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Medicine

तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर उपगोल आक्रमण परख

Published: May 1, 2015 doi: 10.3791/52686
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1Division of Molecular Pathology, The Institute of Cancer Research, 2Division of Cancer Therapeutics, The Institute of Cancer Research

Abstract

ट्यूमर (सौम्य के खिलाफ) सामान्य आसपास के ऊतकों के आक्रमण आम तौर पर घातक की एक प्रमुख पहचान माना जाता है। विशेष रूप से कुछ तरह के कैंसर के लिए (। उदाहरण के लिए, इस तरह के ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म और सिर के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और गर्दन के रूप में मस्तिष्क ट्यूमर - SCCHN) यह गंभीर रुग्णता का एक कारण है और जीवन के लिए खतरा दूर मेटास्टेसिस के अभाव में भी हो सकता है। इसके अलावा, relapsed है जो कैंसरों दुर्भाग्य से अक्सर मौजूद एक और अधिक आक्रामक phenotype के साथ इलाज के बाद। इसलिए, मानक विरोधी प्रफलन एजेंटों के पूरक हो सकता है कि उपन्यास के उपचारों प्रदान करने के लिए आक्रमण करने की प्रक्रिया को लक्षित करने के लिए एक अवसर है। अब तक, इस रणनीति के आक्रमण का एक विस्तृत विश्लेषण के लिए और दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त मजबूत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य assays के अभाव के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। यहाँ हम एक साधारण सूक्ष्म प्लेट विधि प्रदान (वर्दी के आधार पर स्वयं कोडांतरण 3 डी ट्यूमर spheroids) ऐसे छात्रों के लिए काफी क्षमता है जोमर जाता है। हम यह भी एक मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन और लक्षित epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) को अवरोधकों के खिलाफ प्रतिरोध के विकास बढ़ाया मैट्रिक्स आक्रामक क्षमता के साथ जुड़ा हुआ है, जहां एक SCCHN मॉडल का उपयोग परख मंच उदाहरण देना। कोशिकामापी एक इमेजिंग का उपयोग कर एक और केवल डिजिटल छवि विश्लेषण के साथ मानक माइक्रोस्कोपी और छवि पर कब्जा की आवश्यकता है जो एक दूसरे: हम भी अर्द्ध स्वचालित मात्रा का ठहराव के दो वैकल्पिक तरीकों प्रदान करते हैं।

Introduction

शास्त्रीय कैंसर विरोधी दवा के विकास ट्यूमर सेल प्रसार रोकना और / या क्रमादेशित कोशिका मृत्यु (एपोप्टोसिस) को बढ़ावा देने कि साइटोटोक्सिक एजेंटों के लिए स्क्रीन करने के लिए इन विट्रो सेल आधारित assays के उपयोग पर काफी हद तक ध्यान केंद्रित है। हाल ही में, के प्रयासों घातक सेल प्रसार की अंतर्निहित आणविक कारणों में से अवरोधकों के विकास के साथ लक्षित चिकित्सा की ओर चले गए हैं। कुछ शानदार परिणाम के बावजूद, इस तरह के एजेंटों अक्सर दवा प्रतिरोध का तेजी से विकास के साथ जुड़े रहे हैं। यह कैंसर से होने वाली मौतों के बहुमत के लिए जिम्मेदार है कि ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रामक और मेटास्टेटिक संभावित है, और कहा कि relapsed बीमारी अक्सर, यह इन विट्रो प्रयोगात्मक मॉडल उपन्यास की पहचान करने के लिए 1,2 में पूरक विचार करने के लिए भी तार्किक है एक और अधिक आक्रामक फेनोटाइप प्रस्तुत करता है यह देखते हुए कि कैंसर के इन अतिरिक्त कुंजी 'पहचान' को बाधित करेगा कि एजेंटों।

घातक प्रगति के दौरान, ट्यूमर कोशिकाओं का अधिग्रहणआसपास के ऊतकों पर आक्रमण और / या दूर के अंगों (मेटास्टेसिस) में फैल करने की क्षमता। कैंसर की कोशिकाओं को invadopodia 3,4 के गठन के द्वारा तहखाने झिल्ली घुसना। इन संरचनाओं एक्टिन filaments, विशिष्ट आसंजन प्रोटीन और proteinases के साथ समृद्ध और सामूहिक रूप से ट्यूमर सेल गतिशीलता और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 5 की गिरावट के लिए जिम्मेदार होते हैं। Invadopodia ईसीएम में विस्तार और ट्यूमर सेल आक्रमण के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और भी hematogenous (या लसीका) प्रसार और मेटास्टेसिस को सुविधाजनक बनाने, नाड़ी चैनलों में परिस्त्राव माना जाता है।

वर्तमान मानक तरीकों का पालन शामिल इन विट्रो में ट्यूमर सेल आक्रमण का आकलन करने के लिए। Transwell के आधार पर या Boyden कक्ष assays के एकल कक्ष निलंबन ईसीएम व्युत्पन्न प्रोटीन की एक मोटी परत के साथ लेपित एक फिल्टर के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, जहां 2,6। कोशिकाओं तो आक्रमण और एक केमो-attractant के जवाब में निचले सदन में चलते हैं। आमतौर पर इस्तेमाल किया ईसीएमप्रोटीन I कोलेजन प्रकार के होते हैं, या तहखाने झिल्ली की प्राकृतिक संरचना mimics कि (EHS ट्यूमर 7 से निकाली गई BMM, जैसे, Matrigel,) एक तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स।

फिल्टर आधारित Boyden कक्ष प्रकार assays के 8 के लिए एक विकल्प के रूप में, कोशिकाओं वे जेल में आक्रमण व्यक्तिगत रूप से या सामूहिक रूप से तो एक monolayer और फार्म जहां (fibroblasts जोड़ा जा सकता है जो करने के लिए) एक ईसीएम जेल के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। आक्रमण जेल सतह 9 से कूच हमलावर कोशिकाओं और / या दूरी की संख्या के संदर्भ में मापा जा सकता है। आमतौर पर कोशिकाओं के आसपास के मैट्रिक्स 2,6,10,11 में ट्यूमर जन से बाहर आक्रमण करने की इजाजत दी ईसीएम gel- की दो परतों के बीच रखा गया - ट्यूमर कोशिकाओं को भी पूरी तरह से एक मैट्रिक्स में या तो एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में या spheroids के रूप में एम्बेड किया जा सकता है।

यहाँ वर्णित तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण परख एक highl का उपयोग कर एक तेजी से, automatable आक्रमण प्रणाली प्रदान करता हैअच्छी तरह से प्रति एक अंडाकार आकृति के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में y प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, मानकीकृत विधि 12। BMM ट्यूमर कोशिकाओं अंडाकार आकृति शरीर से आक्रमण में जो एक अर्द्ध ठोस मैट्रिक्स प्रदान करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से सीधे जोड़ा गया है। 96 घंटा - ट्यूमर सेल आक्रमण की हद तक 72 की अवधि में अंतराल पर नजर रखी है। इस विधि से ऊपर उल्लेख किया है वर्तमान में इन विट्रो आक्रमण assays पर निम्न लाभ प्रदान करता है: कोशिकाओं को एक ट्यूमर सूक्ष्म क्षेत्र या एक सूक्ष्म मेटास्टेसिस नकल उतार एक 3 डी संरचना में आयोजित कर रहे हैं ट्यूमर; ट्यूमर spheroids आकार में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं; आक्रमण परख माध्यमिक प्लेटों के लिए उन्हें स्थानांतरित करने के लिए आवश्यकता के बिना, ट्यूमर अंडाकार आकृति विकास के रूप में एक ही थाली में बगल में किया जाता है; स्वचालित छवि विश्लेषण की नवीनतम तकनीकों के साथ संयुक्त विधि, दोनों उच्च सामग्री के लिए सक्षम बनाता है और उच्च throughput ट्यूमर सेल आक्रमण का विश्लेषण करती है।

छवि विश्लेषण एक 96 अच्छी तरह से स्कैन करता है जो कोशिकामापी एक इमेजिंग, का उपयोग किया जाता है10 मिनट के भीतर थाली। संगम आवेदन का उपयोग करके, सीमा और आक्रमण की दर एकल कक्षों से या सेल समूहों ट्यूमर spheroids से बाहर फैल रहा है और एक गतिशील फैशन में मापा जा सकता है मैट्रिक्स में हमलावर द्वारा या तो हासिल की। कम throughput के लिए, छवि विश्लेषण के लिए एक वैकल्पिक तरीका एक औंधा माइक्रोस्कोप और मानक इमेजिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग पर आधारित है, प्रस्तुत किया है।

Protocol

Reproducibly आकार के ट्यूमर spheroids 1. पीढ़ी

  1. फॉस्फेट बफर खारा के साथ धोने ट्यूमर सेल monolayers (पीबीएस, एक 25 सेमी 2 या 8 के लिए 5 मिलीलीटर - एक 75 सेमी 2 कुप्पी के लिए 10 मिलीलीटर), सेल हदबंदी एंजाइम (जोड़ना एक 75 सेमी के लिए एक 25 सेमी 2 के लिए 1 मिलीलीटर या 2 मिलीलीटर 5 मिनट - 2 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 कुप्पी) और सेते कोशिकाओं।
  2. एक खुर्दबीन के नीचे सेल टुकड़ी की जाँच करें और (एक 75 सेमी 2 कुप्पी के लिए एक 25 सेमी के लिए 2 या 8 मिलीलीटर 5 मिलीलीटर) पूरा मध्यम विकास के साथ सेल हदबंदी एंजाइम बेअसर।
  3. 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन।
  4. सतह पर तैरनेवाला निकालें ट्यूब नल और एक P1000 पिपेट का उपयोग पूर्ण मध्यम विकास के 1 मिलीलीटर में सेल गोली फिर से निलंबित। इस सेल समूहों के बिना एक एकल कक्ष निलंबन उपज चाहिए।
  5. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती और प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन पतला 0.5-2 10 x 4 कोशिकाओं / एमएल (इष्टतम सेल घनत्व ओ में प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए निर्धारित करने की जरूरत है) सेल 12,13 बोने के बाद 500 माइक्रोन व्यास 4 दिन - rder 300 का ट्यूमर spheroids प्राप्त करने के लिए।
  6. अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव (ULA) 96 अच्छी तरह से दौर नीचे प्लेटों 12 में / एक बाँझ जलाशय सेल निलंबन स्थानांतरण और, एक multichannel विंदुक का उपयोग, 200 μl बांटना।
  7. एक मशीन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 95% आर्द्रता) के लिए प्लेटें स्थानांतरण। चार दिन बाद, नेत्रहीन ट्यूमर अंडाकार आकृति के गठन की पुष्टि करें और 3 डी आक्रमण परख के साथ आगे बढ़ें।

2. 3 डी ट्यूमर उपगोल आक्रमण परख

  1. बर्फ पर BMM गला लें।
  2. P10 के लिए बाँझ फिल्टर सुझावों का एक सेट रखने, P200 और P1000 है pipettes और बाँझ ट्यूब (1.5 मिलीलीटर मात्रा आवश्यक कुल मात्रा पर निर्भर करता है या बड़ा) -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  3. बर्फ पर 4 दिन पुरानी spheroids युक्त ULA 96 अच्छी तरह से प्लेट में रखें।
  4. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, धीरे अंडाकार आकृति प्लेटों से मध्यम विकास के लिए 100 μl / अच्छी तरह से हटा दें। इस कदम के कोण के लिए मैं की ओर सुझावोंअच्छी तरह से और spheroids के स्थान के नीचे के साथ संपर्क से बचने यू-नीचे कुओं की nside दीवार; spheroids की अशांति को कम।
  5. ठंडा सुझावों का प्रयोग, ठंडा ट्यूबों के लिए BMM हस्तांतरण। दवा मूल्यांकन अध्ययन साइटोकाइन प्रेरित आक्रमण के लिए या के लिए, बहुत ठंडा युक्तियों का उपयोग BMM करने के लिए (2x अंतिम एकाग्रता में) अभिकर्मकों जोड़ें। उदाहरण के लिए, सीएएल एस और काल आर स्क्वैमस कार्सिनोमा कोशिकाओं के आक्रमण को प्रोत्साहित करने के लिए epidermal वृद्धि कारक (EGF) का उपयोग करें। , धीरे घूमता बुलबुले के गठन से बचने के द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  6. धीरे अच्छी तरह से अंदर दीवार की ओर टिप लक्ष्य, यू-नीचे कुएं में BMM के 100 μl बांटना। इष्टतम छवि विश्लेषण के लिए, spheroids अच्छी तरह से 12 के बीच में ही रहना चाहिए, के रूप में यह कदम सबसे महत्वपूर्ण है।
  7. 6 प्रतिकृति / स्थिति - 5 की इजाजत देने के लिए सभी आवश्यक कुओं, के लिए दोहराएँ कदम 2.6। यदि आवश्यक हो, एक ताजा ठंडा टिप करने के लिए बदल जाते हैं।
    नोट: अधिक अनुभवी, dispen जबएक multichannel पिपेट का उपयोग एसई BMM।
  8. अगर वर्तमान में एक बाँझ सुई का प्रयोग, बुलबुले को दूर।
    1. एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, नेत्रहीन spheroids एक केंद्रीय स्थिति में हैं कि जाँच करें। यदि नहीं, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। इस spheroids केन्द्र अच्छी तरह से प्रत्येक में स्थित हैं यह सुनिश्चित करेगा।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन थाली स्थानांतरण और BMM जमना करने के लिए अनुमति देते हैं।
  10. 1 घंटे बाद, एक multichannel विंदुक का प्रयोग, धीरे 100 μl / पूर्ण मध्यम विकास की अच्छी तरह से जोड़ें। साइटोकाइन प्रेरित आक्रमण या नशीली दवाओं के मूल्यांकन के अध्ययन के लिए, मध्यम में साइटोकिन्स या अवरोधक (अंतिम एकाग्रता 1x) शामिल हैं। अभिकर्मकों 2.5 कदम में BMM में शामिल नहीं किया गया वैकल्पिक रूप से, (वांछित अंतिम एकाग्रता 3x) इस बिंदु पर मध्यम करने के लिए उन्हें जोड़ने।

3. स्वचालित छवि अधिग्रहण

  1. कोशिकामापी पर स्कैन प्लेटों के अंतराल स्टेशन पर (विनिर्देशों के लिए उपकरण और सामग्री की तालिका देखें)तुरंत 72 घंटा, या धीमी हमलावर ट्यूमर सेल लाइनों के लिए 96 घंटे तक का समय 2.10 कदम के बाद शून्य (t0 = सेट अप आक्रमण परख के दिन, समय से rting।
  2. 'संगम' आवेदन का चयन करें।
  3. अंडाकार आकृति ध्यान में है कि जाँच करें और, यदि आवश्यक हो तो, मैन्युअल रूप से समायोजित करने और 'सेट ऑफ फोकस' तय कर लो।
  4. दृश्य (FOV) के एक केंद्रीय क्षेत्र स्कैन करने के लिए चुनें 'नमूना सेटिंग', के तहत। BMM अलावा के बाद, ट्यूमर spheroids इस प्रकार पूरे अच्छी तरह से स्कैन करने के लिए कोई जरूरत नहीं है, एक केंद्रीय स्थान में रह गए हैं चाहिए।
  5. सॉफ्टवेयर में, कुओं थाली उन्हें मानचित्र पर प्रकाश डाला द्वारा स्कैन किया जाना परिभाषित करते हैं। 'स्कैन प्रारंभ करें' पर क्लिक करें।
    नोट: स्कैन स्वचालित रूप से सहेजा जाता है और बाद में बंद लाइन की समीक्षा की जा सकती है।

4. स्वचालित छवि विश्लेषण

  1. 'संगम' आवेदन का चयन करें।
  2. 'विश्लेषण' टैब में, applic समायोजितव्यावहारिक सेटिंग्स (जैसे, "सटीक": कम, सामान्य, उच्च, "तीव्रता दहलीज": 1 - 15) BMM (चित्रा 1 देखें) में विस्तार सेल प्रक्रियाओं और invadopodia सहित अंडाकार आकृति के चारों ओर एक सटीक विभाजन, निर्माण करने के लिए। प्रत्येक ट्यूमर सेल लाइन के लिए और / या विभिन्न समय बिंदुओं पर सेटिंग्स समायोजित करें। 'संगम' आवेदन उपायों चयनित FOV में, हमलावर कोशिकाओं द्वारा कवर अच्छी तरह से क्षेत्र के%।
  3. विश्लेषण सेटिंग्स कुछ अलग कुओं पर क्लिक करके प्लेट में अन्य spheroids के लिए (यानी, विभाजन सटीक है) उपयुक्त हैं की जाँच करें। विभाजन सही रूप में एक अंडाकार आकृति की रूपरेखा तैयार नहीं है, तो आगे आवेदन सेटिंग्स समायोजित करें।
  4. 'विश्लेषण प्रारंभ करें' पर क्लिक करें।
  5. 'परिणाम' टैब पर, विश्लेषण गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए कई कुओं की जाँच करें। एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में निर्यात करें 'ठीक स्तर डेटा'।
  6. Repeaसभी समय बिंदुओं के लिए टी विश्लेषण। वैज्ञानिक रेखांकन और पसंद के सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दोहराने के कुओं और एक बार चार्ट में समय के खिलाफ साजिश आक्रमण (% संगम), के लिए मतलब% संगम की गणना।

5. मैनुअल छवि अधिग्रहण

  1. टी से = 0 72 से शुरू होने अंतराल पर प्रत्येक ट्यूमर अंडाकार आकृति के लिए एक छवि रिकॉर्ड - 96 घंटा, यह लगभग 20 लेता है एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप (प्रयोग सवाल में सेल लाइन, के आक्रमण की गति पर निर्भर करता है - 30 मिनट)। एक 10x उद्देश्य का उपयोग करें। एक आक्रमण क्षेत्र पूरी तरह से देखने की 10X क्षेत्र के भीतर कब्जा होने की बहुत बड़ी है जब एक 4X उद्देश्य का प्रयोग करें।
  2. का अधिग्रहण प्रत्येक व्यक्ति की छवि को बचाओ।
  3. अंशांकन के लिए, दोनों 10X और 4X उद्देश्यों का उपयोग कर एक मंच graticule (1 मिमी) का चित्र लेने (और छवियों को बचाने के लिए)।

6. मैनुअल छवि विश्लेषण

  1. पसंद की छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में मंच graticule छवियों को खोलें।
  2. महान दर्जicule माप इकाइयों (माइक्रोन), उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया (10X या 4x) और अंशांकन प्रदर्शन करते हैं। यह कदम केवल एक बार आवश्यक है। बाद में छवि विश्लेषण के लिए, बस आवश्यक अंशांकन सेटिंग को फिर से लोड।
  3. आक्रमण परख छवियों को खोलें और माइक्रोस्कोप उद्देश्य (10x या 4X) के आधार पर अंशांकन सेटिंग्स का चयन करें छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    1. एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त छवियों के लिए वर्णित के रूप में (चित्रा 3 और 4 चित्र में दिखाया गया है परिणामों को देखें), वैकल्पिक रूप से, आयात छवियों (चरण 3) कोशिकामापी एक इमेजिंग पर प्राप्त की है और मैन्युअल रूप से विश्लेषण करते हैं।
  4. Spheroids द्वारा कवर क्षेत्र उपाय।
    1. (विनिर्देशों उपकरण और सामग्री की तालिका देखें) प्रतिनिधि परिणाम के लिए यहां इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर, 'उपाय' करने के लिए जाने के लिए और चयन में '/ आकार गिनती'। 'फ़ाइल' फिर 'लोड सेटिंग' को चुना और पूर्व निर्धारित ASSA चयनY सेटिंग्स। फिर 'गिनती' का चयन करें। अंडाकार आकृति तो सही ढंग से खंडित किया जाना चाहिए।
    2. वैकल्पिक रूप से 'जादू की छड़ी / ट्रेस' विंडो खोलने के लिए 'वस्तुओं विलय / ड्रा' फिर 'संपादन' के लिए जाना। अंडाकार आकृति छवि पर क्लिक करें और विभाजन प्राप्त करने के लिए जादू की छड़ी कर्सर का प्रयोग करें। स्वयं एक माउस का उपयोग अंडाकार आकृति की रूपरेखा तैयार करने के लिए ('जादू की छड़ी' विंडो में) 'ट्रेस' का चयन करें।
  5. एक स्प्रेडशीट के लिए विभिन्न मापदंडों (क्षेत्र, व्यास, परिधि आदि) के निर्यात माप। स्प्रेडशीट पर रिकॉर्ड प्रासंगिक छवि जानकारी (उदाहरण के लिए, अच्छी तरह से नंबर, रिश्तेदार समय बिंदु)।
  6. वैज्ञानिक रेखांकन और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर समय बनाम दोहराने spheroids (आक्रमण) का मतलब क्षेत्र प्लॉट। वैकल्पिक रूप से, टी में क्षेत्र के सापेक्ष हर समय बिंदु पर अंडाकार आकृति क्षेत्र में परिवर्तन की गणना, = 0 फिर साजिश आक्रमण (% t0) एक रेखीय gra के रूप में समय बनामपीएच।

Representative Results

3 डी ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण रेखाचित्र के रूप में चित्रा 1 में सचित्र एक सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्वचालित पद्धति का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाता है: reproducibly आकार के ट्यूमर spheroids ULA 96 अच्छी तरह से दौर नीचे प्लेटों में चढ़ाना कोशिकाओं द्वारा प्राप्त कर रहे हैं। 4 दिनों के बाद दीक्षा spheroids BMM में एम्बेडेड रहे हैं। यह ट्यूमर कोशिकाओं पर आक्रमण और अंडाकार आकृति के बाहर फैल गया जिसमें एक अर्द्ध ठोस संरचना प्रदान करता है। कोशिकामापी एक इमेजिंग का उपयोग करते हुए 96 घंटा - spheroids BMM में अच्छी तरह से प्रत्येक का आधार है और आक्रमण पर केन्द्र स्थित हैं आसानी = 0 टी 72 से शुरू अंतराल पर नजर रखी है। यह पूरी तरह से स्वचालित छवि विश्लेषण प्रदान कर सकते हैं।

कैंसर सेल आक्रमण के विभिन्न प्रकार के उदाहरण आंकड़े 2 में सचित्र हैं -। 4 अत्यधिक घातक मानव ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म (जीबीएम) सेल लाइन अंडर 87 एमजी, एक चुस्त, गोलाकार 3 डी संरचना रूपों और मस्तिष्क ट्यूमर उदाहरण देना करने के लिए यहाँ प्रयोग किया जाता है स्थानीय जिसमें आक्रमण एक प्रमुख जीवन के लिए खतरा हैसुविधा। एक बार जब BMM में एम्बेडेड, एक ठेठ "बर्स्ट" आक्रमण पैटर्न 12 के साथ फैल यू-87 एमजी spheroids से कोशिकाओं। ट्यूमर कोशिकाओं त्रिज्यात वे एक 3-आयामी आकार को बनाए रखने में जो मैट्रिक्स में विस्तार। BMM में विस्तार सेलुलर प्रक्रियाओं का विवरण और invadopodia के साथ ट्यूमर सेल आक्रमण की हद, स्पष्ट रूप से स्पष्ट है, जब यू-87 एमजी spheroids के लिए चित्रा 2 में दिखाया गया के रूप में इस प्रक्रिया को 72 घंटे की अवधि में पीछा किया जाता है। पूरी तरह से समय के साथ ट्यूमर सेल आक्रमण के सटीक quantitation के लिए सक्षम बनाता है कोशिकामापी एक छवि का उपयोग छवि विश्लेषण स्वचालित। स्वचालित विश्लेषण अंडर 87 एमजी अंडाकार आकृति शरीर से BMM में विस्तार सेल protrusions के चारों ओर विभाजन पैदा करता है, जहां चित्रा 1 में सचित्र के रूप में चित्रा 2 में मात्रा का ठहराव प्राप्त की है। इस सेल लाइन के लिए, ट्यूमर अंडाकार आकृति शरीर पर आक्रमण क्षेत्र की माप से बाहर रखा गया है कि ध्यान दें।

Invas की एक अलग पैटर्नआयन मानव स्क्वैमस सिर और गर्दन के कैंसर कोशिका लाइनों के द्वारा प्रदर्शित किया गया था। सीएएल एस और काल आर isogenic हैं, लेकिन सीएएल एस के प्रति संवेदनशील है, और EGFR टाइरोसीन काइनेज अवरोधकों 14 के लिए प्रतिरोधी सीएएल आर। EGF के अभाव में न तो सेल लाइन BMM (चित्रा 3) EGF की एकाग्रता बढ़ गया था लेकिन, जैसा कि (2.5 एनजी / एमएल), spheroids 'कली' के लिए प्रकट में हमला कर दिया। EGF (40 और 80 एनजी / एमएल) के आक्रमण की डिग्री के उच्च सांद्रता में कम हो गया था। यह पहले 15 सूचित किया गया है कि आक्रमण के मामले में EGF को शास्त्रीय घंटी के आकार खुराक प्रतिक्रिया के अनुरूप है। 20 एनजी में / एमएल EGF, सीएएल की कोशिकाओं whilst के सीएएल आर spheroids के मुख्य शरीर से extruded उंगली की तरह उभार 72 घंटा (चित्रा 3) के बाद कम आक्रामक थे। Spheroids सेल लाइनों के बीच अधिक से अधिक गौरव के लिए 20 एनजी / एमएल EGF युक्त BMM (में रखा गया था के बाद यह अंतर आक्रमण 48 घंटा स्पष्ट हो गया था) और 72 घंटे के बाद सबसे बड़ी (चित्रा 4)। इन छवियों को यू-87 एमजी के लिए के रूप में, कोशिकामापी एक इमेजिंग का उपयोग तेजी से हासिल किया गया। हालांकि, इस मामले में, एक वैकल्पिक तरीका उदाहरण देना करने के लिए, आक्रमण की डिग्री स्टैंड-अलोन छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मैन्युअल रूप से मात्रा निर्धारित किया गया था और रेखांकन भी प्रस्तुत किया जाता है (आंकड़े 3 और 4)। इन परिणामों के लिए विशेष रूप से दवा प्रतिरोधी, आक्रामक phenotype के विरोध करेगा कि यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि दवा के प्रति संवेदनशील और प्रतिरोधी कोशिकाओं के बीच एक प्ररूपी अंतर दर्शाने।

चित्र 1
3 डी ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण परख के 1. योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा। कार्यप्रवाह सिर्फ BMM में एम्बेड करने के बाद विधि यू-87 एमजी ग्लियोब्लास्टोमा spheroids के प्रतिनिधि छवियों सहित शामिल कदम से पता चलता (शीर्ष पैनल, टी 0 =) और आक्रमण के बाद BMM में, के साथ और हमलावर कोशिकाओं द्वारा कवर क्षेत्र उपाय है कि विभाजन के बिना (नीचे के पैनल टी 72 घंटा =)। बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
के BMM। यू-87 एमजी में यू-87 एमजी ग्लियोब्लास्टोमा अंडाकार आकृति आक्रमण की चित्रा 2. समय पाठ्यक्रम BMM में 3 डी आक्रमण पर नजर रखी और कोशिकामापी एक इमेजिंग का उपयोग करते हुए 72 घंटा के लिए ऊपर मात्रा निर्धारित किया गया था, अंडाकार आकृति। (ए) प्रतिनिधि छवियों और (बी) मात्रा का ठहराव ट्यूमर सेल आक्रमण दिखाए जाते हैं। बार = 500 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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(प्रतिरोधी) चित्रा 3. सीएएल अनुसंधान और काल एस (संवेदनशील) ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण। (ए) प्रतिनिधि छवियों और (बी) EGF खुराक पर निर्भर सीएएल अनुसंधान और काल एस ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण का मार्गदर्शन मात्रा का ठहराव दिखाए जाते हैं। बार = 500 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
बी में रखा गया है जब चित्रा 4। सीएएल R से कोशिकाओं (प्रतिरोधी) spheroids सीएएल एस (संवेदनशील) ट्यूमर spheroids की तुलना में अधिक आक्रामक रहे हैंEGF उत्तेजना सीएएल आर ट्यूमर spheroids एक सीएएल एस की तुलना में अधिक स्पष्ट आक्रमण। (ए) प्रतिनिधि छवियों और (बी) के आक्रमण का मार्गदर्शन मात्रा का ठहराव दिखाने पर मिमी। दिखाए जाते हैं। बार = 500 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ वर्णित दो ट्यूमर मॉडल (ग्लियोब्लास्टोमा और SCCHN) विशेष रूप से वे चिकित्सकीय प्रभावी उपचार 12 के लिए एक unmet की आवश्यकता के साथ प्रासंगिक स्थानीय रूप से आक्रामक कैंसर के रूप में हमारे 3 डी परख उदाहरण देना करने के लिए चयन किया गया था। नशीली दवाओं के उपचार, इन विट्रो pharmacodynamic (पीडी) बायोमार्कर परिवर्तन के आकलन BMM और / या पूरे द्वारा ट्यूमर spheroids हमलावर की Immunofluorescent विश्लेषण से सेल वसूली की अनुमति के लिए विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों के उपयोग के बाद पश्चिमी धब्बा या lysates के immunoassays द्वारा आसानी से किया जा सकता है निम्नलिखित माउंट धुंधला हो जाना।

इस आक्रमण परख एक उपयोगी एक semisolid माध्यम में ट्यूमर सेल आक्रमण के तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मूल्यांकन के लिए तकनीक और इन विट्रो दवा स्क्रीनिंग में भविष्य के लिए इसलिए विशेष रूप से उपयुक्त है। कैंसर की कोशिकाओं को वे ट्यूमर अंडाकार आकृति के प्रतिनिधित्व वाले एक "सूक्ष्म ट्यूमर", से बाहर फैल के रूप में एक 3 डी ढंग से मैट्रिक्स आक्रमण है, और एक extracellul में विस्तारगिरफ्तारी मैट्रिक्स की तरह पर्यावरण। परख का असली तीन आयामी स्वरूप एक ठोस सब्सट्रेट पर चलती है जब कोशिकाओं मान फ्लैट, पक्षपाती आकृति विज्ञान से अलग है, जो सेल आकृति विज्ञान, में स्पष्ट है। आक्रमण की डिग्री आसानी से, या इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन में एक मानक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक स्वचालित पढ़ने के लिए बाहर की अनुमति देता है, कोशिकामापी एक इमेजिंग या तो उपयोग मात्रा निर्धारित है। इसके अलावा, इस विधि उपयुक्त है फ्लोरोसेंट इमेजिंग 13 के लिए (फ्लोरोसेंट प्रोटीन या व्यक्त सेल लाइनों के साथ उदाहरण के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के साथ पूर्व लेबल)।

में अंडाकार आकृति के मध्य स्थिति को परेशान करने के लिए एक खतरा नहीं है जब विधि BMM, के अलावा द्वारा प्रतिनिधित्व ही महत्वपूर्ण कदम के साथ प्रदर्शन करने के लिए सरल है अच्छी तरह से यू के आकार का। यह अलग फोकल विमानों में spheroids के साथ, उपअनुकूलित छवि विश्लेषण में परिणाम कर सकते हैं। यह अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए ध्यान से और धीरे धीरे BMM जोड़ने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। BMM अलावा के बाद यह थाली जाँच करने के लिए सलाह दी जाती हैस्थानीयकरण अस्वीकार्य माना जाता है अगर एक खुर्दबीन के नीचे और, इस कोमल centrifugation द्वारा remedied किया जा सकता है। अनुभव के साथ, यह शायद ही कभी आवश्यक है। इस विधि मजबूत और बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है जबकि, अंतर प्रयोगात्मक भिन्नता BMM के विभिन्न बैचों के साथ हो सकता है। इससे बचने के लिए, यह अध्ययन की एक श्रृंखला को पूरा करने के लिए एक ही बैच से पर्याप्त BMM खरीद करने के लिए सलाह दी जाती है।

विधि की एक सीमा है (किसी भी तरह के assays के लिए) के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं की संभावना परख समय सीमा के दौरान गुजरना जो आक्रमण और प्रसार के बीच भेद करने में कठिनाई है। कोशिकाओं के दोहरीकरण के समय को ध्यान में रखा, या ऐसे cytochalasin डी के रूप में सेल चक्र अवरोधकों को पेश किया जा सकता है, इसे नियंत्रित या स्पष्ट रूप से विशेष रूप से तेजी से बढ़ ट्यूमर कोशिकाओं के लिए और उन लोगों के लिए, ट्यूमर प्रगति के इन दो अलग-अलग पहलुओं के बीच भेद करने के लिए आसान नहीं है एक अधिक "विशाल", बजाय infiltrative, आक्रमण पैटर्न है। इस कारण सेयह एक समानांतर 3 डी विकास परख किसी भी निरोधात्मक या उत्तेजक एजेंटों के विशिष्ट प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है कि सुझाव दिया है। सावधान खुराक प्रतिक्रिया पढ़ाई प्रदर्शन कर रहे हैं, यह प्रसार पर प्रभाव को कम सांद्रता है कि चयन करने के लिए संभव हो सकता है। उदाहरण के लिए हम HSP90 17-ए ए जी 50% (सैनिक 50) को 12 से 3 डी विकास में बाधा 24 घंटा में और एकाग्रता से नीचे सांद्रता में पहले से ही यू-87 एमजी 3 डी ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण को रोकता अवरोध करनेवाला दिखाया है।

दूसरी ओर, इस परख के महत्व अन्य मानक आक्रमण assays (उदाहरण के लिए, फिल्टर आधारित assays या 3 डी मेट्रिसेस 1 में एकल कक्षों के आक्रमण) की तुलना में, ट्यूमर कोशिकाओं को एक जैसा होता है, अंडाकार आकृति से आसपास के मैट्रिक्स में आक्रमण करता है " इसलिए सूक्ष्म ट्यूमर "या एक" सूक्ष्म मेटास्टेसिस ", और एक ट्यूमर जन के pathophysiology के खाते में महत्वपूर्ण पहलुओं में ले जाता है। हम वर्तमान पद्धति के बारे में जानकारी प्रदान करता हैशुरू में spheroids छोड़ रहा है, और यह भी व्यक्तिगत रूप से, एकल कक्षों BMM में अधिक सुदूर क्षेत्रों तक पहुँच जाने पर जब ट्यूमर कोशिकाओं, के सामूहिक व्यवहार। इसके अतिरिक्त, ट्यूमर spheroids के भीतर कोशिकाओं हाइपोक्सिया और पोषक तत्वों के अभाव का अनुभव हो सकता है, जो जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के माध्यम से, प्रवास और आक्रमण को बढ़ावा देने के कर सकते हैं; ऐसी सुविधाओं 2D assays में अनुपस्थित रहे हैं। इसके अलावा, इस सब के लिए एक अधिक जटिल 3D परख आसानी से लक्ष्य सत्यापन और दवाओं की खोज में इस्तेमाल किया जा करने की इजाजत दी, विशिष्ट 96 अच्छी तरह से प्लेटों के उपयोग के माध्यम से एक उच्च throughput प्रारूप और नवीनतम इमेजिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में उपलब्ध है।

हम वर्तमान पद्धति ट्यूमर सेल आक्रमण के अतिरिक्त पहलुओं का पता करने के लिए आगे आवेदनों को समायोजित कर सकते हैं। विशेष रूप से, अतिरिक्त जटिलता अंडाकार आकृति अपने आप में या आसपास के मैट्रिक्स में, इस तरह के fibroblasts और / या endothelial कोशिकाओं के रूप में मेजबान कोशिकाओं, के अलावा द्वारा परिकल्पित किया जा सकता है। यह भी कठोरता के मामले में (विभिन्न सह के इस्तेमाल से न केवल संशोधित किया जा सकता हैBMM की ncentrations), लेकिन यह भी रचना के संदर्भ में (अपनाया ट्यूमर मॉडल के विशिष्ट ऊतक / अंग पर निर्भर अन्य घटकों के अलावा द्वारा: स्तन कार्सिनोमा 17) के लिए मस्तिष्क के कैंसर के 16 और कोलेजन के लिए उदाहरण के लिए, tenascin।

(Spheroids और इमेजिंग की पीढ़ी) एक समान सेट-अप भी ट्यूमर spheroids या अन्य सेल विशिष्ट organoids (उदाहरण के लिए, astrocytes के साथ एक जटिल ऊतक 12 जैसी embryoid निकायों के साथ सह-संवर्धित कर रहे हैं, जहां 3 डी में ऊतक आक्रमण का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है तंत्रिकाबंधार्बुद 18 या तहखाना गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर के लिए संस्कृतियों), लेकिन आगे काम स्वचालित छवि विश्लेषण सक्षम करने के लिए आवश्यक है।

Disclosures

सभी लेखक ब्याज की कोई प्रतिस्पर्धा संघर्ष की घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning Matrigel basement membrane matrix Corning 354234 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex basement membrane extract, PathClear Trevigen 3432-005-01 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate Corning 7007
EGF Miltenyi Biotec 130-093-825 Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C
RHB-A medium Stem Cells Inc. SCS-SF-NB-01 For diluting EGF
DMEM GIBCO 31966-021 Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum Biosera 1001/500 Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE GIBCO 12605 Cell dissociation solution
Celigo cytometer Nexcelom Bioscience n/a Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope Olympus n/a Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera Qimaging n/a Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics n/a Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0 Media Cybernetics n/a Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010 Microsoft n/a Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0 GraphPad n/a Scientific graphing and statistical software

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References

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चिकित्सा अंक 99 आक्रमण मेटास्टेसिस 3 डी ट्यूमर spheroids बाह्य मैट्रिक्स इमेजिंग उच्च throughput नशीली दवाओं के विकास।
तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर उपगोल आक्रमण परख
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Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).

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