Abstract
Alkol kullanım bozukluğu (AKB) ciddi bir sağlık sorundur. TL büyük bir kalıtsal bileşeni olmasına rağmen, birkaç gen açıkça etiolojilerine implike edilmiştir. meyve sineği Drosophila melanogaster, alkolle ilişkili davranışları altında yatan moleküler genetik mekanizmaları keşfetmek için güçlü bir modeldir ve bu nedenle belirlenmesi ve TL etkileyen genlerin fonksiyonunu anlamak için büyük umut vaat ediyor. çalışmaların bu tür Drosophila modelinin kullanılması güvenilir etanol davranışsal tepkilerini ölçmek tahlillerin bulunmasına bağlıdır. Bu rapor sinekler etanol duyarlılığı ve hızlı tolerans değerlendirmek için uygun bir deneyi anlatır. Bu deneyde ölçüldüğü Etanol duyarlılık sinekler testten hemen önce gıda olmadan muhafaza edilir seviyesi ve kullanılan etanol konsantrasyonu, daha önce bildirilen genetik manipülasyonlar, bir dizi ve zamanın da uzunluğu ile etkilenir. Bunun aksine, etanol sBu deneyde ölçüldüğü ensitivity uçucu işleme, sinekler cinsiyeti ve antibiyotik veya canlı maya büyüme ortamı takviyesi gücü etkilenmez. Nicelleştirme etanol hassasiyeti için üç farklı yöntem esas itibarı ile ayırt etanol duyarlılık sonucu yol açıklanmıştır. genel sadeliği ile birlikte bu testin ölçeklenebilir yapısı, ve nispeten düşük gider set-up Drosophila etanol duyarlılığı ve hızlı hoşgörü küçük ve büyük ölçekli genetik analiz için uygun hale getirmek için.
Introduction
Alkol kullanım bozukluğu (AKB) dünya çapında (1 gözden) büyük bir sağlık sorunudur. AUD gelişimini sürüş mekanizmaları karmaşık olmasına rağmen, bu bozukluklar önemli bir genetik bileşeni var (örneğin, 2). AUD ve korunmuş davranışsal tepkilerin büyük kalıtım daha moleküler temelini anlamaya yönelik etanol ilgili davranışlar belirli genleri araştırmak için genetik model organizmalar kullanarak güçlü bir ilgi yarattı (3,4 gözden) birçok türler arasında etanole AUD. meyve sineği Drosophila melanogaster, (3,4 gözden) etanol ile ilgili davranışlar moleküler genetik mekanizmaları keşfetmek için bir lider model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Sinekler Çalışmaları (5 gözden) etanol davranışsal tepkilerin çeşitli sinyal yolları için roller sermiştir. Ilginç genlerin ve yolların bazı davranışsal RESPONS etkilediğisinekler etanol için es de kemirgen etanol ilgili davranışlar ve / veya insan AUD (örneğin, 6-14) suçlanmıştır. Drosophila modeli sisteminde mevcut genetik araçları paketi ile birleştiğinde türler arasında etanol ilgili davranışları, sürüş mekanizmalarının korunması, etanol davranışsal tepkilerin genetik araştırmak için meyve sineği modelinin programı altını çiziyor.
Hassasiyet 15,16 ve insanlarda etanol (17 gözden) tolerans AUD gelişimine bağlıdır. Etanol bu davranışsal tepkilerin her ikisi de (3,4 gözden) laboratuar deneyleri çeşitli yoluyla sinekler örnek alınabilir. Yazarlar tarafından bilinen uçucu deneylerinin her etanol sakinleştirici ya da zamana-bağlı etanol kaynaklı sedasyon / koordinasyon bozukluğu veya zamana bağımlı geri dayanmaktadır.
Etanol duyarlılık ve r genetiği bizim gruptan bir önceki makaledeDrosophila apid toleransı, sineklerin etanol buharı kaynaklı sedasyon dayalı bir davranış tahlil 18 kullanılmıştır. Bu tahlilde Test canlı yetişkin aktararak başlatılan selüloz asetat fişinin üst (yani olmayan sinek tarafı) etanol ilave bir selüloz asetat fişi ile şişeler içinde sinekler yakalama, gıda şişeleri boşaltmak için anestezi olmadan uçar, ve Bir silikon tıpa ile sinekler, selüloz asetat fişi ve etanol içeren flakon sızdırmazlık (18 referans, Şekil S3 şematik bakınız). Sinekler farklı grupları temsil Çok sayıdaki vial, bu tahlilin arttırarak, paralel olarak değerlendirildi. Şişeler anonim kod verildi ve deneyci sedasyon değerlendirilmesinde istenmeyen önyargı önlemek için tedavi grubuna kör edildi. Standart bir deneyde, şişeler içinde, 30 saniyelik bir geri alındıktan sonra her şişeye sedasyon sinekler sayısı sayılmış ve Converte edildi, 6 dakika aralıklarla yavaşça akıtıldı, daha edildi ve sineklerYüzde aktif sinekler d. Sinekler iç etanol 18 ve sedasyon (bu raporda cf referans 18 ve Şekil 1A ve 1B) ilerici artışa neden bir zaman-bağımlı bir şekilde selüloz asetat prizinden etanol buharı absorbe. Bu tahlilde Sedasyon operasyonel yürüyüş veya (ii) veya kanatlarını çırparak olmadan sırtlarında yatan yokluğunda sinekler (i) ayakta olarak tanımlandı. Burada, bu etanol sedasyon deney ayrıntılı olarak tarif edilmiştir, bunu kullanarak ilgili daha fazla işlevsel optimizasyonu sağlanır ve deney uçucu sedasyon duyarlılık gıda takviyesi seçenekleri katkı adreslemek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tahlil önce 1. Gün
- Kısa (1-5 dk) CO 2 altında 11 (tek seks) gruplar halinde taze gıda şişeleri içine sinekler toplayın.
- Sinekler, çevre şartları kontrol alanı gıda şişeler içinde (tipik olarak 25 ° C,% 60 nispi nem, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü) O / N kurtarmak için izin verin.
- Planlanan deney için uygun nihai konsantrasyon (lar) saflaştırılarak (≥18 MΩ) su içinde (% 100), etanol seyrelterek etanol çözeltisi (ler) hazırlayın. Çözüm (ler) RT O / N dönmek için izin verin.
Not: etanol seyreltilmesi ekzotermiktir.
Deney 2. Gün
- Sineklerin her flakon test edilebilmesi için, temiz, boş gıda flakon (i) hazırlamak; yani, test şişe, (ii), yeni bir selüloz asetat fiş, (iii) silikon durdurucu ve (iv) etanol çözeltisi (bakınız Tablo 3), 1 mi.
- 55-65% 20-25 ° C sıcaklık ve bağıl nem ayarlayarak test odası hazırlayın.
- Başka bir işçi varflakon her grup için benzersiz bir kod atamak ve sonrası için kod kaydedin. Bir kaç dakika ACCLIMATE test odasında sinekler ile kodlanmış şişeleri yerleştirin.
- 2.3 den sinek şişeleri kodları maç boş test şişeleri etiketleyin.
- Tablo 1 benzer bir elektronik sütunların içine kodları (tek sütun / şişe) girerek sert bir kopya test günlüğü oluşturun.
- Bir kılavuz olarak test günlüğünü kullanarak, test odasında dizileri eşleşen içine sinek ve boş şişeleri test ile kodlanmış gıda şişeleri düzenlemek.
Not: sınamak için flakon makul sayısı 24 olan (yani, 4 flakon her 6 setleri). - Aktarım eşleşti / etiketli boş test şişeleri içine gıda şişeleri uçar ve selüloz asetat fişler flakon üstleri altında 2 cm kadar hemen test şişeleri içine selüloz asetat fişlerini takın.
- Bundan sonra, sendeleyerek 1 dakika aralıklarla bir dizi olarak dört flakon her satırı ele.
- Zaman 0 değerlendirme için, ayrı ayrı w her şişeyi kavramaki başparmak ve işaret parmağı, şişenin dibine vurmak sinekler 30 saniye bekleyin ve sonra ölü / hareketsiz olan sinekler sayısını saymak için masaya hafifçe üç kez dokunun. Zaman basılı test günlüğüne 0 dakika, her flakon için hareketsiz / ölü sinekler numarasını kaydedin.
- Zamanlayıcı 0 zamanında sürekli olarak saymaya başlar ve hemen ardından 4 şişeleri birinci satır / grubu için, ampuller içindeki selüloz asetat fişleri etanol, 1 ml ilave başlar. Bu test edilecektir amacıyla 5 saniye aralıklarla şişeler içinde selüloz asetat fişleri etanol 1 ml ilave edilir. Etanol selüloz asetat fişleri boyunca eşit emilir ve böylece bir dairesel hareketlerle selüloz asetat fişleri etanol ekleyin. Etanol kümesindeki tüm 4 test şişelerine eklendi, bunu kapatmak için her bir tüp içinde bir silikon fiş yerleştirin.
- Kez 1, 2, 3, 4 ve 5 dakika içinde, sırasıyla, 4 şişeleri ikinci, üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı kümelerine etanol 1 ml. Sonra silikon tapalar ekleyerek devam4 şişelere her bir grubu için etanol ilave edilmesi.
- Süresi 6 dk, başparmak ve işaret parmağı ile her flakon açgözlü şişenin dibine sinekler devirmek için masaya hafifçe üç kez dokunarak, 30 sn bekledikten sonra sayma ve toplam sayısını kaydederek 4 flakon ilk seti testi sedasyon olan sinekler. Skor onlar (i) şişenin yere durmak fakat ya kanatlarını çırparak olmadan sırtlarında yürümek veya (ii) yalan yoksa sedasyon gibi uçar.
- Tablo 2'de zamanlama ile 5 sn aralıklarla kümesi içinde her şişeyi tutun.
- Ilk kümesi için yapıldığı gibi kat 7, 8, 9, 10 ve 11 dakika içinde, sırasıyla küçük şişeler, ikinci, üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı kümeleri test edin.
- Süresi 12 dakika içinde 2.12 tarif edildiği gibi, tekrar 4 şişeleri ilk seti test sırasıyla, 13, 14, 15, 16 ve 17 dakikada şişeleri ikinci, üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı kümeleri test etmektedir.
- Tüm sinekler s kadar 2.12 açıklandığı gibi test sinekler Devamedated.
- Basılı test günlüğüne her şişe içinde sinekler toplam sayısını girin. Sineklerin sayısı zaman 0 hareketsiz / ölü sinekler sansür.
- Zaman (x-ekseni) karşı% aktif sinekler (y-ekseni) ve her değerlendirme noktasında yüzde aktif sinekler ve arsa verileri hesaplar. Polinom veya Sigmoidal eğrisi uyan üçüncü sırasından Sedasyon Süresi 50 değerleri (ST50,% 50 sedasyon süresi) interpolating veya eğri altında kalan alan hesaplanarak etanol sedasyon nicelleştirmektedir.
- Çözülmüş şişeleri verileri derlemek ve istatistiksel analizler gerçekleştirmek (örn, tek yönlü ANOVA Bonferroni çoklu karşılaştırma testi ile) deneysel tasarım için uygun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu etanol sedasyon testte elde edilen ham veriler, etanol buhar maruz kalma süresinin bir fonksiyonu olarak sedasyon edilir sinek sayısıdır. Ham veri zamanın bir fonksiyonu olarak yüzde aktif sinekler dönüştürülür (birincil veri 1A Şekil, B, D - F). Eğri uygun birincil veri etanol sedasyon duyarlılık interpolasyon yoluyla, Sedasyon Süresi 50 (ST50) olarak eğri (AUC) altında sedasyon veya aea olmak için sinek% 50 için gerekli zamanı miktarı belirlenebilir. Daha önce (ortalama R 2 = 0,934, n = 24, Şekil 1A) beklendiği gibi Sigmoidal eğrileri birincil biraz daha iyi veri (ortalama R 2 = 0.997, n = 24 sığacak rağmen 18 üncü dereceden polinom eğrileri, iyi birincil veri sığdırmak bildirdi; Şekil 1B). Kıvrım uygunluklarından ST50 değerlerinin belirlenmesinde bir alternatif olarak, birincil veri etanol sedasyon duyarlılığı da alan olarak miktarı belirlenebilireğrisi (AUC,% aktif sinekler zaman x) (Şekil 1 C altında). Miktar tayini Bu üç yöntem netice, birbiriyle çok iyi bir korelasyon (Pearson r2 ≥0.998, n = 24) bağlar ve ST50 (min) ve AUC (aktif,% için zorunlu olarak farklı olsa da, esas olarak ayırt edilemez (Şekil 1C) olan ) x zaman uçar. Vb tüm hesaplamaları ile ilgili Detaylar, kullanılan elektronik tablolar, ilgili yazar temin edebilirsiniz. ST50 (veya AUC) yüksek ve düşük değerler köreltilmiş ve sırasıyla, sedasyon etanol hassasiyeti gelişmiş göstermektedir unutmayın. Bir önceki raporda 18 ile tutarlılık için, üçüncü dereceden polinom eğrisi uyan türetilen ST50 değerleri bu study.Importantly geri kalanı boyunca kullanılan, tahlil SCB içinde Cnx14D (Şekil 1D) ve mutasyonların karşı RNAi etkilerini algılar (Şekil 1E) , aru ve hppy (Şekil 1F),
Bu deneyde, rutin kullanım sırasında, 2 ml etanol ile ıslatılmış selüloz asetat fişleriyle şişelerin çekme selüloz asetat, böylece potansiyel olarak sinekler serbest değişen birkaç ayrı deneyde (gösterilmemiş olan) bazı şişeler tabanları doğru seyahat takılan neden alan ve etanol buharı konsantrasyonu. Buna ek olarak, yaklaşık 0.25 ml etanol ilave olarak sıvı etanol maruz bırakıldı, bu deneylerde uçan olasılığını arttırmaktadır, bileşikler bir etanol ve 2 ml (Şekil 2A) ile ıslatılmıştır zaman selüloz asetat fişlerinin (yani, yan sinek) dibe buharı etanol. SELÜLOZDEN aşağı doğru göç 2 ml 1 ml selüloz asetat fiş etanol hacmi ortadan kaldırılacaktır azaltılmasıkuvvetlice çekme (gösterilmemiş olan) ve aynı zamanda selüloz asetat tamponlarını (Şekil 2A) tabanlarındaki etanol çözeltisi ölçülebilir miktarda ortadan daha sonra tahlil sırasında E asetat fişleri. Sinekler sedasyon da 1 ml (- C Şekil 1A) daha az hacimli kullanılan etanol hacmine hassastır. 1 mL etanol kullanılarak, bu nedenle deney süresince sinekler için sabit bir açık alan muhafaza yardımcı olur ve sıvı etanol sindirildikten değildir sağlar. Sinekler bu nedenle muhtemelen bu tahlilde bir buhar olarak sadece etanol maruz kalmaktadır. (Örneğin,% 85 (hacim / hacim) etanol, 1 ml 'den gelen buhar) ve [A] sinekler ağ eski 1-5 gün, aksi belirtilmediği sürece, burada rapor edilen tüm sonraki çalışmalarda kullanılan,% 85 etanol içinde bir mi.
24 şişeleri ile deneylerde, sinekler deneyci değerlendirmek için izin 6 dakika aralıklarla hafifçe vurdu (yani, içinden döngüsü) makul, reçete çizelgeleme tüm flakonör. Daha az şişeleri 5 dakika aralıkları kullanılarak kontrol sineklerinin ile yapılan çalışmalardan elde ST50s 6 dakika aralıklarla ile yapılan çalışmalardan elde ST50s ile karşılaştırılabilir olmuştur (veriler gösterilmemiştir). Sinekler önce her flakon sineklerin sedasyon statüsünün belirlenmesinde sırayla dört şişelerde bir dizi dokunun deneyci zaman tanımak için dokunduktan sonra sedasyon 30 sn değerlendirilir. Darbe etanol sedasyon hassasiyeti, erkek ve dişi kontrol sinekler ST50 değerleri dokunduktan sonra canlılık ya da kurtarma zamanı dokunarak farklılıklar çok keskin (Sert) normalde (Normal) aday olurken ölçülen veya sanki belirlemek ve standart bir 30 saniye veya daha uzun 60 saniye sonra Kurtarma. Vurma canlılığı (Şekil 2B) ve iyileşme süresi (Şekil 2C), kontrol erkeklerde veya kadınlarda ST50 değerleri üzerinde ölçülebilir bir etkisi vardı.
Antibiyotikler uçucu gıda ortamında bakteri gelişimini baskılamak için kullanılabilir. Antibiyotik ile gıda ortamının takviyesi etanol sedasyon hassasiyetini etkiler olmadığını belirlemek için,ST50 değerleri (tetrasiklin, 20 ug / ml; ampisilin ug / ml kloramfenikol 100, 125 ug / ml) varlığında ya da üç antibiyotik yokluğunda bir kuşak için yetiştirilen sinekler ölçüldü. Bu üç antibiyotik Yetiştirilmesi sinekler etanol sedasyon duyarlılığı (Şekil 2B) üzerinde herhangi bir etkisi vardı.
Sinekler boş gıda aktarılır şişeleri-ve dolayısıyla önceki sedasyon deneyinde etanol buharına maruz kalma için ~ 5 dk-hemen yiyecek ve su yoksun. Zaman sinekler miktarı tahlil etkileri etanol sedasyon hassasiyeti başlatmadan önce boş gıda şişelerde muhafaza olup olmadığını belirlemek için, sinekler 6 saat (normal, en az 70 kat) ve daha sonra ST50 değerleri ölçüldü için hasret. 6 saat açlıktan önemli hem erkek hem de dişi kontrol sineklerinin (Şekil 2E) 'de ST50s azalmıştır. ST50 ile açlık etkisi (bu deneylerde 9-14%) nispeten küçük olmasına rağmen, bu süre SPE uçannd boş şişelerde tahlilde etanol buharına maruz kalma önce bir deney içinde ve aynı zamanda deneyler arasındaki gruplar arasında formasını tutulmalıdır.
Laboratuvar sinek gıda canlı maya ile takviye edilebilir (örn, 18,20,23,24) döl üretimini teşvik etmek. Döl sayısı 20 gün boyunca üretilen, ancak, örneğin, gıda şişeler daha önce ısı ile öldürülmüş, maya ya da hiç canlı maya (D10-d11, beyaz barlar, Şekil 3A karşılaştırın) olanlara göre yetişkin üretilen (Saccharomyces cerevisiae), canlı maya ile desteklenmiş Canlı ve ısıyla öldürülmüş maya (Şekil 3A) ile takviye edilmiş şişeler içinde farksızdı. Maya ürünler üretmekte sinek gıda etanol anlamlı miktarda canlı olmadığını göstermek için, gıda ortamında (i), etanol, sinekler (ii) etanol, ve sinekler (iii) etanol sedasyon duyarlılığı canlı maya etkisi ölçüldü. Gıda ortamı canlı maya içerdiği alt ile desteklenmişIsı ile öldürülmüş ya da maya (Şekil 3B) ile takviye edilmiş gıda ile karşılaştırıldığında etanol kısmi ve genişletilmiş miktarda. Bununla birlikte, kontrol sinekleri, canlı ile takviye edilmiş ortam üzerinde büyütülmüş öldürülmüş ya da maya iç etanol (Şekil 3C) ayırt düşük konsantrasyonları. Ayrıca, etanol sedasyon duyarlılığı ısı ile öldürülmüş veya canlı maya (Şekil 3D) ile takviye edilmiş ortam üzerinde büyütülmüş kontrol sinekler farksızdı.
1. (AC) Sedasyon tahlil veri analizi seçeneklerini Şekil. W kontrol [A] kadın (1118 izojenik w, Bloomington Indiana Drosophila Stok Merkezi stok # 5905)% 85 (hacim / hacim) etanol belirtilen miktarlar buhar maruz bırakıldı. (A) Sedasyon zaman ders veri üçüncü uyması Sipariş polinomları. (B)Sedasyon zaman ders veri Sigmoidal eğrileri ile uyum. Eğri altında (sol Y ekseni) ST50, üçüncü dereceden polinomları interpolasyon değerleri ve Sigmoidal eğrileri veya (sağ Y ekseni) alanı olarak nicelikselleştirilmiştir (C) Etanol sedasyon hassasiyet (AUC,% Aktif sinekler) zaman x. Etanol hacmi, ancak analiz yöntemi, gömülü etanol duyarlılığı (iki yönlü ANOVA; hacim etkisi, p <0.0001; analiz yöntemi, ns etkisi n = 8 / grup; 1/100 dönüştürülmüş EAA veri fark hesaba değerlerin büyüklüğü). (DF) Temsilcisi zaman ders veri. (D) kontrollere (sinir sistemi (elav-Gal4 / v5597) körelmiş etanol duyarlılığı nispetle Cnx14D RNAİ'nin İfade v5597 / + ve elav-Gal4 / + ). (8,128 aru) s cb (scb Vol2) ve Aru (E ve F) Mutasyon gelişmiş etanol sedasyon duyarlılık ve Hppy mutasyon (hppyKG5537) kontrollere göre etanol sedasyon duyarlılığı bulgularıdır. ST50 18 değerleri olarak EF Veri önceden bildirilmiştir.
Sedasyon tayininde operasyonel parametrelerin Şekil 2. değerlendirilmesi. Selüloz asetat fişleri alt 2 mm etanol (A) Tutar. * Bonferroni; etanol hacmi sahte 60 dakika deney (tek-yönlü ANOVA, p <0.0001 sırasında selüloz asetat fişleri alt 2 mm taşındı etanol hacmi üzerinde önemli bir etkisi vardı selüloz asetat fişlerinin üstleri eklendi çoklu karşılaştırma testi, 2 mi v, 0 ve 1 ml, p <0.05, n = 4). Etanol. Selüloz asetat fişler kitlesinde bir değişim olarak niceliksel (B) Ne sineklerin şişeleri dokunarak canlılığı sırasında test (Sert, Normal) ne seks test edilmiştir etkilenen ST50s (iki-way ANOVA; , ns dokunarak etkisi; cinsiyet, ns etkisi; n = 12) (C) Ne dokunarak ne seks ST50s (iki yönlü ANOVA üzerinde önemli etkileri vardı sonra iyileşme süresini;. iyileşme süresi, ns etkisi, cinsiyet, ns etkisi;. antibiyotiklerin n = 6) (D) Eklenmesi büyüme ortamında (ATC ampisilin, tetrasiklin ve kloramfenikol) ST50s üzerinde genel bir etkisi vardı, ama ST50 (iki yönlü ANOVA cinsiyetin bir etkisi vardı; ATC, ns etkisi, cinsiyet, p = 0.001 etkisini; etkileşim , ns;. açlıktan n = 6) (E) etkisi etanol sedasyon duyarlılığına. ST50s normal (FED) beslenen uçar karşılaştırıldığında 6 saat (hasret) için yiyecek ve su yoksun sinekler anlamlı olarak düşüktü; Erkeklerde ve kadınlarda ST50s genel ayırt edilemez (iki yönlü ANOVA; açlık etkisi, p <0.0001; cinsiyet, ns etkisi; n = 12; * Bonferroni çoklu karşılaştırma testleri, erkeklerde ve kadınlarda açlık etkisi, p <0.05) .
Şekil büyüme, etanol içeriği ve sedasyon duyarlılığı canlı maya 3. etkisi. Hiçbir mayası (Resim-Y) ile desteklenmiş gıda ortamı içeren şişelere (A) Yetişkin soyu, ısı öldürülmüş maya (E ölü) veya canlı maya (Canlı Y). Beyaz barlar, gün 10-11 sırasında ortaya çıkan erişkin soyu; gri çubuklar, gün 12-20. Tüm (10-20) gün, p <0.0001;, gün 10-11, p <0.0001; gün 12-20, s = 0.0002; n = 5 Genel, maya tedavisi önemli bir döl üretimi (tek-yönlü ANOVA üzerinde etkisi vardı ). Tüm (10-20) gün boyunca üretilen döl sayısı Killed Y flakonlarından fazlaydı ve Hayır Y (Bonferroni çoklu karşılaştırma testi, p <0.05) daha Y yaşayın. Günlerde 10-11 süresince, Canlı Y flakon Y öldürdü ve Killed Y flakon yok Y fazla döl (beyaz barlar, Bonferroni çoklu karşılaştırma testleri, p <0.05) üretildi daha fazla döl üretti. Gün 12-20 boyunca, wi şişelerth. Y Hayır Y veya Live Y şişeleri daha fazla döl (gri çubuklar, Bonferroni çoklu karşılaştırma testi, p <0.05) üretilen Killed gıda ortamında (B) Etanol No şişelere kıyasla Canlı Y ile desteklenmiş şişeleri anlamlı derecede yüksek olduğu Y ve Y Öldürdü (tek-yönlü ANOVA, p <0.0001, n = 5; Bonferroni çoklu karşılaştırma testi, p <0.05) (C) [A] Dişi sinekler anlamlı maya ile takviyesi etkilenmediği w İç etanol (bir. yollu ANOVA, ns, n = 5-10). B ve C Etanol içeriği açıklanan 18 olarak belirlendi (D) ST50 değerleri anlamlı erkek veya [A] (iki yönlü ANOVA w kadın maya ile büyüme ortamının takviyesi etkilenen değildi;. Maya, ns etkisi; etkisi cinsiyet, ns n = 12).
| Şişe → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Kod → | ||||||||
| Toplam # → | ||||||||
| 0 dakika | ||||||||
| 6 dakika | ||||||||
| 12 dk | ||||||||
| 18 dk | ||||||||
| 24 dak | ||||||||
| 30 dakika | ||||||||
| 36 dk | ||||||||
| 42 dk | ||||||||
| 48 dak | ||||||||
| 54 dakika | ||||||||
| 60 dakika |
Tablo 1: Tipik test günlüğü. Protokol adım 2.5 Bkz.
| Küçük şişe | Musluk | Belirlemek |
| 1 | 6 dak 0 sn | 6 dakika 30 saniyede |
| 2 | 6 dakika 5 saniye | 6 dakika 35 saniye |
| 3 | 6 dak 10 sn | 6 dak 40 sn |
| 4 | 6 dakika 15 saniye | 6 dakika 45 saniye |
Tablo 2:. Tipik vurma ve test programı protokolü adım 2.13 bakın.
| Malzeme / Ekipman Adı | Şirket | Katalog Numarası | Yorumlar / Açıklama |
| Gıda flakon | VWR | 89092-772 | dar |
| Flugs | Genesee / flystuff.com | 49-102 | dar |
| silikon tıpa | Fisher Scientific | 09-704-1l | # 4 |
| etanol | Farmako-Aaper | 111000200 | 200 kanıtı |
Tablo 3: Malzeme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tekrarlanabilir anlamlı fenotipleri ölçmek basit testler davranış analizi için büyük değer taşımaktadır. Burada anlatılan çalışmalar Drosophila etanol sedasyon hassasiyet ve hızlı tolerans ölçmek için bir tahlil birkaç pratik yönlerini ele almaktadır. Bu çalışmanın bir odak rağmen, davranışsal analizler bir çalışma içinde denek için çevre ve genetik arka plan sabit sürdürerek kolaylaştırılmıştır. Ayrıca, karşılaştırma tipik haliyle yetiştirilen ve yan yana test sinekler gruplar arasında yapılmalıdır. Bu amaçla, bu çalışmada ayrı ayrı deneyler içinde tüm sineklerin aynı genetik geçmişe sahip ve düzgün çevre koşulları, standart gıda maddesi ile (25 ° C,% 60 nispi nem, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü) altında yan yana yetiştirilmiştir (10 % besin ortamı açıkça manipüle edildiği bu deneylerin hariç sakroz,% 3.3 mısır unu,% 2 ve% 1 maya ağarı) yerleştirilmiştir.
ethBurada tarif edilen Anole sedasyon deney ucuz ve ticari kaynaklardan (Tablo 3), hali hazırda her biri çok az malzeme (plastik şişeler, selüloz asetat fişleri, silikon Stoper ve etanol), gerektirir. Bu madde, etanol sedasyon tahlili ve (örneğin, 6,20,25-27, kapsamlı 3,28 gözden) daha önce bildirilen yöntemlere göre büyük ölçüde benzer. Bu tahlillerin hepsi, etanol sedasyon duyarlılığı ölçmek için yararlı olmakla birlikte, deney avantajları burada tarif edilen (i) sinekler, (ii) uçan olasılığı azaltılır pamuk ya da diğer malzemeler de dolanabilir tahlilin sırasında sıvı etanol maruz olmamak üzere tahlil sırasında test flakon, (iii) yeteneği paralel sinekler birçok grup test ve (iv) birincil veri setlerinden etanol hassasiyeti objektif ölçümü için üç seçenek. Birlikte, bu avantajlar büyük ölçüde tha, içki etanol uçar olasılığını ortadan kaldırmakt etanol ve böylece kendi genel lokomotor yeteneklerini inhibe sinekler dış yüzeylerini ıslak olabilir, ve deneyde sinek performans test ortamında malzeme harmanlama ile ilişkili zorluklar ile eleştirilmiştir olabilir. Ayrıca, bu avantajlar tahlil genel verimi ve tekrarlanabilirlik artırır. Bundan başka, bu deneyde ölçüldüğü etanol duyarlılık sentezlenmesi etkilenmeyen beyaz endojen ve transgenik işaretleyici mini beyaz, 18 genel olarak, Drosophila genetik analizlerde kullanılan transgenlerin ve genetik kökenli çalışmalar için uygun bir maddedir.
Birkaç anahtar parametreleri etanol sedasyon deneyleri güvenilir sonuçlar elde etmek kontrol edilmelidir. Test edilen büyüme ortamı ve suşlar genetik arka planı (yukarıya bakınız) kontrol etmeye ek olarak, ses ve etanol konsantrasyonu, elbette, etanol hassasiyet küçük nicelendirilmesi için son derece önemlidirTy. Su içinde etanol seyreltme egzotermik olduğuna dikkat edin. Sonuç olarak, seyreltilmiş etanol solüsyonları, önceki sedasyon deneylerinin başlamasından oda sıcaklığına dengelenmeye izin verilmelidir. Test edilen gruplar arasında formasını yapılmalıdır bir ek parametre sinekler sedasyon Deneye başlamadan önce boş gıda şişelerde muhafaza edilir o zaman uzunluğudur. İki ek parametreler de kontrol edilmelidir. şişe başına sinek sayısı, ideal olması gerekir (a) Bütün şişeler ve gruplarda aynı, (b)
Bir hızla ve kolayca sayılabilecek sayıda, ve (c) nispeten pürüzsüz sedasyon zaman kurslar için izin vermek için yeterince büyük bir sayı. Onbir şişe laboratuvarımızda iyi çalışır ve önerilen başlangıç noktasıdır / uçar. Dikkate nihai parametre sedasyon deneylerinde kullanılan sinekler yaşıdır. 1-10 gün eski sinekler etanol sedasyon duyarlılığı üzerinde yaşın etkisi tekrarlanabilir (veriler gösterilmemiştir) bulunmasına rağmen, genç yaştaki hayvanların kullanımı gibi görünüyorsinekler 29,30 yaşa bağlı davranış değişiklikleri, büyük edebiyat verilen haklı.
Burada anlatılan parametrelerin aralıkları kullanılarak kontrol sinekler test ederken diğer parametreler, en azından, sedasyon tayinlerde kritik görünmüyor. Seks, vurma gücü, dokunarak kurtarma zamanı, ve sinek antibiyotikler (ampisilin, tetrasiklin ve kloramfenikol) ile gıda veya canlı maya takviyesi burada anlatıldığı gibi ölçülen etanol duyarlılığı değiştirmez. Benzer şekilde, üçüncü dereceden polinom eğrileri, birincil sedasyon zaman ders veri Sigmoidal eğrileri enterpolasyon veya AUC belirlenmesi interpolasyonla etanol hassasiyeti nicelleştirilmesini esas ayırt yorumların yol açar. Cinsiyet olarak etkisi; burada tarif edilen çalışmalarda gözlenen olmasına rağmen, çok sayıda Drosophila genetik geçmişlerde, etanol hassasiyetine cinsiyet etkileri 31 bildirilmiştir. Böylece, seks etkilerinin olduğu mümkündürsadece burada kullanılan genetik w değişimin [A] arka tarafından maskeli. Alternatif olarak, bu Drosophila davranışsal tepkilerin üzerinde ölçüm seks etkileri henüz tanımlanmamış tahlil ya da büyüme koşullarını gerektiren mümkündür. Herhangi bir durumda, öneri, grupların cinsiyeti sedasyon deneyleri, mümkün olduğu kadar eşit olarak açıkça karşılaştırılan tüm parametreleri yapmaktır.
Canlı maya sinek gıda etanol büyükçe miktarda üretmek olduğu göz önüne alındığında, canlı maya ile gıda takviyesi sinekler iç etanol artmadı ki biraz şaşırtıcı oldu. Bunun muhtemel bir açıklaması, etanol gıda maddesinin yüzeyi üzerinde düzgün bir şekilde üretilir ve bu nedenle seçici olmayan ya da etanol içinde, nispeten düşük konsantrasyonlarda, yemek yedikten olabilir uçan edilmemesidir. Ek çalışmalar bu bulgu için bu ve diğer olası açıklamaları ele gerekecektir.
Deney describ modifikasyon çok sayıdaed burada deney yapılmaktadır hedeflerine bağlı olarak mümkündür. Örneğin, şişelerin sayısı her şişe içinde test sinek sayısı, konsantrasyon ve hacim etanol, etanol maruz kalma süresi kullanılan bir deneyde, test edilmiş, sedasyon değerlendirmeler, yaş ve sinekler cinsiyet arasındaki zaman aralığı test , sedasyon ve kriterlerin hepsi tek bir laboratuvar ihtiyaçlarını karşılamak için değiştirilebilir. öneri başlangıçta tahlil öğrenirken dört şişeleri bir ya da iki grup ile başlar ve daha sonra proje için gerekli verim sağlayan flakon sayısını kullanarak büyütmek için. Beklenmedik kısa veya uzun ST50s bu deney sinekler anestezi süreleri, anestezi O / N kurtarmak için izin verildi (1-5 dk) kısa tabi tutuldu sağlamak için iyi bir uygulama olacağını, dikkat edilmelidir, 10 günden az eski edildi fiziksel, etanol çözeltisi ile ıslatılmış değil elleçlemesi sırasında hasar değil, ve lokomotor bozukluğu yoktu.
Tahlil, etanol sedasyon duyarlılığı, sadece ve bu nedenle tasarlanan ya da etanol diğer davranışsal tepkileri değerlendirmek için uygun değildir. Sinekler bilinen tüm etanol davranışsal paradigmalar gibi, bu deney ölçüde normal bir hareket yeteneklerine sahip sinekler gerektirir ve bu nedenle test edilmemelidir bozulmuş hareketlilik ile genotip. Analizin bir diğer kısıtlılığı flakon etanol buharı konsantrasyonu muhtemelen selüloz asetat fiş uyuşturucu buharlaşarak olarak sürekli artıyor olmasıdır. Sineklerin iç etanol tüm zaman giderek yükselir rağmen etanol davranış testleri sinek, sinekler etanol buharı sabit bir konsantrasyon teslim Bu deneyde elde edilen sonuçların tutarlılığını geliştirmek mümkün görünmektedir. Etanol buharı sabit bir konsantrasyonunun sağlanması için bir yöntem olup henüz deney burada açıklanan ölçekte kullanılması için izin verecek tespit edilmemiştir.
etanol sedasyonBurada anlatılan tahlil etanol duyarlılık ve hızlı tolerans 18 genetik analiz için çok uygundur. Büyüme ortamı, genetik arka plan, konsantrasyon ve hacim etanol, zaman sinekler miktarı boş gıda şişeleri harcamak ve kullanılan sinek sayısı ve yaş tüm kontrol edilmelidir. Bu parametreler yeterince kontrol edilir varsayarsak, sedasyon tahlil hem ters için uygun ve davranışsal tepkiler Drosophila etanol için moleküler temelini araştırmak genetik yaklaşımlar yönlendirsin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A.
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L.
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
