Abstract
Under hjerte udvikling, dannelsen af myokardisk-specifikke strukturelle og funktionelle enheder, herunder sarkomerer, kontraktile myofibriller, interkalerede diske og costameres kræver koordineret samling af flere komponenter i tid og rum. Forstyrrelser i samlingen af disse komponenter medfører udviklingsmæssige hjertefejl. Immunfluorescensfarvning teknikker anvendes almindeligvis i dyrkede cardiomyocytter at probe myofibrillære modning, men denne ex vivo fremgangsmåde er begrænset af det omfang, hvori myocytter fuldt ud differentiere i kultur, mangel på normale in vivo mekaniske indgange, og fravær af endokardiale signaler. Anvendelse af immunofluorescensteknikker til studiet for at udvikle mus hjerte er ønskelig, men mere teknisk udfordrende, og metoder ofte mangler tilstrækkelig følsomhed og opløsning for at visualisere sarkomerer i de tidlige stadier af hjerte udvikling. Her beskriver vi en robust og reproducerbar metode til at co-immunofarvningsprocedure multiple proteiner eller til at co-visualisere et fluorescerende protein med immunfluorescensfarvning i embryonale mus hjerte og bruge denne metode til at analysere udviklingslandene myofibriller, interkalerede diske og costameres. Denne fremgangsmåde kan yderligere anvendes til at vurdere cardiomyocyte strukturelle ændringer som følge af mutationer, der fører til udviklingsmæssige hjertefejl.
Introduction
Under udvikling, begynder hjerte sammentrækninger snart efter kardiomyocytter migrere til midterlinjen og danne den lineære hjerte rør 1,2. Den sarkomer er den grundlæggende kontraktile enhed i cardiomyocyte; dette velorganiseret cytoskeletal struktur indeholder actinfilamenter forankret til Z-disken ved sarcomerisk α-actinin (s-α-actinin) og myosin fibre forankret til M linje (figur 1). Som cardiomyocyte modnes, sarkomerer samles i serie til dannelse af myofibriller som strækker sig over cellen. Myofibriller er forankret til enderne af cardiomyocyte af det indlejrede disk, celle-celle-forbindelsesepitop struktur, der indeholder et overgangs- krydset med en delmængde af Z-disc elementer såsom S-α-actinin 3, adherens junction proteiner, såsom N-cadherin og β catenin, gap junction proteiner og desmosomer (figur 1) 4. Langs den langsgående membran, Z-diske af perifere myofibriller ogsåtillægger cellemembranen via costameres; disse specialiserede fokale adhæsioner give et anker mellem myofibrillære, plasmamembran og ekstracellulære matrix for at tilvejebringe yderligere strukturel støtte til cardiomyocyte (figur 1) 4. Tidligt i hjertet udvikling, er kardiomyocytter arrangeret i finger-lignende fremskrivninger kendt som trabekler der stikker ind i det ventrikulære rum og indeholder relativt modne myofibriller 5. Som hjerte for udvikling skrider frem, de kardiomyocytter i sub-epikardial region formere til at danne den kompakte myokardiet, der omfatter de ventrikulære vægge, men sarkomer og myofibrillære samling er forsinket i forhold til trabekulær myocardium 5,6.
Vis alle modeller af sarkomer og myofibrillære samling kommer i høj grad fra immunofluorescens undersøgelser på dyrkede cardiomyocytter 7-10, som er ligetil, men mangler et tredimensionelt miljø, blodgennemstrømning og kontakter med andre hjerte-celles til stede in vivo. høj opløsning strukturelle undersøgelser under anvendelse af immunofluorescens i mus embryonale hjerte er teknisk udfordrende, og få undersøgelser har udforsket fremkomsten af interkalerede diske og costameres under mus hjerte-udvikling. Den adherens krydset protein β catenin synes at lokalisere til interkalerede diske ved embryonale dag (E) 17,5 11, N-cadherin lokaliseres til lineære strukturer, der kan repræsentere interkalerede diske ved E18.5 12 versus postnatal dag 0 13, og costameres er blevet påvist ved E18.5 14, men disse proteiner viser diffus og mere kontinuerlig membran fordeling på tidligere udviklingsmæssige tidspunkter 11-13.
Her beskriver vi en enkel og reproducerbar metode til immunfarvning og fluorescens mikroskopi af sektioneret muse embryonale hjerter, der giver mulighed for detaljeret analyse af myofibrillære og cardiomyocyte udvikling, herunder fremkomsten af intercalaTed diske så tidligt som E12.5 og vordende costameres ved E16.5. Denne protokol kan være nyttig til sondering af virkningerne af mutationer på sarkomer dannelse samt myofibrillære og cardiomyocyte modning.
Protocol
BEMÆRK: Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af UCSF Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Kryopræservering og fiksering af embryonale Mouse Hearts.
1.1) Snap-frysning embryonale hjerter
- Fyld en 3,5 cm petriskål og 7 mm cryomolds med Optimal Cutting Temperatur (OLT) medium (se Materialer tabel). I en kemisk hætte, afkøl 2-methylbutan i flydende nitrogen.
- Dispenser 30 ml phosphatbufret saltvand (PBS) i 10 cm petriskåle, 10 ml PBS i 3,5 cm petriskåle, og placere alle petriskåle på is. Forbered en 10 cm skål og flere 3,5 cm retter pr gravide mus.
- Isoler embryoer som tidligere beskrevet 15 udfører dissektion i iskold PBS.
- Kort fortalt aflive den gravide kvinde ved hjælp af CO 2 narkose og cervikal dislokation.
- Lav et snit i maven, dissekere ud livmoderen ved at skære skibene along den indvendige krumning af livmoderen og overføre livmoderen til en 10 cm petriskål indeholdende iskold PBS.
- Skær livmoderen mellem hvert embryo og overførsel til en enkelt 3,5 cm petriskål indeholdende iskold PBS. Isoler hver embryo som beskrevet 15.
- Åbn perikardial hulrum ved hjælp af fine pincet, fjern hjerte væk fra lungerne og kar ved at skære på aorta, vena cava inferior, og lungevener, og overføre til 3,5 cm petriskål indeholdende oktober
- Lad hjertet ligevægt i oktober i flere sekunder og derefter overføre hjertet ind i 7 mm form indeholdende oktober Vend den forreste væg af hjertet til bunden af formen.
- Anbring forsigtigt formen i flydende nitrogen-afkølet 2-methylbutan. Pas på ikke at tillade 2-methylbutan væske at røre OLT eller hjerte. Frys indtil OLT er solid hvid, derefter overføre formen til en ice bucket indeholdende tøris. Gå videre til næste embryo.
- Wrap cryomolds i folie og opbevares ved -80 ° C indtil den er klar til cryosectioning.
1.2) Alternativ: Paraformaldehyd (PFA) fastsættelse cryoprotecting og oktober indlejring embryonale hjerter
- Fyld brøndene i en 12-brønds vævskulturplade med 4% PFA i 1x PBS.
- Dissekere de embryonale hjerter som beskrevet i 1.1.3. Placer hvert hjerte i en brønd indeholdende 4% PFA og løse ved 4 ° CO / N.
- Kryobeskyttelse: ved hjælp af en plast transfer pipette flytte hver hjerte til en 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 1,5 ml 15% sucrose i PBS og ryst forsigtigt ved 4 ° C, indtil hjertet synker til bunden af røret (flere timer til O / N ). Overfør hvert hjerte til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 1,5 ml 30% sucrose i PBS og ryst forsigtigt ved 4 ° C igen, indtil hjertet synker til bunden af røret (flere timer til O / N).
- Ved hjælp af en plastik overførsel pipette placere kryobeskyttet hjerte i oktober og lad den ligevægti flere minutter for at fjerne overskydende saccharose, derefter overføre hjertet ind i 7 mm form indeholdende oktober Vend den forreste væg af hjertet til bunden af formen.
- Frys hjertet i OCT ved at placere formen i enten flydende nitrogen-afkølet 2-methylbutan eller tøris.
- Wrap cryomolds i folie og opbevares ved -80 ° C indtil den er klar til cryosectioning.
2. Cryosectioning
- Indstil kryostat temperatur til -17 ° C.
- Place cryomolds i kryostatkammeret og ækvilibrere til temperatur i 15-20 min.
- Vend kryoformen og brug blide tryk at uddrive hjerteblok fra formen. Vend den forreste væg af hjertet til toppen af den støbte vævsblok.
- Placer en stor dråbe oktober på chuck, og monter hjerteblok på OLT slip for at fryse på borepatronen. Hold orientering, således at den forreste væg af hjertet er længst væk fra værktøjsholderen.
- Læg chuck og monterede hankunst blok på kryostat objekt indehaveren. Juster således at vinklen af bladet er 3-5 ° i forhold til prøven.
- Saml 10 um snit onto objektglas, der er blevet forbehandlet med en positivt ladet belægning (se Materialer tabel). Lad det tørre helt, før opbevaring ved -80 ° C.
3. Immunofluorescens
- For snap-frosne snit, fix og permeabilisere væv i acetone i 10 minutter i et stinkskab ved stuetemperatur.
- For snap-frosne og PFA-faste sektioner, inkuberes i PBS-0,1% Triton X-100 i 20 minutter for at fjerne oktober og permeabilisere PFA-faste sektioner.
- Blokken 45 minutter i 1x blokerende buffer, fortyndet i PBS.
- Hvis der anvendes et primært antistof genereres i mus, inkuberes i æsel eller gede-anti-muse-IgG (H + L) monovalent Fab-fragment fortyndet 1: 100 i PBS-0,1% Tween 20 i 45 minutter ved stuetemperatur (se diskussion).
- Inkuber i primært antistof eller antistoffer fortyndet i 1x blokeringsbuffer i 2 timer ved stuetemperatur ellerO / N ved 4 ° C (se tabel Materialer / udstyr til specifikke fortyndinger).
- Vask sektioner i 1x PBS tre gange i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber i Alexa Fluor-konjugeret sekundært antistof fortyndet 1: 500 i blokeringsbuffer i 2 timer ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Vask sektioner i 1x PBS tre gange i 10 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Valgfrit: Inkubér i Hoechst farvestof fortyndet 1: 2.000 i PBS ved stuetemperatur (beskyttet mod lys) til at mærke kerner, derefter skylles med PBS.
- Post-fix mærkede sektioner i 1% PFA i 1 min ved stuetemperatur.
- Mount glider i anti-fade medium (med DAPI hvis kerner ikke allerede mærkes) ved at placere to dråber medium i hver ende af slæden og derefter dække med et dækglas. Seal dækglas med neglelak. Opbevares beskyttet mod lys ved 4 ° C indtil den er klar til billedet.
4. Konfokal Imaging og billedanalyse
- Tænd passende laser bølgelængder, kamera og konfokalmikroskop including etape mover og z motor. Start program til billedbehandling. Brug 405, 488, og 561 laser bølgelængder til billeddannelse Hoechst-, Alexa 488- og Alexa 568-farvede snit hhv.
BEMÆRK: Se Materialer Tabel til vores hardware og software specifikationerne. - Monter dias kontrollen (dækglasset ned for et omvendt mikroskop) på diaset scenen.
- Brug af 4X objektiv (se Materialer Table), finde prøven og området af interesse. Tage billedet skal bruges som et kort, når billeddannelse ved stor forstørrelse.
- Fjern dias, hvilket gør minimale justeringer af dias scenen. Skift til 60x olieimmersion mål (se Materialer Table), placere en lille dråbe olie på målet, og erstatte det dias (dækglasset ned) på slæden scenen.
- Find prøve igen. Indstil laser magt, eksponeringstid, og binning til de ønskede niveauer for hver kanal.
BEMÆRK: Vi bruger generelt laser magt på 0,8, kamera eksponeringstid på 100 ms, og binning af 2 (see Materialer Tabel til hardware og software specifikationer); optimale indstillinger skal bestemmes empirisk for hvert forsøg.- Når optimale indstillinger bestemmes, bruge de samme indstillinger for alle vævssnit inden forsøget. Brug intensiteten histogram at bemærke den optimale intensitet interval for hver kanal (denne information vil blive brugt til analyse).
- Generer az stak med funktionen købet: vælge de relevante laserkanaler, og vælg derefter den øvre og nedre grænser for z stakken. Vælg az stak trin størrelse, der er halvdelen af værdien af den optiske skive tykkelse leveres af softwaren. Klik på "Kør" for at samle billederne.
- Brug Fiji 16 eller et tilsvarende program til billedanalyse. Inden Fiji Åbn z stak fil med brugerdefinerede farvemodusindstilling og kanalerne opdelt i separate vinduer. Åbn "Adjust Lysstyrke / Kontrast" værktøj fra Billed rullemenuen; inden for hver kanal, set optimalt histogram intensitet interval bestemt i 4.5.1. Anvend disse kanal intervaller for alle z stakke blive analyseret.
- Flet de enkelte kanaler i en enkelt sammensat billede ved hjælp Billede-> Color rullemenuen.
- Opret en fladtrykt z stak fra det sammensatte billede ved hjælp af Billede-> Stacks-> menu z projekt. Dette billede vil være betydeligt lysere end 3D-billedet; justere histogram intensitet interval for kontrolprøven at undgå overmætning, og anvende de samme indstillinger til den eksperimentelle fladtrykt z stakken.
- For at generere en 3D-billede, først bruge Billede-> Stacks-> 3D projekt menu 17. Vælg enten x-aksen eller y-rotationsakse. Indstil skive mellemrum det samme antal mikron som z stak skridt størrelse. Vælg den ønskede samlede rotation og sætte rotationsvinklen tilvækst til 1. Åbn derefter billede J 3D Viewer fra Plugins rullemenuen. Vælg det sammensatte billede genereres i 4,8, display som Volume, og indstil Reprøveudtagning faktor 1 eller 2.
Representative Results
Figurerne 2 til 6 viser typiske resultater for co-farvning af forskellige proteiner i en snap-frosset og acetone-fikserede hjerte. Antistoffet mod S-α-actinin reproducerbart mærkede Z-diske og interkalerede diske med høj specificitet og minimal baggrund (figur 2A, 3A, 4A, 5A, 6A og 6C) Figur 6 viser, at anti-muse-IgG (H + L) monovalent Fab-fragment effektivt blokerer endogene muse IgG binding af anti-muse-sekundære antistoffer. Antistoffet mod adherens junction protein β catenin bundet membranen både cardiomyocytter og ikke-cardiomyocyte celler og co-lokalisering med S-α-actinin forekom i formodede interkalerede diske med E16.5 (figur 2C og D), som forventet ud fra den β catenin farvningsmønster i den voksne hjerte 18. β1 integrin immunofluorescens i embryonale hjerte er særligt udfordrende og ofte undlader at identificere fokale sammenvoksninger 14, men β1 integrin farvning i disse undersøgelser viste signal med samme regelmæssighed som s-α-actinin-mærket Z-diske, hvilket muligvis afspejler spirende costameres danner på E16.5 (figur 3D).
Ved E12.5, s-α-actinin og tropomyosin (sarkomer tynd filament protein) immunofluorescens afslørede et farvningsmønster med regelmæssig periodicitet i trabekulære cardiomyocytter overensstemmelse med modne myofibriller i disse celler (figur 4A og 5A for S-α-actinin; figur 4B for tropomyosin). N-cadherin farvning i trabekulære cardiomyocytter på E12.5 hjerter tendens til at colocalize med områder af intens s-α-actinin farvning (figur 5b - D og figur 6A - C) eventuelt repræsenterer interkalerede diske. Ikontrast til trabekulære myocytter, s-α-actinin i kompakt zone var mere punktformet end lineær, og tropomyosin farvning var diffus snarere end lineær (figur 4A og 4B). Således kan sarkomer samling forekomme senere i kompakt i forhold til trabekulær myocardium. Desuden differentiale mønstre af s-α-actinin og tropomyosin i kompakt zone tyder på, at s-α-actinin organiserer i puncta og umodne Z-diske tidligt, mens tropomyosin inkorporering i den tynde filament kan være en senere begivenhed i myofibrillære forsamling.
Figur 7, Movie 1, og Movie 2 demonstrere typiske resultater fra en PFA-fast E12.5 embryonale hjerte. I disse eksempler blev en LifeAct-RFPruby transgene embryo anvendes til billeddannelse; den LifeAct-RFPruby transgen 19 etiketter filamentøs actin, men kræver PFA fiksering. Z-diske mærket med S-α-actinin var let at visualisere på de fleste områder, men signal-til-støj-forholdet var decre ased sammenlignet med snap-frosne hjerte sektioner (figur 7A); dette signal var typisk for S-α-actinin immunfluorescens i PFA-fikserede væv, hvor epitoper kan maskeres ved protein-tværbindinger. Figur 7B viser co-visualisering af filamentøs actin og immunolabeled S-α-actinin inden myofibriller (pilespidser) og filamentøse actin inden endokardiale celler støder op til trabekulære myocytter (pile). Tredimensionalt billede genopbygning afslørede yderligere detaljer: individuelle cardiomyocytter blev lettere skelnes, myofibriller inden for en cardiomyocyte blev omtrent parallelt med hinanden, men de enkelte cardiomyocytter blev orienteret ved varierende vinkler til hinanden (Figur 7C og D, Movie 1, og Movie 2 ). Den tætte tilnærmelse mellem endokardiale celler og cardiomyocytter var bedre værdsat i de tredimensionale synspunkter.
">
Figur 1. cardiomyocyte sarkomerer, interkalerede diske og costameres. Z-disc ankre actinfilamenter, mens M linje forankrer myosin fibre, som overlapper actinfilamenter. Sarkomeret består af et Z-disc - M line - Z-disc enhed. Flere sarkomerer i serie skabe en myofibrillære. Den laterale ende af myofibrillære indsættes i den tværgående kant af cardiomyocyte på en specialiseret celle-celle-forbindelsesepitop struktur kaldet det indlejrede disk. Perifere myofibriller forbindelse til den langsgående cardiomyocyte plasmamembranen via costameres, som danner fokale sammenvoksninger med den ekstracellulære matrix mellem kardiomyocytter. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
pload / 52644 / 52644fig2.jpg "/>
Figur 2. s- α -actinin og β catenin immunofluorescens på embryonisk dag 16.5. Hjertet blev udskåret, lynfrosset, cryosectioned, acetone-fikserede og immunfarvet under anvendelse af (A) muse-monoklonalt klon EA53 antistof mod S-α-actinin, som mærket cardiomyocyte Z-disc og interkalerede diske, og (B) kanin polycloncal antistof mod adherens krydset protein β catenin. (C) Flettede billeder viser s-α-actinin og β catenin farvning. (D) Forstørret område af interesse fra panel C ; asterisker mærke formodes interkalerede diske med co-lokalisering af s-α-actinin og β catenin. Billeder blev opnået fra det perifere venstre ventrikel væg eller kompakt myocardium, med epikardial lag øverst til venstre af paneler AC. Intensitet histogram display rækkevidde 460-1600 (ud of muligt 0-65535) for både S-α-actinin / 488 nm og β catenin / 561 nm laser-kanaler. Scale bar 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. s- α -actinin og β 1 integrin immunofluorescens på embryonisk dag 16.5. Hjertet blev udskåret, lynfrosset, cryosectioned, acetone-fikserede og immunfarvet under anvendelse af (A) muse-monoklonalt klon EA53 antistof mod S-α-actinin og (B) ged polyklonale antistof mod fokal adhæsion protein β1 integrin. (C) Flettede billeder viser β1 integrin i cardiomyocyte såvel som ikke-cardiomyocyte celler. Bemærk både diffus ogpunktat β1 integrin signal i cardiomyocytter (D) Forstørret område af interesse fra panel C. Bemærk punktformet, periodisk β1 integrin farvning (pile) med hyppighed svarende til den nærliggende S-α-actinin-farvning i Z-diske.; disse strukturer kan repræsentere costameres. Billeder blev opnået fra venstre ventrikel kompakt myocardium. Intensitet histogram display rækkevidde 460-1200 (ud af mulige 0-65535) til s-α-actinin / 488 nm laser kanal og 460-600 for β1 integrin / 561 nm laser kanal. Scale bar 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. s- α -actinin og tropomyosin immunofluorescens på embryonisk dag 12,5: myofibrillære organisation trabekulær og kompakt myocardium. hjerter fra kuld embryoer blev udskåret, lynfrosset, cryosectioned, acetone-fikserede og immunfarvet under anvendelse af (A) muse-monoklonalt klon EA53 antistof mod S-α-actinin og (B) muse-monoklonalt antistof mod myofibrillære tynde filamenter protein tropomyosin (Developmental Studies Hybridoma Bank CH1). Trabekulær (pile) og kompakt myocardium (pilespidser) er angivet. Bemærk lineær S-α-actinin farvning med regelmæssig periodicitet i det trabekulære myocardium, i forhold til en række farvningsmønstre herunder puncta samt lineære farvning i den kompakte lag (A). Bemærk også lineær tropomyosin farvning med regelmæssig periodicitet i trabekulære myocardium, men mere diffus farvning i kompakt myocardium. Intensitet histogram display rækkevidde 460-1,400 (ud af mulige 0-65535) til s-α-actinin kanal og 460-1,000 for tropomyosin kanal. Scale bar 10 pm."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. s- α -actinin og N-cadherin immunofluorescens på fosterdag 12.5:. Myofibriller og interkalerede diske i trabekulære cardiomyocytter Hjertet blev udskåret, snap frosne, cryosectioned, acetone-faste, og immunofarvet hjælp (A) monoklonalt muse klon EA53 antistof mod S-α-actinin og (B) kanin polyklonalt antistof mod fokal adhæsion protein N-cadherin. 0,2 um optiske skiver blev opsamlet som AZ stakken og z stakke blev fladtrykt for at generere billederne. (C) sammenflettede fladtrykte stakke viser både N-cadherin og S-α-actinin farvning inden trabekulære cardiomyocytter som Well som kerner mærket med Hoechst farvestof (D) forstørrede område af interesse fra panel C.; stjernerne markerer interkalerede diske med co-lokalisering af s-α-actinin og N-cadherin. Intensitet histogram display rækkevidde 470-1,200 (ud af mulige 0-65535) til Hoechst / 405 nm laser kanal og 470-2,000 for både s-α-actinin / 488 nm og N-cadherin / 561 nm laser-kanaler. Scale bar 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Anti-muse-IgG (H + L) monovalent Fab-fragment effektivt blokerer endogene muse IgG binding af anti-muse-sekundære antistoffer. Den E12.5 embryoniske hjerte blev udskåret, lynfrosset, cryosectioned, acetone-fikserede og immunfarvet.
Figur 7. s- α -actinin og actin organisation i trabekulær cardiomyocytes på embryonisk dag 12,5. Den LifeAct-RFPruby transgene mus linje blev anvendt til at visualisere filamentøs actin 19, mens musen monoklonale klon EA53 antistof mod S-α-actinin blev anvendt til at mærke Z-diske og interkalerede diske. Embryoner blev PFA-fikserede. 0,2 um optiske skiver blev opsamlet som az stabel (A) Flad z stak viser, at s-α-actinin farvning var mere diffus PFA-fikserede væv end i lynfrosset og acetone faste sektioner (figurer 2-5).. (B ) Flad z stak viser både trådformede actin og s-α-actinin. Filamentøs actin fluorescens lokaliseret mellem Z-skiver inden myofibriller (pilespidser). Filamentøs actin-fluorescens blev også set i endokardiale celler, linje det trabekulære myocytter (pile). (C) tredimensionalt billede af det trabekulære cardiomyocytter, set fra toppen af stakken. (D) tredimensionalt billede afdet trabekulære cardiomyocytter, set fra bunden af stakken. Intensitet histogram display rækkevidde 470-900 (ud af mulige 0-65535) for både 488 nm laser kanal og for 561 nm laser kanal i A og B; display interval 460-800 for begge kanaler i C og D. Scale bar 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Movie 1. 360 ° roterende 3D-visning af S- α -actinin og actin organisation i trabekulære cardiomyocytter ved fosterdag 12.5. Billedet stak fra figur 6 blev afsagt i tre dimensioner ved hjælp af billede J 3D Viewer plugin i Fiji billedanalyse program. Intensitet histogram display rækkevidde 470-800 (ud af mulige 0-65535) for både de 488 nm og 561 nm laser-kanaler. </ P>
Movie 2. Udvalgte 3D-visninger af S- α -actinin og actin organisation i trabekulære cardiomyocytter på embryonale dag 12.5. Billedet stak fra figur 6 blev afsagt i tre dimensioner ved hjælp af billede J 3D Viewer plugin i Fiji billedanalyse program. Små rotationer omkring x, y og z-akserne viste relativt justeret myofibriller inden cardiomyocytter men dårlig tilpasning mellem de fleste kardiomyocytter. Små rotationer også vist, tæt tilnærmelse af endokardiale celler, der mangler S-α-actinin omkring kardiomyocytter. Intensitet histogram display rækkevidde 470-800 (ud af mulige 0-65535) for både 488 nm og 561 nm laser-kanaler.
Discussion
Den optimale vævsfiksering teknik og fortynding skal bestemmes empirisk for hvert antistof. I vores hænder, snap-frysning er overlegen i forhold til PFA fiksering flere cardiomyocyte antigener, herunder s-α-actinin, β-catenin, β1-integrin, tropomyosin, Tallinn (ikke vist) og N-cadherin; i modsætning PFA fiksering giver overlegne resultater for fokal adhæsion kinase (ikke vist). De protein tværbindinger dannet af PFA kan maskere epitoper og begrænse antistofbinding; antigen hentning kan være påkrævet i sådanne tilfælde, og metoder til antigen hentning kan findes andre steder 20. PFA koncentration eller længden af fiksering kan reduceres for at reducere epitop maskering, med optimale betingelser empirisk for hvert antistof og ved hvert udviklingsstadium. Passende negative kontroller bør anvendes, når der kendetegner en ny antistof eller hjerte-mutant, herunder præimmunserum som det primære antistof kontrol og et "nej primært antistof" control. Anvendelse af knockout-mus er en ideel negativ kontrol men tidlig dødelighed forhindrer deres anvendelse til mange af de genprodukter undersøgt her.
Anvendelse af passende mængder til helt dykke eksperimentelle og kontrolglas i samme immunofluorescens blokering, antistof og vaskeopløsninger var vigtig, da var blid vuggende af dias under inkubation at sikre en ensartet eksponering af sektionerne til løsningerne. Denne fremgangsmåde minimeres teknisk variabilitet i farvning mellem afsnit og dias inden et eksperiment. Når omkostninger begrænser løsning volumen antistoffet Brug en Pap pen til at begrænse strømmen af løsninger ud over vævssnit og holde dias i et fugtigt kammer under lange inkubationer. Hvis et monoklonalt muse primært antistof - og dermed et anti-muse-sekundært antistof - der bruges, vil et andet blokerende trin til dækning endogene muse immunglobuliner være nødvendigt (trin 3.4) for at reducere ikke-specifik baggrund signal.
Passende mikroskopi og billedbehandling teknikker er afgørende for at opnå biologisk præcise oplysninger 21. Intensiteten histogram viser fordelingen af pixels ved hvert intensitetsniveau (0-65.535 niveauer for en 16-bit billede) for hver farve. Baggrund, kan lysstyrke og kontrast justeres ved at indstille en intensitet display område, der flankerer histogrammet peak; at foretage valide sammenligninger mellem forhold, skal de samme indstillinger mellem kontrol og eksperimentelle betingelser anvendes.
Denne protokol giver en pålidelig metode til at analysere cardiomyocyte modning og udvikling i det native embryonale mus hjerte. Mens immunfluorescens af cardiomyocyte-specifikke proteiner ofte bruges til at markere kardiomyocytter under udviklingen, få undersøgelser beskæftiger teknikker, der tillader høj opløsning analyse af myofibrillære struktur og fremkomsten af interkalerede diske og costameres 12-14,22,23. Denne teknik kan anvendes i vIvo vurdering af mutationer, der forårsager udviklingsmæssige hjertefejl, som et middel til at identificere ændringer i cardiomyocyte modning, der kan kaste lys over mekanismerne for strukturelle abnormiteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 7x 7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 15 x 15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
| Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
| 2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1x PBS, pH 7.2-7.4. |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
| Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
| Acetone | Sigma | 179124 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1x in PBS. |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
| Anti-s-α-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-βcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
| Anti-β1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
| Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
| Clara Interline CCD camera | Andor | ||
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
| CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
| CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
| CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
| NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
| Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Risebro, C. A., Riley, P. R.
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation research. 92, 133-135 (2003).
- Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc. Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).
- Kastner, P., et al. Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes. Development. 124, 4749-4758 (1997).
- Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC). American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).
- Kim, Y. Y., et al. Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture. Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).
- Lu, M. H., et al. The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes. The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).
- Schultheiss, T., et al. Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils. The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).
- Samarel, A. M. Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).
- Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).
- Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. N-RAP expression during mouse heart development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).
- Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart. Developmental biology. 289, 430-441 (2006).
- Whitman, S. A., et al. Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle. Circulation research. 109, 262-271 (2011).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC. 11, 274 (2010).
- Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis. Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nature. 7, 168-169 (2010).
- Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).
- Risebro, C. A., et al. Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart. Development. 136, 495-505 (2009).
- Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments. Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).
