Verwijdering van agarose bekleding microscoop gezichtsveld na volledige gelatinisering. (E) Voorbereiding van Viewfield. F Aanpassing van Z-niveau en de evaluatie van monster doorbloeding met behulp van een lichtmicroscoop. (D) Cover gerecht om overmatige verdamping te voorkomen. Deksel wordt opgetild in de afbeelding om deze setup te laten zien. Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.
Figuur 6:. Volgen van CXCR6 gfp / + cellen in chronische leverschade na CCl4 injectie muizen werden ip geïnjecteerd met 0,6 ml / kg CCl4 opgelost in zonnebloemolie 18 uur of 36 uur voor beeldvorming. Op de dag van het experiment werden muizen onderworpen aan intravitaal TPLSM beschreven. (A) Stilstaande beelden van cell tracking. Tracks van alle tijdstippen werden gelegd om cellulaire beweeglijkheid en verdringing tonen. Beelden werden genomen met behulp van een enkele straal Titan Saphire Laser 840 nm en een TPLSM microscoop. Gebieden werden gescand nemen 3-5 Z-stacks met een penetratie diepte van 70 urn met een sampling rate van ongeveer 30 seconden per scan cyclus. Tracks waren kleurcode migratie snelheid te tonen (lichtblauw: langzaam bewegende of vastzittende cellen; paars: beweeglijke cellen). Schaalbalken: 100 μ; M. (B) XY-diagrammen van paden genormaliseerd voor hun herkomst tonen spoor richting en baanlengte (pm). (C) De totale verplaatsing van cellen van hun oorsprong. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Migratie statistieken van CXCR6 GFP / + cellen gevolgd door intravitale TPLSM in leverweefsel in baseline en CCl 4 behandelde muizen cellen werden geanalyseerd op hun migratie snelheid patrouilleren in de lever.. (A) Vertegenwoordiger snelheid van enkele cellen gevolgd in de tijd. Snelheid werd gemeten op elk tijdstip en uitgezet voor elk frame afzonderlijk. Lijnen geven individuele cellen. Y-assen worden geschaald op basis van de maximale migratie snelheid. (B) Statistical analyse van A. Frame specifieke snelheden van alle cellen werden gegroepeerd en in basislijn geanalyseerd en CCI4 behandelde muizen. (C) Gemiddeld spoor snelheid werd berekend per spoor en de gegevens van alle tracks werden gegroepeerd voor analyse. (D) Maximale snelheid van elk nummer werd uitgezet en geanalyseerd. Alle experimenten werden uitgevoerd in groepen van 3 dieren en resultaten werden twee onafhankelijke experimenten bevestigd. *** P <0,001 (tweezijdig ongepaarde Student t-test). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van onze studie was een zeer gestandaardiseerde, stabiele en reproduceerbare werkwijze voor intravitale TPLSM beeldvorming van de lever ontwikkelen. Intravitale beeldvorming in het algemeen heeft waardevolle inzichten in cellulaire gedrag onder real life omstandigheden volgende homing en interactie van verschillende leukocyten bevolkingsgroepen in ontwikkeling, homeostase en ziekte gegeven. De bosweg anatomische positie van de lever, waardoor respiratoire en intestinale peristaltische beweging direct worden doorgegeven aan de lever en hun hoge kwetsbaarheid vergelijking met andere vaste organen ingesteld voor verschillende uitdagingen stabiele lange termijn intravitale beeldvorming. In de afgelopen jaren zijn veel experimentele studies bij muizen hebben aangetoond de zeer dynamische aard van het immuunsysteem cel infiltratie in geblesseerde lever 28, met belangrijke bijdragen van de bewoner of infiltreren monocyten / macrofagen 30-32, neutrofielen 33 of diverse lymfocytondergroepen 34,35. Echter, most van deze gegevens werden afgeleid uit eindpunt analyses (bv, multicolor flowcytometrie na het opofferen van de dieren). Tot nu toe slechts weinig studies bestaan waarin de dynamiek van cellulaire verkeer tijdens leverontsteking behulp multicolor intravitale beeldvorming. Met behulp van omgekeerde microscopen omzeilt de noodzaak voor fixatie en hydraterende van de lever als gevolg van de stevige hechting van het weefsel aan de glazen bodem 24. Aangezien veel multiphoton microscopen zijn opgebouwd als rechtop beeldvormingssystemen, uitgebreidere opstelling en bevestiging methoden nodig om het weefsel voor de tijd van beeldvorming stabiliseren. Gewoonlijk hebben maatwerk enscenering systemen beschreven voor fixatie van het weefsel 6, 36,37, maar met deze is het cruciaal om de lever microcirculatie te valideren, omdat zelfs een minimale druk op het weefsel van invloed op sinusvormige bloedstroom met nog meer ernstige effecten op de zieke lever 38 .
Daarom is de volgende punten waren advertentiegekleed in de opzet van deze methode om de verkregen door in vivo TPLSM beeldvorming resultaten te optimaliseren: Verbetering van de kwaliteit van de voorbereiding door geminimaliseerd monster verstoring en verstoring van de microcirculatie te wijten aan het hanteren van problemen en grotere dieren overleven; intensive care bewaking en latere aanpassing van anesthesie, ademhaling en stabilisatie van de circulatie verder versterkt dieroverleving en minimale fysiologische artefacten, bijvoorbeeld door onbalans in het bloed pH. Gecontroleerde ademhaling in combinatie met geactiveerde beeldvorming was essentieel om bewegingsartefacten te wijten aan de synchronisatie van de microscoop met de ademhalingscycli elimineren. De verankering van het orgaan in agarose bevattende fysiologische zoutconcentraties voordelig was voorzichtig fixeren het orgaan na bereiding zonder verdere mechanische manipulatie en voorkomen tevens dehydratatie van het monster. De meeste protocollen die worden gebruikt voor de lever microscopie leveren alleen onvoldoende methoden voor sta baar, op lange termijn anesthesie. Echter, de overleving van de dieren aanzienlijk verbeterd met de anesthesie protocol naar en in combinatie voorzien van de controle is voldoende overleving garanderen 8 uur. Alternatieve methoden zijn algemeen kunnen processen binnen een periode van maximaal 3 uur visualiseren zoals neutrofielen invasie 39, maar missen de mogelijkheid afbeelding langdurigere processen zoals monocyten of lymfocyten invasie 22 of zelfs celproliferatie 6. Inzicht in de dynamiek van de werving, infiltratie en cellulaire interactie tijdens acute en chronische leverontsteking kan meer gedetailleerd inzicht in de ontwikkeling en progressie van de leverziekte te bieden. Door deze beter begrip van de immunopathologie het mogelijk om therapieën veel meer verfijnde ontwerpen betrekking tot de aanpak de doelwitcellen van belang in plaats van bijvoorbeeld niet-selectieve immunosuppressieve benaderingen.
ove_content "> Om de ligging, transmigratie en interactie van leukocyten aan te pakken, worden beelden van hoge kwaliteit die nodig is voor een nauwkeurige 4D volgen van de cellen in de lever vaatstelsel en leverweefsel 18,20,40.De werkwijze die we hier kunnen worden toegepast gebruikelijke laboratoriumreagentia en apparatuur, zodat deze zowel gemakkelijk te hanteren en kostenefficiënt met minimale verstoring van het monster. Om de fysiologische omstandigheden van de muis voor zo lang mogelijk te behouden, moet fijnregelen het ademvolume en frequentie oxygenatie en bloed CO controleren 2 niveaus. Hoewel vanwege de continue infusie van vloeistoffen in het peritoneum er minstens een voorzichtige levering aan de bloedsomloop, ECG en hartfrequentie gemeten stabiliseren slechts gedeeltelijk controle van stabilisatie van de circulatie mogelijk. Door de implementatie van de directe controle van de bloeddruk en de centrale veneuze vloeistof applicatie is het waarschijnlijk dat de vitale PARAMETers kan nog worden gestabiliseerd, wat leidt tot verdere verbetering van de stabiliteit en overleving.
Zelfs onder zeer gecontroleerde omstandigheden beeldvorming bij dieren die zijn onderworpen leverschade modellen gewoonlijk in muizen zoals acetaminophen geïnduceerde leverschade, CCl4 geïnduceerde leverbeschadiging of dieet geïnduceerde leververvetting uitdaging blijft. Als gevolg van de wezenlijke functie van de lever in metabole controle van de staat en zijn centrale ligging in de circulatie, veranderingen van de lever functionaliteit of microcirculatie is direct van invloed op de lange termijn overleving van de dieren, dus het beperken van de mogelijkheid om lange TPLSM video-sequenties van zwaar te verkrijgen beschadigde organen, bijvoorbeeld met ernstige bloedingen of vernietigd microvasculature. Ook bij ernstig veranderde lever microanatomie zoals in modellen met uitgebreide necrose, blijft het moeilijk om cel-cel-interacties en lokale compartimentering van ontstekingscellen aggregaten bestuderen, omdat er geen standardized "contra-kleuring" anatomische structuren (zoals hematoxyline-kleuring conventionele microscopie of DAPI kleuring in immunofluorescentie) is beschikbaar voor intravitale TPLSM.The kwaliteit van de door het beeldvormingsproces aanvullende gegevens afhankelijk van de etikettering intensiteit van de cellen en de microscopische setup.
Er bestaan diverse benaderingen om GFP + cellen te visualiseren in de lever. De hoogste fluorescentie met zeer lage achtergrond fluorescentie wordt verkregen tussen 900 en 920 nm excitatie golflengte. De bijna volledig verlies van lever achtergrondfluorescentie niet mogelijk onderzoeken van de positionering van de cellen in de lever, zonder gebruik van extra vat trackers zoals dextran of lectine. Daarom hebben we besloten om het beeld van de migratie van leukocyten bij een golflengte van 840 nm, het geven van de beste verhouding tussen het GFP-signaal en gedetailleerd, maar niet te fel lever achtergrond fluorescentie.
Samen genomen, de intravitaal TPLSM afbeeldingsstelsel die in dit onderzoek kan worden toegepast op een breed scala van leverspecifieke intravitale microscopie vragen. Met deze benadering TPLSM beeldvorming in andere vaste organen zoals nier, lever, blaas, darm of alvleesklier is mogelijk met slechts kleine modificaties van de chirurgische procedures en weefsels staging daarom ook een zeer flexibele aanpak voor langdurige processen migrerende cellen onderzoeken vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20 ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250 ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25 ml Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50 mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0.5 ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
- Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
- Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
- Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
- Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
- Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
- Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
- Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
- Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
- Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
- McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
- Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
- Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
- Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
- Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
- Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
- Jenne, C. N., Kubes, P.
- Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
- Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
- Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
- Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
- Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
- Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
- Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
- Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
- McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
- Phillipson, M., Kubes, P.
- Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).
