Abstract
داء السكري من النوع 2 هو مرض مزمن يؤثر على 382 مليون شخص في عام 2013، ومن المتوقع أن يرتفع إلى 592،000،000 بحلول عام 2035 1. وخلال العقود الماضية 2، ودور ضعف خلايا بيتا في داء السكري من النوع 2 تم تأسيس بوضوح 2. وقد تطلب تقدم البحوث طرق لعزل الجزر البنكرياسية. بروتوكول للعزلة جزيرة قدم هنا أسهم العديد من الخطوات المشتركة مع البروتوكولات من المجموعات الأخرى، مع بعض التعديلات لتحسين المحصول وجودة من الجزر المعزولة من كل من النوع البري والسكري ديسيبل Lepr (ديسيبل / ديسيبل) الفئران. ثم ويرد الخلية الحية 2-الفوتون طريقة التصوير التي يمكن استخدامها لتحقيق السيطرة على إفراز الأنسولين داخل الجزر.
Introduction
دور ضعف خلايا بيتا في المرض وقد تم الاعتراف على نطاق واسع 3،4. خطوط الخلايا مثل MIN6 وINS-1 هي أدوات مفيدة لفهم بيولوجيا السلوك خلايا بيتا. ومع ذلك، التحكم الفسيولوجية لإفراز الأنسولين تجري داخل جزر لانجرهانز. هذه الجزر تحتوي على الآلاف من خلايا بيتا معبأة بإحكام، وكذلك الأوعية الدموية وغيرها من أنواع الخلايا في الغدد الصماء. هذه البيئة داخل جزيرة يؤثر إفراز الأنسولين، ومن المرجح أن تكون مهمة في مرض السكري. لذلك، لفهم السيطرة الفسيولوجية لإفراز الأنسولين، والفيزيولوجيا المرضية للمرض، فمن الضروري لدراسة الجزر سليمة.
جزيرة العزلة
الجزر الإنسان الحي و، ولا سيما الجزر الإنسان من مرضى داء السكري من النوع 2 ويصعب الحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك، الجزر البشرية لديها إمكانيات محدودة للتلاعب الجزيئية التجريبية. لذا استخدم الباحثون هويتيح من الحيوانات والنماذج الحيوانية من مرض السكري من النوع 2. نموذج واحد من هذا القبيل هو مرض الماوس ديسيبل / ديسيبل. هذا هو طفرة تلقائية أن النماذج داء السكري من النوع 2 مع تطور النمط الظاهري الذي يوازي بشكل وثيق الأمراض التي تصيب البشر 5،6. بروتوكول المعروضة هنا للجزيرة بمعزل عن السكري الفئران ديسيبل / ديسيبل لديه العديد من الخطوات المشتركة مع المجموعات الأخرى مع بعض التحسينات لأفضل عائد وتنقية وتعزيز بقاء الجزيرة.
التصوير 2 الفوتون
الخلية الحية فحص 2 الفوتون هو موضح هنا تمكن الباحثين من تحديد عدد وتقييم خصائص الحبيبات التي تحتوي على الانسولين واحدة من العديد من الخلايا من السكري 7 والنوع البري الجزر 8،9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب الحالية وفقا للإجراءات الأخلاق الحيوانية المحلية من جامعة كوينزلاند (التي وافقت عليها جامعة كوينزلاند، تشريحي جنة الأخلاقيات العلوم البيولوجية).
1. جزيرة العزلة
- إعداد كاشف
- مزيج من الإنزيمات
- لهضم البنكرياس، واستخدام خليط من liberase وكولاجيناز النوع الرابع. تمييع TL liberase (منخفض thermolysin) 1 قنينة من 5 ملغ مع 26 مل من DMEM (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة).
- إعداد كولاجيناز النوع الرابع في المخزن هانك بتركيز 0.5mg / مل، على أن تستكمل مع 5MM HEPES، 0.5MM CaCl 2، 0.1mg / مل الدناز و1mg / مل ألبومين المصل البقري.
- خلط TL liberase والحلول كولاجيناز في نسبة 4: 1 (من حيث الحجم)، أي 4 مل liberase TL + 1 مل كولاجيناز. قسامة مزيج من الأنزيمات ل2.5ML كل وتخزينها في -20 ° C.
ملاحظة: حضانة مرات الأنسجة الخامسآرى قليلا بين دفعات من انزيم (30 ثانية إلى 1 دقيقة الفرق). لذلك، قد تكون هناك حاجة إلى اختبار دفعة واحدة.
- RPMI عزل وسائل الإعلام
- حل قنينة واحدة من RPMI 1640 المسحوق في 1 لتر من الماء في RT وتكملة مع 2 غرام NaHCO 3، 4.02 غرام HEPES.
- الجمع بين وسائل الإعلام العزلة RPMI في قارورة مخروطية كبيرة، مع مزيج النمام المغناطيسي، والتكيف مع درجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية.
- RPMI الثقافة وسائل الإعلام
- استخدام RPMI سائل الإعلام والثقافة، مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ المضادات الحيوية (مثل البنسلين 100 U / مل، الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل).
- مزيج من الإنزيمات
- عزل جزيرة والتثقيف
- التضحية الحيوانية
- التضحية الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم أو CO 2 الخنق وفقا للإجراءات أخلاقيات المؤسسة المحلية. رش جسم الفأر تماما مع الايثانول 70٪.
- الإرواء البنكرياس
- USE 2 التخفيضات طويلة أفقيا من خلال الجلد في منطقة البطن والصفاق لجعل رفرف على شكل حرف V. سحب رفرف من الجلد حتى كشف تجويف البطن بأكمله، وضعت جانبا الأمعاء والحفاظ على الكبد في مكان من المناديل الورقية المطوية للكشف عن القناة الصفراوية المشتركة (الشكلان 1 و 2). وضع الحيوان بحيث اتجه نحو الجراح والذيل بعيدا عن الجراح.
- تطبيق المشبك الأوعية الدموية في أمبولة على الحائط الاثني عشر لمنع الانزيمات حقن من دخول العفج (الشكل 1).
ملاحظة: هذه خطوة مهمة لأنها تحدد ما إذا كانت الإنزيمات حقن سيذهب إلى القناة البنكرياسية ويروي البنكرياس أو الجزر إلى موقع الحقن (أكثر من الشبك) أو الخوض في الاثني عشر (تحت المشبك). - يقني؛ يدخل القنية القناة الصفراوية المشتركة مع G إبرة 31 بالقرب من تقاطع القناة الكبدية المشتركة والقناة المرارية (الشكل 1)، وتترك مجالا لحقن الثاني إذا عشرفشل البريد البنكرياس ليروي للمرة الأولى. ببطء (أكثر من ~ 10 ثانية) ضخ حوالي 2 مل من خليط انزيم البارد في الماوس القناة الصفراوية المشتركة.
ملاحظة: سيتم perfused لالبنكرياس بسرعة إذا المشبك هو في المكان المناسب. - ضبط الموقف المشبك إذا كانت إبرة داخل القناة الصفراوية المشتركة ولكن لا يمكن أن يروي البنكرياس (أي، نقل ما يصل المشبك قليلا بعيدا عن الكبد إذا كان أكثر من فرضت أو تحريكه لأسفل قليلا إلى الكبد إذا فرضت تحت).
ملاحظة: إبرة يذهب في بعض الأحيان إلى الكبسولة المحيطة بدلا من تجويف القناة. وهناك علامة مفيدة للتحقق ما إذا كانت الإبرة داخل القناة الصفراوية المشتركة هو تمدد القناة عند حقن. إذا فشل البنكرياس ليروي، والبديل هو يمكن حقن خليط انزيم إلى مواقع متعددة من البنكرياس مع انخفاض العائد المتوقع. نضح الموقع الأيسر من البنكرياس (الفص الطحال) مهم لتعظيم العائد جزيرة. - بعد البنكرياس صerfused، بسرعة إزالة البنكرياس، ووضعها في قارورة (~ 20 مل، والزجاج)، واحتضان ل~ 19 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
ملاحظة: فترة حضانة يمكن أن تختلف قليلا اعتمادا على سلالة الماوس والعمر. - بعد فترة حضانة، إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة ~ 20 مل من وسائل الإعلام العزلة الباردة. هزة القارورة بلطف لتعطيل البنكرياس وتصب عليه من خلال غربال الشاي العادي (قطر المسام من 1 ملم) في أنبوب معقم 50 مل. ملأ الأنبوب مع وسائل الإعلام العزل والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل.
- حل بيليه في وسائل الإعلام العزلة مرة أخرى، ونقل إلى اثنين من 15 مل أنابيب، ثم الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل. بعد تطلع طاف، مزج الكريات اثنين بشكل جيد مع 6 مل من وسائل الإعلام كثافة الفصل المتدرج الخلية (Histopaque 1077 الحل) في أنبوب من قبل vortexing أو pipetting صعودا وهبوطا. ثم إضافة بلطف ~ 6 مل من وسائل الإعلام العزلة إلى جانب أنبوب على رأسوسائل الاعلام فصل التدرج الكثافة وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل.
- جمع طاف في الأعلى (وسائل الإعلام العزلة)، الوسطى والدنيا (كثافة الخلية التدرج وسائل الاعلام فصل) طبقة في 3 أطباق منفصلة. انتقاء الجزر في هذه الأطباق 3، وذلك باستخدام ماصة تحت المجهر تشريح.
ملاحظة: الطبقة الوسطى يحتوي على معظم الجزر. يتم الاعتراف الجزر عن الهياكل المدمجة من ~ 50-500 ميكرون في الحجم (الشكل 3). نحصل ~ 200 الجزر في الفئران WT و300- 100 <الجزر في الفئران ديسيبل / ديسيبل.
- جزيرة التثقيف
- لمساعدة الجزر على التعافي من انزيم الهضم والجماعات ثقافة 40 الجزر في 25 سم طبق بتري مع 6ML RPMI سائل الإعلام والثقافة (10MM الجلوكوز) عند 37 درجة مئوية، و 5٪ / 95٪ CO 2 / O 2 ل2 قبل أيام من العيش -cell 2 الفوتون التصوير. تغيير ثقافة وسائل الإعلام يوميا.
- التضحية الحيوانية
2. يعيش الخلية 2 فوتون التصوير
- إعداد كاشف
- خارج الخلية العازلة
- إعداد الصوديوم خارج الخلية غنية عازلة للمقايسة 2 الفوتون مع 140 ملي كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 2.5 ملي CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 5 ملي NaHCO 3 و 10 ملي HEPES.
- خارج الخلية صبغ
- للمقايسة 2 الفوتون، وإعداد الأوراق المالية SRB 8 ملم في المخزن خارج الخلية، قسامة في أنابيب صغيرة وتخزينها في -20 ° C. تمييع SRB الأسهم 01:10 العازلة في الخلية الطازجة للحصول على تركيز العمل من 0.8 ملم.
- خارج الخلية العازلة
- التصوير الفوتون
- أولا، قبل احتضان الجزر مثقف 2 يوما في 3 ملي العازلة خارج الخلية الجلوكوز لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: نحن نستخدم الجزر بين 2 و 5 أيام في الثقافة. - ثم، ضع شريحة زجاجية على غرفة التحكم الحرارية التي شنت على المسرح المجهر. استخدام الشحوم لمنع تسريب حل.
- تغطية غرفة مع 500 ميكرولتر من extracellجزيئية العازلة التي تحتوي على 0.8 ملي SRB مع تركيزات الجلوكوز مختلفة (3 ملم، 6 ملم، 15 ملم و 20 ملم الجلوكوز).
- بعد ذلك، وضع جزيرة قبل المحتضنة في منتصف الغرفة والتركيز على 3-4 طبقات الخلايا في جزيرة حيث، في الجزر القوارض، المناعية للأنسولين يدل على أن معظم الخلايا هي خلايا بيتا.
ملاحظة: سيتم SRB الخطوط العريضة عن غشاء الخلية للجزيرة بسرعة وجزيرة جاهز للصورة. - استخدام المجهر 2 الفوتون مع الهدف 60X الغمر النفط (NA 1.42) وبرامج التصوير (على سبيل المثال، ScanImage 11). الشكل 4 يوضح ترتيب المجهر نموذجي. صورة أحداث exocytic باستخدام SRB كما غشاء impermeant علامة خارج الخلية الفلورسنت متحمس بواسطة نبضات ليزر الفيمتو ثانية في 880 نانومتر، مع مضان الكشف على 550-650 نانومتر. تسجيل استجابات جزيرة لتحفيز.
- تحديد الأحداث exocytic واحدة من قبل الظهور المفاجئ لبقعة صغيرة الفلورسنت (القرار 10 بكسل /1؛ م) وتأكيد من قبل مرحلة ارتفاع سريع للإشارة الفلورسنت على المنطقة ذات الاهتمام (~ 0.78 ميكرون 2).
- أولا، قبل احتضان الجزر مثقف 2 يوما في 3 ملي العازلة خارج الخلية الجلوكوز لمدة 30 دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العائد جزيرة وتنقية
لالعادي النوع البري الماوس، ومن المتوقع حوالي 200 الجزر. الجزر صحية تبدو مشرقة، على شكل دائري ولها حدود على نحو سلس. دفعة العزلة على هضم عادة الجزر الصغيرة وغامض في حين أن دفعة هضمها تحت ديها عدد أقل من الجزر والجزر خلية المرفقة عنيبية (الشكل 3). لمرضى السكري الفئران ديسيبل / ديسيبل، العائد جزيرة والمظهر يعتمد على تطور المرض مع الفئران نسبة السكر في الدم أفضل لها أكبر، الجزر أكثر إشراقا وأكثر (ما يصل الى 300 الجزر) مقارنة مع الفئران أسوأ نسبة السكر في الدم والتي لها الجزر الصغيرة مع ظهور شفافة (أقل من 100 الجزر)
2-الفوتون فحص
التصوير 2-الفوتون هو فحص غير مباشر لقياس إفراز الأنسولين على مستوى واحد الانصهار الأنسولين الحبيبية. في استجابة للمؤثرات مثل الجلوكوز أو ارتفاع البوتاسيوم، حبيبات الأنسولين الصمامات مع غشاء البلازما والصبغة SRB خارج الخلية يدخل عشرالبريد حبيبات مما يؤدي إلى ظهور مفاجئ الفلورسنت بقعة ~ 400 نانومتر في القطر (الشكل 5). وقد أجريت تجارب مختلفة إلى التحقق من صحة هذا الاختبار كمقياس لاندماج حبيبات تحتوي على الأنسولين مثل جرعة الجلوكوز تعتمد على زيادة عدد الأحداث الحبيبية الانصهار مع المبلغ المتوقع لإفراز الأنسولين، وحجم ثابت من الخلايا ردت في 2 الفوتون مع أن من خلايا بيتا، قطر الحبيبية مماثلة تقاس الفوتون (2) والمجهر الالكتروني، وcolocalization من امتصاص الصبغة والانسولين تلطيخ 8.
في وقت التسجيل، وتتميز كل الأحداث exocytic استجابة ليتم تحديد الحوافز وموقع الأحداث، وقت ظهور، ومدة ونوع من الأحداث الانصهار مثل قبلة والفر أو الانصهار الكامل ( الرقم 5، 6). هذه خصائص عملية الانصهار هي قيمة لتقييم أي خلل في الانصهار الحبيبية في نماذج من مرض السكري من النوع 2. تقريرنا السابق باستخدام هذا الأسلوب يدل على أن الخلل في السكري الجزر ديسيبل / ديسيبل هو فقدان كامل الحبيبية الانصهار وليس تغييرا في خصائص حركية الحبيبية الفردية الانصهار 7. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن أكبر عامل في انخفاض في إفراز الأنسولين في المرض هو تخفيض عدد الخلايا المستجيبة 7.
الشكل 1: رسم تخطيطي للمواقع لقط وحقن حقن الانزيمات القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من تقاطع القناة الكبدية المشتركة والقناة المرارية. المشبك أمبولة فالتر بواسطة المشبك الأوعية الدموية لتسهيل انزيم حقن لقناة البنكرياس.
2632fig2.jpg "/>
الشكل 2: عملية الحقن في الفئران. يبين الشكل العلوي الإبرة داخل القناة الصفراوية المشتركة مع المشبك الأوعية الدموية المطبقة في أمبولة فالتر. ويبين الشكل السفلي البنكرياس-perfused لliberase بعد الحقن.
الرقم 3: الصور النمطية للنوع البرية والجزر المعزولة ديسيبل / ديسيبل (A) نوع البرية الجزر المعزولة. (B) ديسيبل / ديسيبل الجزر المعزولة. (C) وكيل هضمها الجزر مع خلايا عنيبية المرفقة (السهام). (D) الإفراط في هضم الجزر مع الجزر الصغيرة وغامض (السهام). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: المكونات الرئيسية لالمجهر 2 فوتون حسب الطلب الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مثال واحد حدث الأنسولين الحبيبية الانصهار كما هو مسجل مع 2 الفوتون المجهري يمثل الرقم الأيسر الخلية قبل (A) وبعد (B) ظهور حدث exocytic (السهم) ردا على 15 ملي التحفيز الجلوكوز. (C) يوضح وضع العلامات SRB مع دخوله للصباغة SRB خارج الخلية في الحبيبية عندما تدمج مع غشاء البلازما. (D) ويبين كثافة مضان على المنطقة ذات الاهتمام حدث exocytic فضلا عن sequentiaصور ل لهذا الحدث exocytic (مقياس شريط 1 ميكرون). الصورة المعدلة من دو وآخرون 2014 (7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
وتسجل الردود من النوع البري والسكري الجزر ديسيبل / ديسيبل تحت المجهر 2 الفوتون مع SRB كما الصبغة خارج الخلية في هذه التجارب الأنسولين الأحداث الحبيبية الانصهار استجابة لخفض 15mm التحفيز الجلوكوز: الرقم 6. الدوائر الصفراء هي مواقع الأحداث exocytic خلال 20 دقيقة من التسجيل. الصورة المعدلة من دو وآخرون 2014 (7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العامل الأكثر أهمية في عزلة جزيرة هو نضح الأولي من البنكرياس. وتحت perfused لنتائج البنكرياس في أقل من ذلك بكثير العائد جزيرة. عوامل أخرى تؤثر أيضا على جودة العزل مثل الوقت الهضم ومستوى الهز الذي يمكن أن يعوض جزئيا عن مستوى التروية. على سبيل المثال، سوف تحتاج إلى البنكرياس perfused لبالكامل لتكون المحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 18 دقيقة ~ 30 ثانية في حين يهز بلطف، في المقابل وكيل هضمها قد تتطلب البنكرياس ~ 20 دقيقة الهضم مع اهتزاز أصعب. مزيج من اثنين من الانزيمات والهضم في أيدينا يوفر أفضل العزلة جزيرة من أي واحد وحده. لكولاجيناز الطريقة فقط، وهي المرة الهضم يؤثر بشكل حاسم العائد جزيرة وفروق التوقيت من 30 ثانية فقط يمكن أن تؤثر بشكل كبير الجودة. لliberase فقط، والعائد هو مقبول ولكن تحت الهضم يحدث في بعض الأحيان، ونحن نعتقد أن إضافة كولاجيناز يساعد على هضم النسيج الضام أفضل.
معشوقة = "jove_content"> لقد وجدنا ديسيبل / الفئران ديسيبل لها الظواهر السكري متنوعة، حتى بين الأشقاء. ونتيجة لذلك، يتم إجراء اختبارات تحمل الغلوكوز على كل حيوان قبل التضحية بشكل روتيني. وهذا يتيح تصنيف الحيوانات من حيث يستريح مستويات الجلوكوز والمنطقة تحت المنحنى ردا على الجلوكوز حقن.
هناك عدد من التجارب الممكنة التي يمكن القيام بها بعد أن تم عزل الجزر. الجزر المعزولة يمكن أن تكون ثابتة في امتصاص العرق أو الميثانول مباشرة بعد العزلة وتستخدم في تلوين المناعي لتحديد الموقع من البروتينات التي تهم 10. الجزر المعزولة يمكن أن تفرق في الخلايا واحدة. ويمكن القيام بذلك في نفس اليوم من جزيرة العزلة أو بعد بضعة أيام من ثقافة الجزيرة. ومطلي ثم الخلايا وحيدة خارج وهذا هو الإعداد الذي كان الدعامة الأساسية لتقنيات مثل المشبك التصحيح ومجموع المجهر التأمل الداخلي. في التجارب التي تقيسإفراز الأنسولين، فضلا عن الخلية الحية التصوير 2-الفوتون، وجدنا أن الجزر تتطلب 2 أيام في الثقافة من أجل إعطاء بيانات قابلة للتكرار. ما يحدث في الثقافة ليست مفهومة جيدا ولكن يعتقد أن فترة التعافي من عملية العزل والهضم.
تقنية 2-الفوتون المعروضة هنا تمكن الباحثون إلى صورة عملية إفرازية الانسولين على مستوى الأفراد الانصهار الحبيبية من العديد من الخلايا في الجزر سليمة. لقد وجدنا أن عدد الأحداث الحبيبية الانصهار وتوقيتها يتسق مع المبالغ و ملفه الشخصي الزمني لإفراز الأنسولين 8. ويشير ذلك إلى الطريقة يكتشف غالبية الأنسولين الحبيبية الأحداث الانصهار. وبالنظر إلى أن دخول الصبغة في لحبيبات الصمامات ليست طريقة محددة للكشف عن الأنسولين الحبيبية الأحداث الانصهار لقد قطعت أشواطا طويلة لإجراء تجارب السيطرة على إثبات أن الاندماج الأنسولين الحبيبية في خلايا بيتا يتم دراستها 7،8
هناك عدد من المشاكل التقنية مع المجهر 2 الفوتون التي هي عامة لجميع المناهج التصوير. على سبيل المثال، فإننا تحقيق توازن دقيق بين العوامل المتعارضة محاولة للحصول على ما يكفي من الضوء في لالجزر حتى نتمكن من الحد من مكاسب للكشف، وبالتالي الحد من الضوضاء، مع وضع الكثير من الضوء في لجزر أننا تسبب تلف الخلايا. في نظامنا، يتم استخدام خلية Pockels للتخفيف من الليزر النبضي (الشكل 3). جميع الأنظمة التجارية لديها آليات لتغيير شدة الضوء الذي يسقط على أن العينة.
وباختصار، فإن الجمع بين العزلة حذرا من ديسيبل / دب الجزر وبكل خلايا البنكرياس 2 الفوتون المجهري فرصا جديدة لدراسة عمليات إفراز الأنسولين وتحديد العناصر المعيبة الرئيسية في داء السكري من النوع 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
