Introduction
Типы I и III интерфероны (IFN) имеют решающее значение в иммунной реакции на наличие вирусов и других патогенных раздражителей и присутствует во всех позвоночных 1. Иммунные и не иммунные клетки экспрессируют и секретируют, а также реагировать на, IFN 2. Врожденная иммунная датчики, такие как Toll-подобные рецепторы (TLR), Стинг, и RIG-I, вызывают Тип I и выражение III IFN при обнаружении патогенных связанные молекулярные модели (PAMP) 3,4. У человека, тип I IFN включают интерферон-β, -ω, -κ и 12 подтипов IFN-α, и связываются с рецептором IFNAR1 / IFNAR2 комплекса 2,5. Тип III IFN включают интерферон-λ1, -λ2 и -λ3 и связываются с рецептором комплекса IL10RB / IL28RA 2. Классически, типы I и III IFN связываются с соответствующими рецепторных комплексов, которые затем нанимают stat1 / stat2 гетеродимеры и инициировать транскрипцию интерферона стимулируется генов (ISG) 6. ISG участвуют в разнообразных функций, от противовирусной и антипролиферативная активность к активации адаптивного иммунного ответа 7.
Многочисленные механизмы патогены эволюционировали, чтобы избежать, подорвать и захватить элементы пути IFN сигнализации продемонстрировать важность IFN в врожденного иммунного ответа 8. Например, вирус коровьей оспы выражает приманка рецептор с IFNAR1 гомологии, что секвестров IFN типа I 9, а вирус Yaba, как болезнь выделяет гликопротеин, который ингибирует введите белки I и III ИФН 10. В дополнение к их роли в защите хозяина, IFN также участвуют в наблюдении рака и ряда авто-воспалительных заболеваний: молчание IFN экспрессии в клетках рака молочной железы ограничивает иммунного 11, перепроизводство IFN-α является механизм в развитии системного красная волчанка 12, и странствующий активации Стинга приводит к системной воспалительной реакции, вызванной чрезмерным количеством IFN в STING-ассоциированной васкулопатии13. Терапевтически, ИФН используются для лечения рассеянного склероза 14, хронические вирусные инфекции, такие как HBV 15 и HCV 16,17 и раковых заболеваний, таких как волосистой клеточной лейкемии 18 и хронический миелолейкоз 19. Вопросы о значимости ИФН в конкретном физиологическом процессе постоянно показывают универсальную природу этого семейства цитокинов.
IFN типа I, особенно ИФН-α подтипов, которые часто рассматриваются как единое целое 20-23, а не в качестве группы тесно связаны, но различны, белков. Существование и сохранение нескольких видов, включая IFN IFN-α подтипов, в ходе эволюции позвоночных 24 предполагает, что, по меньшей мере подмножество этих подтипов имеют специфические или уникальные функции. Вполне возможно, что, определяющие паттерны экспрессии IFN будет расшифровывать и помочь характеризуют специфические функции одного или нескольких подтипов 17. Задача изучения тон типа подтипа I и III ИФН на основе их идентичности общей последовательности: двенадцать IFN-α подтипы поделиться> 50% 25 и IFN-λ подтипы поделиться 81-96% 26 аминокислотных последовательностей. В описываемом Qrt-ПЦР, молекулярно-маяка (МБ) и закрывается нуклеиновой кислоты (LNA) флуоресцентные зонды различить одиночные различия пар оснований между высокой подобных последовательностей подтипа ИФН и позволяют для характеристики экспрессии IFN подписи. Формат пластина 384-а для анализа включает в себя как количественные (стандарты стенограмма) и полу-количественные (гены хозяйствования (HKG)) меры, позволяющие для анализа числа стенограмма копирования и ΔCq соответственно. Пакетная сборка, способствует автоматизированной многоканальной пипетки и длительного хранения, возможной в результате сушки грунтовки / зонд (Pr / Pb) устанавливает на пластинах, повысить воспроизводимость, полезность и практичность анализа.
Этот протокол описывает процессдля подготовки 384-а Qrt-ПЦР пластины (рис 1) с до семнадцати различных наборов Pr / Pb, направленных на подтипы человека ИФН (таблица 1). Pr / Pb установлено источником рабочего акции пластины (рис 2) используются для приготовления кратное 384-а Планшеты в процессе, который может быть автоматизирован с помощью роботизированной многоканальной пипетки. Хотя первоначальный акцент был на создании протокол для изучения подписей экспрессии IFN человека, этот метод был применен к резус-макак, а также. Хотя пластины макеты немного отличаются и множества Pr / Pb (таблица 2) различны, в целом способ получения для создания человека и резус пластины идентично. С минимальными изменениями протокола, метод может быть выполнен для обеспечения развития анализах для изучения других групп, тесно связанных генов.
Смотрите рисунки 1 и 2 ниже
См таблицах 1 и 2 Белой
Protocol
1. Подготовка стандартных серийных разведений (3А)
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательное разбавление серии линеаризованных плазмид, содержащих последовательности целевых набором Pr / Pb используются как количественные стандарты для анализа Qrt-ПЦР. Каждый стандартный серийный набор разбавления ИФН подтипов содержит достаточный объем для запуска 90 Планшеты. Четыре точки стандартной кривой разбавления, используемых для анализа выбраны так, чтобы покрыть значения Ct из диапазона от 20 до 32 (таблица 3).
- Оттепель, вихревые, и кратко центрифуги стандарт (50 PM) и ДНК спермы лосося (одноцепочечной ДНК, 10 мг / мл) растворы.
- Подготовка смеси оцДНК / воды для 17 стандартных наборов разбавления путем смешивания 51 мкл оцДНК с 20,3 мл воды.
- Пометьте одну 8-трубки ПЦР полосу для стандартного набора разбавления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка стандартных серийных разведений из маточных растворов состоится 2-3 ч. - Отказаться от 190 мкл смеси одноцепочечной ДНК / вода в Fрежде трубка в полосе до 180 мкл одноцепочечной ДНК смеси / вода оставшихся пяти трубок.
- Выполните разведение 1:20, передав 10 мкл из стандартного складе 50 вечера до трубки с 190 мкл одноцепочечной ДНК / воды, размешать; вихрь и быстро центрифуги полосу ПЦР.
- Выполнение разбавление 1:10 путем передачи 20 мкл из недавно разведенного трубки к следующей трубе в серии; вихрь и быстро центрифуги полосу ПЦР.
- Повторите шаг 1,6 до последнего трубки в серии разведений получил стандарт.
- Повторите шаги 1,3-1,7 для каждого стандарта.
См таблицу 3 ниже
2. Подготовка грунтовки / зонд (Pr / Pb) управление Template (NTC) Рабочая Stock Миксы (3В)
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый 1.7 мл Pr / Pb установлено производственные запасы и 128,6 мкл никакого контроля шаблонов (NTC) производственные запасы смеси составит 30 Планшеты.
- Подготовка Pr / Pb установлено производственные запасы смесей.
НЕE: Получение множества Pr / Pb и NTC работает фондовый смеси из исходных растворов займет 2-3 ч.- Ресуспендируют праймеры и зонды 100 мкм на ультра-чистой воды для приготовления исходных растворов.
- Этикетка до семнадцати 2 мл пробирки; один для каждого набора Pr / Pb, включенных в анализ.
- Оттепели, вихревые, и кратко центрифуги праймеров (100 мкм) зонды (100 мкм) и оцДНК (10 мг / мл) растворы.
- Добавить 2 мкл одноцепочечной ДНК каждой трубки, используя 12,5 мкл электронный многоканальную пипетку. Добавить соответствующий прямой праймер, обратный праймер, и зонд друг Pr / Pb установлено работает фондовый трубку. В таблице 1 для наборов Pr / Pb, направленных на подтипы человека ИФН и таблицу 2 для макаки-резус множеств Pr / Pb. Добавьте воду, чтобы довести объем каждого Pr / Pb установлено работает фондовый трубку 200 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: объем грунтовки, зонда, и вода, чтобы добавить зависит от требуемой конечной концентрации реакции Pr / Pbустановлен.
- Подготовьте NTC производственные запасы смесей.
- Этикетка две ПЦР 5-трубка-полоски для рабочих запасов NTC смеси.
- Трансфер 14,3 мкл каждого Pr / Pb установлено соответствующее NTC трубки производственные запасы смеси. Таблицу 4 для набора комбинаций Pr / Pb для NTC скважин. Добавьте воду, чтобы каждый из рабочей наличии NTC смеси, чтобы довести до конечного объема 128,6 мл.
- Vortex, кратко центрифуги и поместите пробирки в темноте на льду или при -20 ° С в течение длительного хранения.
См таблице 4 ниже
- Развести Pr / Pb установлено рабочие запасы.
- После удаления аликвоты множеств Pr / Pb, необходимых для работы NTC фондовых смесей, добавляют 1,5 мл воды, чтобы довести конечный объем каждой Pr / Pb устанавливается работает запаса трубки 1,7 мл.
- Vortex, кратко центрифуги и поместите пробирки в темноте на льду или при -20 ° C на более длительный срок хранения.
- Подготовка исходного 96-луночного планшета множеств Pr / Pb и NTC смесей для аликвоты 384-а планшеты для анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка исходного пластины из Pr / Pb разработки фондовых смесей займет менее 1 ч. Каждый источник 96-луночный планшет достаточно, чтобы сделать шесть Планшеты 384-а (рис 3в).- Vortex и кратко центрифуги Pr / Pb установлено рабочие запасы и NTC производственные запасы смесей.
- Поместите новый 96-луночный планшет в охлажденном блока 96-луночный охлаждения и обозначают лунки для каждого набора Pr / Pb или NTC смешать лунки получают (рисунок 2).
- Добавьте воду в 96-луночный планшет с использованием 250 мкл электронный многоканальную пипетку: Разлить 66 мкл воды к каждому Pr / Pb установлено также (за исключением 4 скважин для целевых 17). Не включать 82,5 мкл воды к 4 Задача 17 скважин. Отказаться от 27,5 мкл воды к каждому NTC хорошо перемешать. Добавить правильно Pr / Pb установлено производственные запасы в назначенные лунки 96-луночного планшета: Отказаться 54 мкл правильной Pr / Pb установлено производственные запасы в назначенные Pr / Pb установленных скважин (за исключением 4 скважин для целевых 17). Отказаться от 67,5 мкл Задача 17 Pr / Pb установлено производственные запасы на определенную целевую 17 Pr / Pb установленных скважин. Добавить 22,5 мкл правильной NTC рабочей смеси фондовой назначенным скважин.
- Уплотнение 96-луночный планшет с клейкой уплотнительной пластины и центрифуги в течение 1 мин при 700 мкг, чтобы обеспечить содержимое в нижней части лунки.
- Поместите 96-луночный планшет в вихревом смесителе с помощью адаптера пластины 96-луночного и перемешивают в течение 1 мин при 1000 оборотах в минуту. Центрифуга 96-луночный планшет в течение 5 мин при 700 х г.
- Хранить исходный 96-луночного планшета в темноте при 4 ° С при использовании в тот же день, в противном случае хранить при -20 ° С до использования.
- Подготовьте 384-а Планшеты, добавив Pr / Pb наборы с помощью автоматизированной многоканальной пипетки.
Примечание: Получение шесть пластин из анализа исходного 96-луночного планшета займет 3-4 ч.- До принятия пластины, предварительно охладить охлаждения гнездо до 4 ° С и предварительно нагреть пластинчатый испаритель на 125 ° С и нижний нагревательный блок до 80 ° С с воздушным потоком пенообразующих 20-25 литров в минуту (LPM).
- Включите автоматизированной многоканальной пипетки и открыть протокол для создания ИФН Планшеты, дважды щелкнув значок программного обеспечения.
- Для установки платформы, поместите полностью полный пипетки наконечник окно в положении платформы 1, источник 96-луночный планшет в положении 4, и новый 384-луночный планшет в положении 6. Начните бег, нажав кнопку воспроизведения.
ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения пробега, в каждую лунку будет содержать 5 мкл Pr / Pb смеси.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная сумма одноцепочечной ДНК добавляли в каждую лунку 384-луночного планшета для анализа составляет 0,025 мкг. - Осторожно нажмите на планшет для анализа 384-а на плоской поверхности, чтобы обеспечить жидкости в нижней части лунки и применять клейплита печать.
- Центрифуга пластины в течение 1 мин при 700 х г. Удалите клейкую пластину уплотнения, поместите 384-а планшет для анализа в пластине сушилки и установите коллектор 384-а прямо над скважин.
- Когда содержимое 384-а планшет для анализа в высохнет, нанесите новый наклейке печать, завернуть в фольгу, этикетки, и хранить в темном месте при температуре 4 ° С до использования.
Примечание: Пластины можно хранить при температуре 4 ° С в течение по меньшей мере 6 месяцев. - Повторите шаги 3.2.3-3.2.6 до 6 х 384-и аналитические планшеты не получают или жидкости в исходном 96-луночного планшета будет исчерпан.
- Выключите охлаждения гнездо, закройте программу и выключить автоматическую многоканальной пипетки. Выключите пластину фен.
4. Погрузка и запуск 384-а планшет для анализа
- Подготовьте два гена домашнего хозяйства (HKG) и смеси, которые состоят из множества Pr / Pb для HKG, оцДНК, Master Mix ПЦР, и воды, которые будут добавлены к высушенной 384-луночный планшет для анализа (
- Этикетка 1,5 мл пробирку для каждого HKG смеси.
- Развести 2 мкл оцДНК (10 мг / мл) с 84,9 мкл воды. Добавить 2 мкл разбавленного одноцепочечной ДНК, 11,8 мкл воды, 23 мкл смеси мастер-микс, и 9,2 мкл правильной 20x HKG Pr / Pr, установленной в каждую пробирку, вихревые, и кратко центрифуге.
- Использование глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) и убиквитин C (РТМ) в качестве HKG для человеческого анализа (см Материалы таблицу). Используйте GAPDH и 18S рибосомальной РНК в качестве HKG для резус-анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: HKG используется для выполнения анализа являются гибкими и отражать гены, подходящие для типа клеток проходит испытания GAPDH, UBC, и 18S примеры наиболее часто используемых HKG;. Другое HKG может быть более подходящим.
- Подготовка образца и positiве контролировать и смесей, которые состоят из образца или положительной контрольной кДНК, мастер-смеси и воды, которые будут добавлены к высушенной 384-луночный планшет для анализа. Подготовка образца и положительные смеси контроля в достаточном количестве, чтобы обойтись в 21 лунок планшета (рисунок и 3D).
- До синтеза кДНК, следуйте инструкциям производителя, чтобы подготовить образцы РНК с шагом ДНКазы пищеварения.
- Подготовка образцов и положительный контроль заранее от синтеза кДНК по меньшей мере 500 нг РНК, с последующей обработкой РНКазой Н (конечного объема 24 мкл каждого образца) в соответствии с инструкциями изготовителя. Хранить готовую кДНК при температуре -20 ° С до использования. Оттепель, вихревые, и кратко центрифуги образца кДНК.
- Добавить 78,8 мкл основной смеси и 54,8 мкл воды к каждому образцу 24 мкл и положительной трубки управления.
- Vortex и кратко центрифуге трубки.
- Подготовка стандартов и NTC хорошо смешивается, Консостоящей из мастер-смеси и воды, которые будут добавлены к высушенной 384-луночный планшет для анализа (фиг 3D). Для стандарты хорошо перемешать, добавить 165 мкл воды до 275 мкл смеси мастер-микс в 1,5 мл трубки. Для NTC хорошо перемешать, добавить 52,5 мкл воды до 52,5 мкл мастер смеси в 1,5 мл трубки. Vortex и кратко центрифуге трубки.
- Подготовка сухого анализа пластину 384-а для загрузки смесей и образцов.
- Удаление высушенного 384-луночный планшет для анализа от 4 ° С и центрифугируют в течение 1 мин при 700 х г.
- Поместите пластину на охлажденной блока 384-а охлаждения, снимите клейкую пластину уплотнения и наметить лунки планшета для обозначения, где различные смеси и образцы будут пипеткой (рис 1).
- Загрузите 384-а планшет для анализа со стандартным хорошо перемешать, стандартов, NTC хорошо перемешать, образцы, положительный контроль и HKG смесь (рис 3e). Вихревые и кратко центрифуги все решения перед нанесением на пластину,
- Отказаться 6 мкл стандартов хорошо перемешать, чтобы каждого стандартного скважины с 30 мкл электронной многоканальной пипетки. Не включать 1,5 мкл правильного стандартного серийного разведения, чтобы хорошо обозначена с 12,5 мкл электронной многоканальной пипетки.
- Отказаться от 7,5 мкл NTC хорошо перемешать, чтобы каждый NTC также с 30 мкл электронной многоканальной пипетки. Отказаться от 7,5 мкл образца в назначенные скважин с 30 мкл электронной многоканальной пипетки. Отказаться от 2,5 мкл HKG Pr / Pb смешивает назначенным скважин с 12,5 мкл электронной многоканальной пипетки.
- Заполните все пустые лунки 7,5 мкл остатков воды и мастер микс смеси с 30 мкл электронный многоканальной пипетки; 7,5 мкл воды одна также будет работать.
- Уплотнение 384-луночный планшет для анализа с оптической клейкой пленкой и центрифуги в течение 1 мин при 700 х г. Vortex запечатанный 384-луночный планшет в вихревом смесителе в течение 2 мин при 2600 оборотов в минутуи центрифуги в течение 5 мин при 700 х г.
- Поместите запечатанный планшет для анализа 384-а в машине Qrt-PCR, откройте шаблон для макета анализа и начать бег.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты могут быть экспортированы в виде электронной таблицы или в виде текстового файла для анализа. - Используйте следующие оптимальный тепловой режим реакции циклер для анализа: I) 50 ° C в течение 2 мин, б) 95 ° С в течение 10 мин, III) 95 ° С в течение 25 с, IV) 59 ° С в течение 1 мин. Повторите шаги III и IV в течение 40 циклов.
- Экспорт необработанных данных с платформы Qrt-ПЦР в редакторе электронных таблиц приложения. Участок каждый 4-балльной стандартный набор, как стандартной кривой соблюдать линейность. Выполнить анализ путем расчета ΔCq или числа копий на основе четырех точечных стандартных кривых 27.
См рисунке 3
Representative Results
Qrt-ПЦР описана могут быть реализованы для анализа экспрессии образцы типов I и III, IFN в различных типах клеток и контекстов. Например, человеческий тип I и III, IFN подписи экспрессии были проанализированы в мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от 6 доноров, стимулированных TLR лигандов; поли I: С (25 мкг / мл), LPS (10 нг / мл), Имиквимод (10 мкМ), и CpG олигонуклеотиды (1 мкМ) (Фигура 4). Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения электронных таблиц и представлены в виде радиолокационных карт с IFN-α подтипов, расположенных по часовой стрелке в соответствии с филогенетического древа их последовательности белка 27. Радарные диаграммы человеческого выражения IFN представлены в логарифмической шкале, рассчитанной с использованием двух различных методов анализа включены в проект анализа: Абсолютное значение Cq нормированы на HKG (ΔCq), и число копий шаблона на микрограмм (мкг) общей РНК , Копирование числовые значения рассчитываются исходя из результатов O Стандартная кривая FA Стенограмма годов. Данные показывают, что IFN подписи человеческое выражение вызываемые агонистов TLR являются лиганд специфичны.
Рисунок 4
Как показано сигнатур экспрессии IFN человека, выражение подписи типов I и III IFN у макак-резусов были также TLR лиганд специфичны. РВМС от 3 доноров, стимулированных поли I: С (50 мкг / мл), LPS (10 мкг / мл), и Имиквимод (10 мкг / мл) в течение 3 ч (фиг.5). IFN подтипа выражение в стимулированных клеток на исходном этапе было низким. Были высказаны ограниченное количество IFN-подтипов в ответ на ЛПС и поли I: C. В отличие от этого, ИФН экспрессии в ответ на Имиквимод была высокой, и выражение подтипа был широким. Выражение IFN-β и IFN-λ1 была усилена все три TLR агонистов 28.
См рисунке 5
всегда ">
Рисунок 1:. Макет для 384-и анализа пластины с семнадцати множеств Pr / Pb Задача номер относится к набору Pr / Pb. Четыре точки стандартные кривые (темно-серый треугольник) добавляются в столбцы 1-5. Наборы HKG Pr / Pb (белый фон) добавляются в столбцы 6 и 7. Остальные столбцы, 8-24, являются специфичными для одной из семнадцати множеств Pr / Pb. Образцы добавляются к строкам AP, из столбцов 6-24 (черные стрелки). Двух скважин (O5, P5) в нижней части колонны 5 получить только воду и мастер-микс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2:. Макет для исходного 96-луночного планшета с семнадцати множеств Pr / Pb Задание № относится к Pr / Pbустановлен. Черные стрелки обозначают, когда множество Pr / Pb добавляют несколько скважин. NTC смеси добавляются назначенных скважин (темно-серый фон). Двух скважин (F3, G3) с диагональными линиями не используются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Схема конкретных шагов в протоколе анализа Qrt-PCR AE схема выбора части протокола.. (А) Стадия 1: Получение стандартных серийных разведений. (B) Шаг 2: Подготовка Pr / Pb и NTC работы фондовых смесей. (C) Шаг 3.1: Подготовка 96-и рабочей запасов пластины множеств Pr / Pb и NTC смесей. (D) Шаг 4.1-3: Подготовка смеси для загрузки 384-а планшет для анализа. (Стандартное Восточное ВремяEP 4.5: Загрузка 384-а планшет для анализа. Схемы читаются из верхнего левого угла в нижний правый угол. Реагенты для интерферона (IFN) анализа хранили при -20 ° С и перечислены в левой колонке; линии отдельные действия в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: человеческие подписи выражение ИФН в мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) отличается в соответствии с лигандами TLR, используемых для стимуляции РВМС стимулировали TLR лигандов и РНК собирали для анализа Qrt-ПЦР.. Геометрические средства пиковых ответов на поли I: C (25 мкг / мл) в 8 ч (красные квадраты), LPS (10 нг / мл) при 4 ч (зеленые треугольники), Имиквимод (10 мкМ) в 16 ч ( фиолетовый ромбы), CpG (1 мкМ) в16 ч (черные кружки), и нестимулированных контроль на 16 ч (синие кружки) от 6 доноров представлены в журнале 10 масштабе в зависимости от экспрессии HKG UBC ΔCq (слева) или как числа копий на мкг РНК (справа) , IFN-α подтипы, упорядоченных по филогенетического участка сходства аминокислотной последовательности. Эта цифра была первоначально опубликована в иммунологии и клеточной биологии 27.
Рис. 5: резус макаки ИФН выражение подписи в мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) отличается в соответствии с лигандами TLR, используемых для стимуляции РВМС от трех макак-резусов (обозначенный на квадратный, алмаз, и треугольник) были выделены из цельной крови и стимулировали с липополисахарида (LPS) (10 мкг / мл), поли I: С (50 мкг / мл) или Имиквимод (10 мкг / мл). Клетки собирали на 0 ч (УПМРп формы) или после 3 часов от TLR стимуляции (закрытых форм) для измерения выражения IFN. Уровни транскрипции типа I, II, и III IFN отображаются в журнале 10 масштабе в зависимости от выражения HKG GAPDH ΔCq (слева) или как число копий / мкг РНК (справа). Эта цифра была первоначально опубликована в журнале интерферона и цитокинов исследований 28.
Таблица 1:. Человек IFN грунт / зонд набор последовательности и реакции информации Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой таблице.
Таблица 2:. Макаки-резус IFN грунт / зонд набор последовательности и реакции информации Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой таблице.
| Концентрация плазмиды (FM) | ||||
| В | C | D | ||
| IFN-α1 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α2 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α4 | 2500 | 250 | 25 | 2,5 |
| IFN-α5 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α6 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α7 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α8 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α10 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α14 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α16 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α17 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α21 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-λ1 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-λ2 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-λ3 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| ИФН-β | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-ω | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
Таблица 3: Стандартный набор разбавления информация концентрация.
| IFN Pr / Pb Наборы добавил | Объем воды добавляется (мл) | |
| NTC 1 | IFN-β, -ω, -λ3 | 85,7 |
| NTC 2 | IFN-α1, -α5 | 100,0 |
| NTC 3 | IFN-α2 | 114,3 |
| NTC 4 | IFN-α4 | 114,3 |
| NTC 5 | IFN-α7 | 114,3 |
| NTC 6 | IFN-α6, -α8, -α10 | 85,7 |
| NTC 7 | IFN-α14, -α16 | 100,0 |
| NTC 8 | IFN-α17 | 114,3 |
| NTC 9 | IFN-α21, -λ1 | 100,0 |
| NTC 10 | IFN-λ2 | 114,3 |
Таблица 4: NTC работает фондовый смешивает информацию.
Discussion
Этот отчет описывает дизайн, серийное производство, и подход к анализу анализе для измерения транскрипцию набора четко подобных генов в условиях научно-исследовательской лаборатории. Высокой пропускной Qrt-ПЦР-анализ сообщили здесь измеряет ИФН и - λ подтипы с высокой специфичностью. Этот метод включает в себя два ключевых аспекта, дизайн Pr / Pb наборов, которые являются дискриминационными между членами гомологического семейства генов и развитие производственной платформы для создания надежных и последовательных аналитических планшетов 384-а с предустановленной множеств Pr / Pb. Зонды Qrt-ПЦР включить структурную (МБ) или химических (LNA) подход к повышению их специфику 29. Для двух наборов праймеров в резус-анализа (таблица 2), усиление огнеупорный система мутация (ARMS) была включена в праймера для дальнейшего повышения специфичности 30. Хотя в целом все возможное, чтобы предназначаться экзон-экзон переходов на enhaсть, специфичность реакции Qrt-PCR, это было невозможно, потому что тип I IFN гены не хватает интронов. Таким образом, геномной ДНК будет усилен в ПЦР-реакции, а должен быть снижено путем обработки ДНКазой после экстракции РНК.
Область-мишень для множеств Pr / Pb был ограничен кодирующих областей зрелого пептида для каждой IFN. Из-за сходства высокой последовательности между IFN-α подтипов, в частности зрелого пептида области, иногда было необходимо поставить под угрозу чувствительность, чтобы обеспечить специфичность. Это было особенно в случае с IFN-α17, где зрелый пептид стенограмму имеет только четыре уникальные баз по сравнению с другими IFN-α подтипов. Ориентация IFN-α17 требуется праймеров, которые связывают расшифровку нескольких подтипов, ограничивая специфичность зонда. Как следствие, реакцию ПЦР будет усиливать другие подтипы, чем IFN-α17, тем самым потребляя значительный процент реагентов ПЦР и loweriнг амплитуду сигнала флуоресценции от специфического зонда для IFN-α17. Дополнительной проблемой в отношении разработки чувствительных и конкретные наборы Pr / Pb для очень подобных генов, таких как IFN возможность того, что аннотированные последовательности в базе данных GenBank, не может быть полным или комплексное в момент конструкции. Опять же, это был вызов для IFN-α17, в котором вновь аннотированный последовательности не точно соответствующую версии последовательности в базе данных на момент проектирования. Поэтому при проектировании Pr / Pb наборы для генов, которые не были интенсивно изучал, имеет смысл периодически проверять последнюю аннотированный последовательность гена-мишени. И, наконец, необходимо обеспечить, чтобы множества Pr / Pb не усиливает псевдогенов, которые могут транскрипции, но не переведены.
После разработки множества Pr / Pb, следующей задачей является оптимизация условий ПЦР из семнадцати различных Pr / Pb устанавливает на одном 384-луночного планшета. Стандарты транскрипта важTant в тестировании специфику набора Pr / Pb и стать важным для согласования условий Qrt-ПЦР из множества различных реакций ПЦР. Тестирование набор Pr / Pb по стандартам транскриптов устанавливает свою эффективность и чувствительность; плазмиды, которые выражают очень похожи псевдогенов могут быть необходимы для того, чтобы Pr / Pb установлено выборочно измеряет транскрипцию функционального гена. Стандарты транскриптов также дать количественную средства анализа (количество транскриптов), в дополнение к полуколичественного анализа по отношению к гену домашнего хозяйства (ΔCq).
Роботизированная многоканального пипетирования из исходного 96-луночного планшета в нескольких аналитических планшетов 384-луночных улучшает точность и согласованность результатов между пластин. ДНК спермы лосося (оцДНК) используется в качестве носителя, который стабилизирует и сохраняет наборы Pr / Pb для длительного хранения, так же как и сушки реагенты разливают в пластинах. Сушка пластин также снижает объем реакциинеобходимо для воспроизводимости результатов, которые, в свою очередь, сохраняющий драгоценные образцы и уменьшает применения дорогостоящих реагентов. С помощью этих шагов, партии пластин собраны, которые обеспечивают точность и согласованность в течение более шести месяцев.
После получения пластины, показатели качества управления имеют решающее значение для проверки согласованности партии пластин. С этой целью еще четыре набора стандартов выполняются на тарелке. "5x стандарт" пластина отслеживает производительность и создает набор данных, к которому стандарты отдельная плита сравниваются. В то время как десять 10-кратные разведения каждого стандарта используются при проектировании анализа, космические соображения требуют, чтобы четыре точки используются для стандартной кривой в каждом анализе пластины, и для стандартной пластины 5x. Кроме того, положительный контроль должен быть включен в каждую тарелку, чтобы обеспечить достоверность пластины.
Как правило, это занимает 3-4 ч, чтобы подготовить шесть Планшеты от одного Pr / Pb ст о ч н пластина; это возможно, чтобы подготовить двенадцать плит в один день в научно-исследовательской лаборатории. Поскольку каждый человек IFN подтипа планшету рассматривает семнадцать наборы Pr / Pb и может вместить пятнадцать опытных образцов, в один прекрасный день сборки производит партию пластин с возможностью генерировать до 3060 экспериментальных точек. Исходные данные с платформы Qrt-ПЦР могут быть обработаны и собраны с использованием сценариев программирования в редакторе электронных таблиц приложений для автоматического заполнения шаблона предварительно разработанную анализа. Этот метод минимизирует руки-на ввод данных, тем самым предотвращая ошибки копирования и позволяет исследователю сосредоточиться на анализе данных, а не сборки данных. Как описано здесь, это высокой пропускной QRT-ПЦР-анализ может быть применен для измерения экспрессии интерферона подтипов в образцах человека или макаки-резус и могут быть адаптированы для использования в других видов или гомологичных наборов генов. Гибкость планировки пластины позволяет пользователю изменять грунтовки / зонд наборы адаптировать геныИнтерес к клеткам конкретного типа или модели системы. Этот анализ может быть применен для измерения IFN подписи выражение в модели культуры клеток, изучающих патогенные или в образцах пациента в контексте моделей заболеваний для выяснения сигнальных механизмов, участвующих в иммунной реакции.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана CBER / FDA-NIAID / NIH межведомственное соглашение Yi-AI-6153-01, FDA / СБЕР очной средств, и FDA медицинских контрмер против инициативы. TCT, МНБ, VPM, LMS, и КДК были поддержаны назначения на исследовательскую программу участия в Центре биопрепаратов по оценке и исследованиям в ведении Ок-Ридж Института научного образования на основе соглашения Межведомственной между США зав.отделением энергетики и США пищевых продуктов и медикаментов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
| 2.0 ml Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-channel Electronic Pipette, 15-1250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
| Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
| LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
| LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1,250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
| Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
| Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5 ml Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |
References
- Yan, N., Chen, Z. J.
- Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).
- Baum, A., Garcia-Sastre, A. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).
- Kotenko, S. V., et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature. 4, 69-77 (2003).
- Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics. 84, 331-345 (2004).
- Cheon, H., et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage. The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).
- Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).
- Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).
- Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).
- Huang, J., et al. Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).
- Bidwell, B. N., et al. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape. Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).
- Di Domizio, J., Cao, W. Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases. Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).
- Crow, Y. J., Casanova, J. L. STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy. The New England journal of medicine. , (2014).
- Bermel, R. A., Rudick, R. A. Interferon-beta treatment for multiple sclerosis. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).
- Kingham, J. G., et al. Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon. Gut. 19, 91-94 (1978).
- Heathcote, J., Main, J.
- Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection. Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).
- Castaigne, S., et al. Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia. Cancer. 57, 1681-1684 (1986).
- Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia. The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).
- Dai, C., et al. Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure. Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).
- Maeda, S., et al. Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line. The Journal of biological chemistry. , (2014).
- Xia, C. Q., et al. Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production. Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).
- Hervas-Stubbs, S., et al. Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming. Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).
- Manry, J., et al. Evolutionary genetic dissection of human interferons. The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).
- Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. Diversity and relatedness among the type I interferons. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).
- Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family. PloS one. 4, e4933 (2009).
- Hillyer, P., et al. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).
- Schramm, L. M., et al. High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).
- Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid. Theranostics. 3, 395-408 (2013).
- Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).
