Summary
Transformación biolística es un método utilizado para generar la integración estable de ADN en el genoma de los oportunistas neoformans patógeno Cryptococcus través de la recombinación homóloga. Vamos a demostrar la transformación biolística de una construcción, que tiene el gen que codifica acetato quinasa fusionado a la mCherry etiqueta fluorescente en C. neoformans.
Abstract
El basidiomycete Cryptococcus neoformans, un patógeno oportunista invasivo del sistema nervioso central, es la causa más frecuente de meningitis fúngica en todo el mundo como resultado más de 625.000 muertes al año en todo el mundo. Aunque la electroporación se ha desarrollado para la transformación de los plásmidos en Cryptococcus, sólo entrega biolística proporciona un medio eficaz para transformar ADN lineal que se puede integrar en el genoma por recombinación homóloga.
Acetato ha demostrado ser un importante producto de fermentación durante la infección criptocócica, pero la importancia de esto todavía no se conoce. Una vía bacteriana integrada por los enzimas xilulosa-5-fosfato / fructosa-6-fosfato fosfocetolasa (Xfp) y acetato quinasa (ACK) es una de las tres vías posibles para la producción de acetato en C. neoformans. Aquí, nos demuestran la transformación biolística de una construcción,que tiene el gen que codifica Ack fusionado a la etiqueta fluorescente mCherry, en C. neoformans. Entonces Confirmamos integración de la fusión ACK -mCherry en el locus ACK.
Protocol
NOTA: El esquema general de este protocolo se describe en la Figura 1.
1. C. Preparación neoformans
- Para cada reacción de transformación, creciendo un 2-3 ml O / N cultura de C. neoformans en medio YPD a 30 ° C con agitación a 250 rpm.
- Centrifugar el cultivo O / N durante 5 min a 900 xg a 10 ° C y descartar el sobrenadante.
- Resuspender cada sedimento de células en 300 l de peptona de levadura dextrosa (YPD) medio.
- El uso de perlas de vidrio, extender suavemente 300 l de la suspensión celular lavada sobre agar YPD que contiene 1 M sorbitol.
- Permita que las placas se sequen a temperatura ambiente durante 3-4 horas.
2. Preparación de Oro microportador
- Resuspender 0,25 g de 0,6 micras cuentas de oro en 1 ml de ddH2O, centrifugar durante 1 minuto a 900 xg para sedimentar las cuentas, y eliminar el sobrenadante.
- Resuspender las perlas de oro en 1 ml de etanol al 100%. </ Li>
- Distribuir las cuentas en 4 tubos, 250 l cada uno, y añadir 750 l de etanol al 100%.
- Tienda alícuotas de perlas de oro a 4 ° C.
3. Preparación de ADN
- Preparar discos biolísticos macroportador naranja sumergiéndolas en etanol al 100% utilizando fórceps. Coloque los discos en una gran placa de Petri que contiene drierita secar (asegúrese de que el drierita no toca los discos).
- Una vez seca, presione los discos macroportador en los soportes de disco de plata (previamente limpiada con etanol al 100%).
- Perlas Vortex oro (preparado como en el paso 2) y alícuotas de 12 l en un 1,5 ml tubo de microcentrífuga, un tubo por la transformación.
- Añadir a cada tubo con el fin de: 2 g de ADN (preferiblemente 2 l de 1 mg / l de ADN), 10 l de CaCl2 2,5 M, y base libre de 2 l 1 M espermidina.
- Establecer un control negativo como en el paso 3.4, pero sin ADN.
- Vortex cada tubo y se incuba a temperatura ambiente durante5 min. Golpee suavemente cada tubo de vez en cuando para volver a suspender las cuentas liquidadas durante esta incubación.
- Centrifugar los tubos a 225 g durante 30 segundos para sedimentar las perlas de oro recubiertas de ADN. Retire con cuidado el sobrenadante (con la pipeta o aspiración) y deseche.
- Perlas Resuspender completamente en 600 l de etanol al 100% por lentamente la pipeta hacia arriba y hacia abajo.
- Haga girar los tubos a 225 g durante 30 segundos para sedimentar las perlas sin embalaje. Retirar con cuidado y desechar el sobrenadante.
- Resuspender las perlas de oro recubiertas de ADN en 8 l de etanol al 100% por lentamente pipeteando arriba y abajo.
- Pipetear los perlas de oro recubiertas de ADN en el centro del disco biolístico en un diámetro de 1 cm y dejar secar.
NOTA: Un círculo de oro seca visible en el centro del disco biolística indica que una concentración suficiente de cuentas de oro está presente.
NOTA: Los discos macroportador cargados con perlas de oro recubiertas de ADN ya están listos para su uso con la pistola de genes.
4. OUtilizar la pistola de genes
- Encienda la bomba de vacío.
- Encienda el gas helio girando el mando hacia la izquierda hasta una presión de aproximadamente 2.200 psi se alcanza en el manómetro.
- Encienda la pistola de genes por voltear el interruptor rojo de la izquierda.
- Asegúrese de que los caudales para el vacío y la ventilación se ajustan para el vacío llegará a 28 pulgadas de Hg dentro de 15 seg.
- Asegúrese de que la distancia entre el disco de ruptura y macroportador es aproximadamente 3/8 de pulgada.
- Limpie toda la cámara al lavarlo con etanol.
- Sumerja los discos de ruptura en etanol al 100%. Deje secar sobre una superficie estéril (por ejemplo, placa de Petri).
- Use una llave de torque para aflojar el soporte del disco de ruptura. Inserte un disco de ruptura limpia en el soporte. Atornille el soporte de disco de ruptura en su lugar y apriete con una llave de torsión girando una vez a la derecha.
NOTA: Los discos de ruptura serán reemplazados después de cada sesión. - Sumerja ªpantallas de malla E en etanol al 100%. Deje secar sobre una superficie estéril (por ejemplo, placa de Petri).
- Una vez seco, coloque un filtro de malla lavado de la placa de montaje de plástico blanco. Coloque el lado ADN soporte del disco macroportador abajo en la cámara de disco. Tornillo en la tapa de plata, y coloque la placa de montaje en la ranura superior.
NOTA: se reemplazará la pantalla de malla después de cada sesión. - Colocar una placa de agar YPD que contiene 1 M de sorbitol en la placa inferior.
- Cierre puerta de la cámara y ajustar en su lugar.
- Mantenga pulsado el interruptor rojo medio hasta participar de vacío y permitir que el vacío para llegar a 28 pulgadas de Hg. Una vez que se alcanza el nivel de vacío adecuado, mueva este interruptor en la posición hacia abajo. Cuando esté listo, mantenga pulsado el interruptor rojo de la derecha para disparar. Cuando el disco de ruptura aparece, suelte inmediatamente el botón de disparo y pulse el interruptor rojo medio a la posición central para ventilar la cámara a 0 psi.
- Limpie los desechos disco de ruptura y apague la pistola de genes. Luego, apague el Helium gas girando el mando hacia la derecha, y finalmente, apagar la bomba de vacío.
5. Las células transformadas Chapado
- Permita que las placas de transformación para sentarse a temperatura ambiente durante 4 horas para permitir que las células se recuperen.
- Pipeta 700 l de YPD en el plato. Use un raspador de células para raspar suavemente las células fuera del líquido agar y pipeta en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril. Repita este paso para asegurar que todas las células se han recuperado de la placa.
- Que sedimenten las células a 225 xg durante 30 seg. Retirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado en 500 l de YPD.
- Pipetear 100 l de la suspensión celular sobre el centro de las placas + antibióticos YPD y difundir el uso de cuentas de vidrio.
- Deja placas invertidas a temperatura ambiente durante 3-4 días. Como aparecen colonias, parche sobre nuevo YPD + placas de antibióticos.
6. Aislamiento de ADN genómico para la PCR
NOTA: Esta es una versión modificada utilizando el reactivos de un kit de purificación de ADN (Ver Tabla de Materiales).
- Cultivar un cultivo de 5 ml de cada uno de la C. neoformans transformantes en líquido YPD a 30 ° C con agitación a 250 rpm O / N.
- Pellet 3 ml de células a 900 xg, y resuspender en 600 l de solución de lisis núcleos.
- Añadir la suspensión a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 200 l de ácido 0,5 mm se lavó perlas de vidrio.
- Homogeneizar durante 45 seg en un mini BeadBeater a temperatura ambiente, el tubo de enfriar en hielo, y repetir.
- Permita que la muestra se asiente en hielo durante 2 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. Añadir 200 l de solución de precipitación de proteína a cada tubo, (100 l por cada 600 l de sobrenadante recuperado) y agitar vigorosamente durante 20 seg.
- Dejar que las muestras se asienten en hielo durante 5 min, y se centrifuga a 11.000 xg durante 3 min.
- Transferir el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml limpio que contiene 300 l de RT isopropanol. Mezclar suavemente por inversión.
- Centrifugar las muestras a 11.000 xg durante 2 minutos, retire con cuidado el sobrenadante, y drenan los tubos sobre toallas de papel.
- Añadir 300 l de RT 70% de etanol a cada tubo, y invertir suavemente para lavar el pellet.
- Centrifugar las muestras a 11.000 xg durante 2 minutos, y retirar con cuidado todo el etanol.
- Vacíe el tubo sobre toallas de papel limpias, y permitir que el precipitado se seque al aire durante 10-15 min.
- Añadir 50 l de solución de rehidratación de ADN y 1,5 l de solución de RNasa a cada sedimento y vórtice.
- Centrifugar las muestras durante 5 segundos para eliminar todo el líquido de la tapa.
- Incubar las muestras a 37 ° C durante 15 min.
- Rehidratar el ADN mediante la incubación de las muestras a 65 ° C durante 1 hr.
- Cuantificar ADN espectrofotométricamente midiendo la absorbancia a 260 nm (260 A una lectura de 1,0 es equivalente a ~ 50 g / ADN de doble hebra ml), y usar hasta 200 ng en cada reacción PCR.
7. Aislamiento de ARN paraPCR con transcriptasa inversa.
- El uso de un kit de purificación de ARN (Ver Tabla de Materiales), siga las instrucciones del fabricante para aislar ARN a partir de células de levadura utilizando un minibeadbeater.
- Cuantificar la concentración del ARN midiendo la absorbancia a 260 nm (260 A una lectura de 1,0 es equivalente a ~ 40 mg / ml de ARN monocatenario).
- El uso de un kit de RT-PCR (Ver Tabla de Materiales), siga las instrucciones del fabricante para configurar las reacciones de RT-PCR con aproximadamente 1 g de ARN. Para los resultados obtenidos en este estudio, el uso de los cebadores listados en la Tabla 1.
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Representative Results
Una transformación biolística exitosa de C. neoformans se pueden obtener siguiendo este esquema de protocolo (Figura 1). Con la transformación biolística, una sesión con éxito de las perlas de oro recubiertas se indica mediante un anillo de oro visible en la placa después de la DNA es disparo (Figura 2A). Las colonias deben aparecer dentro de 4 a 5 días cuando se deja a temperatura ambiente después de la siembra las células recuperadas de las placas de sorbitol YPD + 1M en medios selectivos. La transformación de 2 g de ADN debería resultar en 20 a 30 colonias (Figura 2B). Cuando aparecen colonias, deben ser volvieron a sembrar en medios selectivos para colonias individuales.
Las colonias individuales se pueden cultivar en medios de YPD, y ambos ADN y ARN pueden ser aislados de estas células y se analizaron a través de PCR y RT-PCR para confirmar la integración y la expresión apropiada. Si este protocolo se utiliza para la fusión de genes etiquetados, como en este ejemplo, los cebadores necesitarían to recocido dentro de la región de codificación del gen de interés (cebador 2) y dentro de la región no codificante 3 'del gen de interés (cebador 4) (Figura 3A). Con esta construcción, el ADN amplificado a partir de la reacción de PCR se secuenció para otra confirmación de que la etiqueta mCherry se fusionó en marco con el gen de ACK. Una confirmación PCR positivo sería un mayor producto de PCR a partir del ADN aislado a partir de las células transformadas en comparación con el ADN aislado de las células de tipo salvaje. También tendría que ser llevado a cabo utilizando el conjunto de cebadores (cebadores 2 y 5) en la que un cebador hibrida fuera de la construcción y en el genoma que rodea (cebador 5) Otra reacción PCR para confirmar la correcta recombinación en el locus deseado (cebador en la Tabla 7 1) (Figura 3B). RT-PCR se utiliza para asegurarse de que tanto el gen de interés y la etiqueta son a la vez que se expresaron (Figura 3C). Secuenciación de la RT-PCR indi producto de fusiónca que la etiqueta se fusiona correctamente al gen a nivel del ARN.
Si se utiliza este protocolo para noquear a un gen de interés, conjuntos de cebadores para PCR deberían estar diseñados de tal manera que un cebador hibrida con una secuencia del genoma fuera de donde la construcción debe recombinarse en el genoma, y el otro cebador hibrida ya sea en la región de codificación del gen o en el marcador selectivo. Una confirmación positiva de que el constructo se ha recombinado con éxito y correctamente en el genoma sería la presencia del producto de tamaño correcto para el conjunto de cebadores que se hibrida en el marcador, pero no con el conjunto de cebadores que hibrida con el gen de interés. Otro conjunto de cebadores debe ser hecho que tiene un cebador que hibrida fuera de la construcción diseñada, que se utiliza con PCR para confirmar que el evento de recombinación tuvo lugar en el locus correcto. En el mismo diseño para crear un knockout, el ARN se aísla a partir tanto de las células transformadas y las células de tipo salvaje (WT), y RT-PCR es realizado para confirmar que no expresión del gen de interés se observó a partir de las células transformadas.
Debido a una etiqueta fluorescente se fusiona con el gen ACK, otra confirmación de que la recombinación fue un éxito en el locus deseado y que el ARN se traduce en proteína es a través de microscopía de fluorescencia (Figura 4). Idealmente, ya se han establecido condiciones en las que se sabe que la proteína de interés se expresa. Sin embargo, si la señal fluorescente es demasiado baja para observar, existe la posibilidad de que todavía se produjo recombinación exitosa, pero las condiciones de crecimiento necesita ser alterado en la posibilidad de que no se han cumplido las condiciones óptimas para la expresión suficiente, lo que conduciría a una baja fluorescente señal. Esto tendría que ser confirmado a través de otros métodos tales como Western blot.
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Figura 1. Esquema Protocolo.
La Figura 2A. Perlas de oro recubiertas de ADN dispararon con éxito sobre una placa de YPD + sorbitol 1 M. Un parche naranja que se observa en el centro de la placa de YPD + sorbitol 1 M se debe a las perlas de oro recubiertas de ADN, lo que indica la preparación de oro adecuada, así como una sesión de éxito . Figura 2B. Transformando 2 g de resultados de ADN en 20-30 colonias por placa. Si se diluyeron las células como se mencionó en el protocolo, se espera que antes de la siembra en medios selectivos de aproximadamente 20 a 30 colonias. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3A. Esquema de la ACK: mCherry:.. Constructo Neo y el diseño del cebador Figura 3B PCR utilizados para confirmar la recombinación homóloga exitosa. Los carriles 1 y 2: productos de PCR obtenidos usando los cebadores 2 y 5 (Tabla 1) con el ADN genómico de tipo silvestre C. neoformans H99 (carril 1) y el ACK: cepa mCherry transformado, (carril 2). Tamaños esperados son 1511 y 5622 pb, respectivamente. Los carriles 3 y 4 son los productos de ADN de la C. neoformans H99 (tamaño esperado 1443 pb) y el ACK: mCherry (tamaño esperado de 5552 pb) de las cepas, respectivamente, usando los cebadores 2 y 4 en la Tabla 1. Los carriles 5 y 6 son los productos de ADN de la C. neoformans H99 (no debe recocer) y ACK: mCherry (tamaño de 3016 pb esperados) cepas, respectivamente, usando los cebadores 1 y 3. La Figura 3C RT-PCR de la expresión de la confirmación de la etiqueta mCherry.. Los mejores carriles son los productos de ADNc del producto ACKmCherry de fusión (tamaño esperado 683 pb) amplificado a partir de la C. neoformansH99 y el ACK:. MCherry cepas usando los cebadores 2 y 3 en la Tabla 1 El gen de la actina se incluyó como control y se amplificó en las mismas condiciones como ACKmCherry (tamaño esperado 567 pb) utilizando los cebadores 6 y 7 en la Tabla 1. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. fluorescencia de la mCherry etiquetada Ack. El análisis microscópico de cepas productoras Ack fusionado con una etiqueta mCherry con un óptimo de excitación a 587 nm y una óptima emisión a 610 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 1 | KI003 | 5 '- GCG GTA AGG TCT GGA AGC CAC - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'-AAC GCT TTG CCG GGT ACT ACC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'-GAC AGC TTC AAG TAG TCG GGG -3 ' |
| 4 | KI004 | 5 '- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | Actina 1 | 5'-CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC -3 ' |
| 7 | Actina 2 | 5'-CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3 ' |
Tabla 1. PCR y RT-PCR primers.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los premios de la Fundación Nacional de Ciencia (Premio # 0920274) y el Experimento de Carolina del Sur Estación Proyecto SC-1700340. Este papel isTechnical Contribución No. 6283 de la Estación Experimental de la Universidad de Clemson. Los autores agradecen al Dr. Lukasz Kozubowski por su útil asesoramiento en el desarrollo de este protocolo final y el Dr. Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, y Grace Kisirkoi por su lectura crítica del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
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