Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll beschreibt, sauerstoffreiches ex situ Maschine Perfusion der Spenderleber Transplantate. Dieser Artikel enthält eine Schritt für Schritt-Protokoll zu beschaffen und bereiten den Lebertransplantat für Maschinendurchblutung, bereiten Sie die Perfusionsflüssigkeit, prime die Perfusion Maschine und durchzuführen, mit Sauerstoff angereicherten normothermen Maschine Perfusion des Transplantats.
Abstract
Im Gegensatz zu herkömmlichen statischen kalten Konservierung (0-4 ° C), kann ex situ-Perfusion Maschine eine bessere Konservierung von Spenderlebern. Kontinuierliche Perfusion von Organen die Möglichkeit bietet, Organqualität zu verbessern und ermöglicht ex situ Lebensfähigkeit Beurteilung der Spenderlebern vor der Transplantation. Dieses Video Artikel enthält eine Schritt für Schritt-Protokoll für Ex-situ-normothermen Maschine Perfusion (37 ° C) der menschlichen Spenderlebern mit einem Gerät, das einen Druck und Temperatur gesteuert pulsatile Perfusion der Leberarterie und kontinuierliche Perfusion der Pfortader stellt. Die Perfusionsflüssigkeit wird durch zwei Hohlfasermembran-Oxygenatoren mit Sauerstoff angereichert und die Temperatur zwischen 10 ° C und 37 ° C geregelt werden. Während der Perfusion kann die metabolische Aktivität in der Leber als auch der Grad der Schädigung durch die biochemische Analyse von Proben aus der Perfusionsflüssigkeit genommen beurteilt werden. Maschinendurchblutung ist ein sehr vielversprechendes Werkzeugum die Anzahl von Lebern, die zur Transplantation geeignet sind, zu erhöhen.
Introduction
Die aktuelle Methode der Organkonservierung in Lebertransplantation ist spülen mit und anschließende Lagerung von Spenderlebern in kaltem (0-4 ° C) Konservierungsfluid (wie University of Wisconsin Lösung oder Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat-Lösung). Dieses Verfahren wird als statisches Kühllager (SCS) bezeichnet. Obwohl die Stoffwechselrate von Lebern bei 0-4 ° C sehr gering ist, besteht immer noch die Nachfrage nach Sauerstoff 0,27 umol / min / g Lebergewebe, die bei der SCS 1 nicht bereitgestellt werden kann. Das herkömmliche Verfahren zum SCS führt daher zu einem gewissen Grad von (zusätzlichen) Verletzung des Spenderlebern. Während diese Menge an Konservierungsschaden ist nicht ein Problem in Spenderlebern von guter Qualität kann eine kritische und begrenzende Faktor bei suboptimalen Lebern, die bereits einen gewissen Grad der Schädigung im Spender erlitten werden. Aus diesem Grund werden Lebern mit suboptimaler Qualität oder sogenannten erweiterten Kriterien Donor (ECD) Leber zur Transplantation häufig das Risiko, o abgelehntf frühen Transplantatversagen wird als zu hoch zu sein. Hohe verzögerten Transplantatfunktion, primäre nicht-Funktion, und nicht-Anastomosen Gallengangstenosen (NAS) haben bei Empfängern von Lebern von der Spende nach dem Kreislauf Tod (DCD), ältere Spender oder Empfänger von Transplantaten steatotic 2 beschrieben. NAS sind eine Hauptursache von Morbidität und Mortalität nach einer Lebertransplantation. NAS kann in beiden extra- und intrahepatischen Gallengänge Spender auftreten und kann durch intraduktale Gallenschlamm und Guss Bildung 3,4 begleitet werden. Obwohl die Ätiologie von NAS wird gedacht multifaktoriell zu sein, hat Ischämie / Reperfusion Verletzungen der Gallengänge bei Transplantaterhaltung und Transplantation als eine wichtige zugrunde liegende Mechanismus 2,5 identifiziert. Transplantation eines DCD Transplantats wurde als einer der stärksten Risikofaktoren für die Entwicklung von NAS identifiziert. Die Kombination von einer Periode warmer Ischämie in einem DCD Donor Kaltischämiezeit während Organkonservierung und nachfolgende ReperfusionVerletzung im Empfänger gedacht für irreversible Schädigung der Gallenwege, die in Kombination mit einem schlechten regenerative Kapazität der Gallenwege, ergibt fibrotische Narbenbildung und Verengung der Gallengänge nach einer Lebertransplantation 2,5 verantwortlich. NAS wurden in bis zu 30% der Patienten, die eine Leber DCD 6-8 berichtet. Es ist deutlich geworden, dass die aktuelle Methode der SCS von Lebertransplantationen für eine Transplantation nicht ausreichend für preinjured ECD Lebern wie die von DCD Spender ist. Alternative Methoden nötig sind, um zu steigern und optimieren den Einsatz von ECD Lebern für Transplantationen.
Maschine Perfusion (MP) ist ein Verfahren zur Organkonservierung, die eine bessere Konservierung von Spenderorganen bereitstellen kann, verglichen mit SCS. MP kann zur Konservierung von Transplantaten ECD besonders relevant sein. Ein wichtiger Vorteil der MP ist die Möglichkeit, Sauerstoff an das Transplantat während der Konservierungsdauer bereitzustellen. MP kann bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt werden,die als hypo (0-10 ° C), subnormothermic (10-36 ° C) und normothermic (36-37 ° C), MP (NMP) klassifiziert wurden. Je nach dem für MP verwendeten Temperatur, hat die Art der Perfusionsflüssigkeit angepaßt werden und mit steigender Temperatur mehr Sauerstoff zugeführt werden sollte. Die erste klinische Anwendung von MP in menschlichen Lebertransplantation wurde am hypothermen Perfusion ohne aktive Sauerstoffversorgung des Perfusionsflüssigkeit 9,10 basiert. In Tiermodellen hat hypo oxygenierten MP (0-10 ° C) wurde gezeigt, dass schützenden Wirkungen gegen Ischämie / Reperfusion von Lebertransplantationen 11 und eine bessere Konservierung des peribiliären Gefäßplexus von den Gallengängen 12 zur Verfügung zu stellen. Subnormothermic oxygenierten MP bei 20 ° C oder 30 ° C ist auch in Tiermodellen untersucht worden, und es wurde gezeigt, um eine schnellere Genesung von Transplantatfunktion DCD Lebern bereitzustellen, im Vergleich zu 13,14 SCS. Die Machbarkeit subnormothermic Sauerstoff angereichert MP menschlicher Lebern war recständig in einer Reihe von sieben verworfen menschlichen Spenderlebern 15 gemeldet. NMP (37 ° C) ist für die Beurteilung der Transplantatüberlebensfähigkeit und Funktionalität vor der Transplantation 16,17. Darüber hinaus ermöglicht die schrittweise MP Wiedererwärmung des Transplantats vor der Transplantation, die gezeigt wurde, dass die Verwertung und Wiederbelebung des Transplantats 18 zu erleichtern.
Die Perfusionsvorrichtung im aktuellen Protokolls für hepatische Perfusion Maschine verwendet ermöglicht Dual Perfusion (über die Pfortader und die Leberarterie) mit zwei Kreiselpumpen, die einen kontinuierlichen Pfortaderflusses und eine pulsierende arterielle Strömung bereitzustellen. Das System ist druckgesteuert, so dass die automatische Regulierung der Strömung durch die Leber, in Abhängigkeit von der intrahepatischen Beständigkeit. Zwei Hohlfasermembran-Oxygenatoren ermöglichen die Sauerstoffversorgung des Transplantats, als auch für die Entfernung von CO 2. Die Temperatur kann auf Basis der beabsichtigten Art der MP (Minimum temperat eingestellt werden ure von 10 ° C). Fluss, Druck und Temperatur werden auf der Vorrichtung in Echtzeit, die eine kontinuierliche Kontrolle der Perfusion Vorgangs angezeigt. Eine neue sterile Einweg-Schlauchsatz, Behälter und Oxygenatoren für die Perfusion von jedem Transplantat (Abbildung 1) zur Verfügung.
Das Ziel dieses Artikels ist es, Video eine Schritt für Schritt-Protokoll für ex situ normothermen Maschine Perfusion des menschlichen Spenderlebern mit dieser neu entwickelten Leberperfusion Maschine bereitzustellen.
Figur 1: (A) Eine schematische Zeichnung, (B) ein Foto der Perfusion Maschine (C) eine genauere Ansicht des Oxygenators, und (D) Zentrifugalpumpe zum normothermic Perfusion von menschlichem Spenderlebern verwendet.bekommen = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde von der Medizinischen Ethikkommission (Medisch Ethische Toetsingscommissie) des University Medical Center Groningen, Niederlande zugelassen.
1. Herstellung der Perfusionsflüssigkeit
Hinweis: Das Gesamtvolumen des für normothermic Maschine Perfusion gemäß diesem Protokoll hergestellt Perfusionsflüssigkeit 2.233 ml und die gezielte Osmolarität der Perfusionsflüssigkeit 302 mOsmol / l.
- Von den Komponenten der in Tabelle 1 beschrieben Perfusionsflüssigkeit, halten Sie die menschlichen Erythrozytenkonzentrat, Frischplasma und Humanalbumin getrennt. Mischen Sie die restlichen Komponenten steril und speichern Sie die Lösung in einem sterilen Beutel für den Transport in den OP (OR). Tun Sie dies in einer sterilen Umgebung (im Idealfall eine Good Manufacturing Practice Anlage) oder in einer Sterilbank in einem Kulturraum.
| Components | Menge |
| Lunch roten Blutkörperchen (Hämatokrit 60%) | 840 ml |
| Fresh Frozen Plasma | 930 ml |
| Humanalbumin 200 g / L (Albuman, Sanquin) | 100 ml |
| Geändert parenterale Ernährung (Clinimix N17G35E, Baxter International Inc.) | 7,35 ml |
| Multivitamine für Infusion (Cernevit, Baxter International Inc.) | 7 ul |
| Konzentrierte Spurenelemente zur Infusion (Nutritrace, B. Braun Melsungen AG) | 7,35 ml |
| Metronidazol für die iv-Gabe (5 mg / ml) (Flagyl, Sanofi-Aventis) | 40 ml |
| Cefazolin 1.000 mg Kolben 5 ml Pulver zur IV-Verabreichung (Servazolin, Sandoz) | 2 ml |
| Schnell wirkendes Insulin (100 IU / ml) (Actrapid®, Novo Nordisk) | 20 ml |
| Calciumglubionat, intravenöse Lösung 10% 137,5 mg / ml (Sandoz) | 40 ml |
| Sterilem H 2 O | 51,3 ml |
| NaCl 0,9% Lösung | 160 ml |
| Natriumbicarbonat 8,4% Lösung | 31 ml |
| Heparin 5000 IE / ml für die iv-Gabe | 4 ml |
| Gesamt | 2.233 ml |
Tabelle 1: Components der Perfusionsflüssigkeit 16.
- Übertragungs menschlichen gepackten roten Blutkörperchen (840 ml), frisch gefrorenem Plasma (930 ml), Humanalbumin 200 g / l (100 ml) und die in Schritt 1.1 zu dem ODER hergestellten Lösung, um die Perfusionsvorrichtung verabreicht werden.
2. Grundierung der Perfusionsvorrichtung
- Die Komponenten der Perfusionsflüssigkeit, einschließlich der menschlichen gepackten roten Blutzellen, frisch gefrorenem Plasma, Humanalbumin und die in Schritt 1.1 hergestellten Lösung auf die Maschine über den Verbinder auf der Oberseite der Oxygenatoren und entferne alle Luftblasen aus dem Schlauch.
- Schalten Sie die Venenpumpe und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers auf dem Bildschirm. Schalten Sie dann den arteriellen Pumpe und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers auf dem Bildschirm.
- NULL Die Druckmessgeräte gegen Atmosphärendruck indem Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm. Dies stellt sicher, daß der Druck während der perfus gemessenenIon das wirklichen Druck auf der Ebene der Pfortader und die Leberarterie.
- Starten Sie die Beatmung mit Carbogen (95% O 2 + 5% CO 2) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 l / min. Der Luftstrom wird zu den beiden Oxygenatoren unterteilt werden (2 L / min pro Oxygenator), und dies sollte in einem pO 2 von etwa 60 kPa (oder 450 mmHg) in der Perfusionsflüssigkeit führen. Länger Perfusionen, ist es ratsam, getrennten Quellen von Sauerstoff und Kohlendioxid zu verwenden. Dies ermöglicht kleine Einstellungen in der O 2 / CO 2 -Verhältnis, die verwendet werden können, um den pH und pCO 2 der Perfusionsflüssigkeit einzustellen.
- Nehmen Sie eine Perfusion Probe für die Blutgasmessung 15-20 Minuten, nachdem das Gerät wurde grundiert und den pH-Wert und Elektrolyten entsprechend zu überwachen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, über 3 ml Perfusionsflüssigkeit, bevor sie die Proben zu verwerfen, da diese Flüssigkeit ist in der Umfangsrohre und nicht die Perfusionsflüssigkeit im System zu repräsentieren. Fügen Sie eine 8,4% Natriumbicarbonat sÖSUNG für Pufferkapazität, mit dem Ziel für einen physiologischen pH-Wert (7,35 bis 7,45). Fügen Sie beispielsweise 25 bis 35 ml einer 8,4% Natriumhydrogencarbonat-Lösung und den pH-Wert und Bicarbonat-Spiegel in der Perfusionsflüssigkeit durch die Entnahme von Proben für die Blutgasmessung in regelmäßigen Abständen.
3. Beschaffung und Herstellung von Spenderlebern
Hinweis: Beschaffen Sie die Orgel mit dem Standard-Technik der in situ Kühlung und spülen Sie mit kaltem Konservierungsfluid (0-4 ° C) 19. Zur Kanülierung der Arterie zu erleichtern, lassen ein Segment des supratruncal Aorta der Leberarterie (2A) befestigt ist.
- Spülen die Gallengänge mit dem Konservierungsfluid (dh, University of Wisconsin Lösung). Ligieren Cysticus mit einem chirurgischen Nahtmaterials.
- Verpacken und verstauen die Orgel in einem Standard-sterile Spenderorgan Beutel und Box mit crushed ice für die anschließende Transport zum MP-Center.
- Startdie Rückseite Tabelle Verfahren unmittelbar nach der Ankunft der Spenderleber in den Operationssaal.
- Nehmen Sie eine Probe von mindestens 10 ml des Konservierungsflüssigkeit für die mikrobiologische Untersuchung.
- Entfernen Sie die Zwerchfell-Anhänge auf dem nackten Bereich der Leber sowie alle übrigen Herzmuskel von der oberen Manschette der Hohlvene mit chirurgischer Schere.
- Präparieren Sie die Arterie und Pfortader mit Präparierscheren und Ligat Seitenäste mit chirurgischen Nähten oder Hemoclips.
- Schließen des distalen Endes des supratruncal Aorta-Segment mit einem nicht resorbierbaren monofilen Faden (zB 3-0 Prolene). Legen Sie die Arterienkanüle in das proximale Ende des supratruncal Aorta und mit Nähten (2A). Verwenden der Kanüle in der Wegwerfpackung bereitgestellt, wie vom Hersteller des Perfusionsvorrichtung geliefert.
- Legen Sie die Venenkanüle in die Pfortader und mit Nähten. Verwenden Sie die Kanüle in den dispos bereitgestelltLage Paket. Die Lebervenen bleibt uncannulated.
- Spülen Sie die Gallengang mit der Konservierungslösung. Legen Sie eine Silizium-Katheter in den Gallengang und mit Nähten.
Hinweis: Die Katheter zu tief in den Gallengang einlegen nicht, da dies zu Verletzungen der Gallen Epithels führen. - Spülen Sie die Leber mit 0,9% NaCl-Lösung über die Pfortader Kanüle wie folgt:
- Wenn das Transplantat in University of Wisconsin-Lösung als Konservierungslösung konserviert worden, spülen, die Leber mit 2000 ml kaltem (0-4 ° C) 0,9% NaCl-Lösung, gefolgt von 500 ml warmem (37 ° C) 0,9% NaCl Lösung.
- Wenn das Transplantat in Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat-Lösung als Konservierungslösung erhalten, spülen, die Leber mit 1000 ml kaltem (0-4 ° C) 0,9% NaCl-Lösung, gefolgt von 500 ml warmem (37 ° C) 0,9 % NaCl-Lösung. Der Zweck des Warm bündig ist, um einen signifikanten Abfall in der Temperatur des zu verhindernPerfusionsflüssigkeit.
- Führen Sie die warme bündig unmittelbar vor dem Anschluss der Leber zum Perfusionsvorrichtung.
HINWEIS: Halten Sie die Dauer zwischen warmen und bündig Beginn NMP weniger als 1-2 min.
| Spendereigenschaften (n = 12) | Anzahl (%) oder Median (IQR) |
| Alter (Jahre) | 61 (50-64) |
| Männlich) | 8 (67%) |
| Art des Spenders DCD, Maastricht Typ III DBD | 10 (83%) 2 (17%) |
| Body-Mass-Index (BMI) | 27 (25-35) |
| Absagegrund DCD + Alter> 60 Jahre DCD + hoher BMI DCD + verschiedene Gründe * Schwere Steatose | 5 (41%) 3 (25%) 2 (17%) |
| Konservierungslösung UW-Lösung HTK-Lösung | 6 (50%) 6 (50%) |
| Donor warme Ischämiezeit in DCD (min) | 14 (17-20) |
| Kalte Ischämie Zeit (min) | 389 (458-585) |
| Donor Risikoindex (DRI) | 2,35 (2,01-2,54) |
Tabelle 2: Eigenschaften * Donor Spender Geschichte der intravenöse Drogenmissbrauch für ein Transplantat und verlängerte Spender SO 2 <30% nach Abzug der Lebenserhaltung für ein weiteres Transplantat.. Abkürzungen: DCD, Spende nach Kreislauf Tod; DBD, Spende nach Hirntod; UW, University of Wisconsin, HTK, Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat
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Abbildung 2: (A) Bilder eines menschlichen Spendertransplantat, die auf der Rückseite Tisch und hergestellt worden ist, (B - D) wurde anschließend normothermically perfundiert. (A) Die Arterienkanüle wird in die Aorta eingeführt surpratruncal und die venöse Kanüle in die Pfortader eingeführt. Der Gallengang wird mit einer Siliciumgallenkatheter kanüliert. (B) Die Leber ist in der Organkammer mit seiner Vorderfläche nach unten und Kanülen sind mit den Rohrleitungen der Perfusionsvorrichtung angeschlossen positioniert. (C) 30 min nach dem Start der Maschine normothermic Perfusion. (D) 6 Stunden nach dem Beginn der Perfusion normothermic Maschine. Im Betrieb wird der Organkammer ist von einer transparenten Abdeckung bedeckt ist, um eine sterile feuchte Umgebung für die Leber (in diesen Abbildungen gezeigt) aufrechtzuerhalten."> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. normothermen Maschine Perfusion
- Positionieren Sie die Leber in der Organkammer mit der Vorderseite nach unten zeigt. Sofort eine Verbindung in der Leber auf die grundierte Perfusionsvorrichtung durch Verbinden der Pfortader Kanüle zum Portal Anströmrohr der Perfusion Vorrichtung und der arteriellen Kanüle zum arteriellen Zulaufrohr des Gerätes.
- Starten Perfusion sowohl auf Portal und arteriellen Seite, indem Sie den Anweisungen des Herstellers auf dem Bildschirm. Stellen Sie den mittleren arteriellen Druck bei 70 mmHg und der mittleren Portalvenendruck bei 11 mmHg.
- Nehmen Perfusionsflüssigkeit Proben alle 30 Minuten für die sofortige Analyse der Blutgasparameter (pO 2, pCO 2, SO 2, HCO 2 - und pH) und biochemische Parameter (Glukose, Calcium, Lactat, Kalium und Natrium) unter Verwendung eines herkömmlichen Blutgasanalysator . Achten Sie darauf, über 3 ml Perfusion verwerfenFlüssigkeit vor der Entnahme von Proben, da diese Flüssigkeit ist in der Umfangsrohre und nicht die Perfusionsflüssigkeit in dem System darstellen.
- Zu ergreifen, diese Proben absaugen Perfusionsflüssigkeit mit einer 1-ml-Spritze aus den Stichproben Anschlüsse, die ein Teil der Einwegschlauchsatz des Perfusionsvorrichtung sind. Für jede Probe verwenden Sie eine neue Spritze und entfernen Sie sofort alle Luftblasen aus der Spritze auf Aspiration von Perfusionsflüssigkeit. Dann legen Sie die Spritze im Blutgasanalysegerät und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers in der Bedienungsanleitung des Analysegeräts zur Verfügung gestellt.
- Sammeln von Plasma aus der Perfusionsflüssigkeit, Einfrieren und Lagerung bei -80 ° C zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase (AlkP), Gamma-Glutamyltransferase (gamma-GT), Alanin-Aminotransferase (ALT), Harnstoff und Gesamt-Bilirubin. Sammeln Plasma nach 5 min Zentrifugation der Perfusionsflüssigkeit bei 1.500 × g und 4 ° C.
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Representative Results
12 menschliche Lebern, die für die Transplantation aus verschiedenen Gründen abgelehnt wurden, wurden nach dem Erhalt informierte Zustimmung für die Forschung aus Spenderfamilien verwendet. Spender-Eigenschaften sind in Tabelle 2 unter Verwendung des in diesem Dokument beschriebenen Protokoll beschrieben. Die menschlichen Spenderlebern wurden normothermically 6 h perfundiert. Die Qualität der Lebertransplantate wurden durch Überwachung der makroskopische Homogenität Leberperfusion (- D 2A) ausgewertet. Die Hämodynamik der Lebern wurden durch Beobachten der Änderungen in der arteriellen und Portalströmen beurteilt. Eine anfängliche Erhöhung der Leberarterie und die Pfortader Ströme und anschließende Stabilisierung der Ströme wurden beobachtet, was in einer mittleren arteriellen Fluss von 256 ± 16 ml / min (Mittelwert ± SEM) und einer mittleren Pfortaderflusses von 748 ± 34 ml / min (Mittelwert ± SEM) in 6 h, was auf stabile Hämodynamik der Leber während der Perfusion (3A). BlOOD Gasanalyse des Perfusats Proben von arteriellem Perfusionsflüssigkeit gesammelt wurde verwendet, um den Status der Sauerstoffzufuhr in der Perfusionsflüssigkeit überwachen. Oxygenierung mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2) bei einem Fluß von 4 l / min führte zu einer kontinuierlichen O 2 Sättigung von 100%. 3B zeigt die Sauerstoffversorgung des Perfusionsflüssigkeit und anschließender Extraktion des Kohlendioxids in unserer Erlebnis.
Abbildung 3: Graphische Darstellung der Perfusionsparameter und biochemischen Analysen sowohl der Perfusionsflüssigkeit und Galle während 6 h normothermen Maschine Perfusion von 12 menschlichen Lebern (A) Änderungen in der arteriellen und Portal-Flow.. (B) Entwicklung der Sauerstoffversorgung Eigenschaften und pCO 2 während 6 h normothermen Perfusion. (C) KumulativeGalle Produktion während der Perfusion. (D) Steigende Konzentrationen von Bilirubin und Bicarbonat in Gallenproben während des Maschinendurchblutung entnommen. (E) Reaktionsgefäße Galle enthält aus einer repräsentativen Transplantat, was auf eine allmähliche Verdunkelung Schatten des Gallen Farbe im Laufe der Zeit. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Galleproduktion wurde als Indikator der Leberfunktion verwendet. Metabolisch funktionierende Leber produziert Galle bei NMP, was zu einer mittleren Gesamt Galle Produktion von 24,6 ± 6 g nach 6 h NMP (3C). Eine Erhöhung der Konzentration von Gesamt-Bilirubin und Bicarbonat in der Galle ist, eine Verbesserung in der Qualität des während NMP (3D, E) erzeugt Galle. Lebergewebe ATP-Gehalt als Indikator mitochondrial Funktion erhöhte sich NMP und resultierte in ATP von 30 ± 5 & mgr; mol / g Protein (Mittelwert ± SEM) nach 6 h NMP (Abbildung 4). Biochemische Analyse von Leberversagen Marker im Perfusionsflüssigkeit wie ALT, AlkP, gamma-GT und Kalium, wurde verwendet, um die Menge an Pfropf Verletzung beurteilen. Stabile Konzentrationen von Leberschädigung Markierungen reflektiert minimal Verletzung der Transplantate während der Perfusion (5A). Lactat und Glukose im Perfusionsflüssigkeit sowie Sauerstoffverbrauchs wurden zuvor 17 beschrieben. Weiterhin histologische Untersuchung von H & E gefärbten Biopsien von Lebergewebe und dem distalen Ende des extrahepatischen Gallengang gesammelt wird, wie in 5B dargestellt, C ergab keine zusätzliche Schädigung der Transplantate während normothermic Maschine Perfusion.
Abb. 4: Veränderungen in der Höhe von Lebergewebe ATP-Gehalt während der NMP Erhöhte Lebergewebe ATP-Gehalt während der NMP zeigten eine Verbesserung der Funktion der Mitochondrien. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: (A) Marker der Leber- und Gallen Verletzung und (B) Färbung von Leberparenchym und (C) die extrahepatischen Gallengang vor (0 h) und nach (6 h) Maschine Perfusion von einer repräsentativen Transplantat entnommen. (A) Stable Konzentrationen Verletzungsmarkierungen in der Perfusionsflüssigkeit angegebenen minimalen Verletzungen von Transplantaten während des Maschinendurchblutung. (B) Gut erhaltene mikroskopische Architektur arepräsentativer Lebertransplantat. (C) Histologie der extrahepatischen Gallengang (Lumen mit einem Sternchen markiert) eines repräsentativen Transplantat. Moderate biliäre Epithel-Verletzung durch teilweise Verlust der luminalen Epithel angedeutet wurde zu Studienbeginn beobachtet und dies nicht während der 6 Stunden von MP verschlechtern. Ein ähnliches Ausmaß der Gallenverletzung hat in einer Reihe von menschlichen Lebern vor der Transplantation 20 beschrieben. Peribiliären Gefäßsystem (Pfeil) und peribiliären Drüsen (Bereich innerhalb gestrichelten Linien) zeigten keine Verschlechterung der Verletzung nach normothermen Maschine Perfusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die mikrobiologische Untersuchung der Perfusionsflüssigkeit fanden keine bakterielle Kontamination zu offenbaren während NMP. In einem Fall wurde eine positive Kultur für S. epidermidis wurde von dem unmittelbar nach der Kältekonservierung gesammelten Probe erhalten. However war Kultur der Perfusionsflüssigkeit nach 6 h NMP negativ für alle Bakterien, die die Wirksamkeit der in der Perfusionsflüssigkeit verwendeten Antibiotika.
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Discussion
Dieses Video bietet eine Schritt für Schritt-Protokoll für normothermen Maschine Perfusion des menschlichen Spenderlebern mit einem Gerät, das druckgesteuerten Zwei Perfusion durch die Leberarterie und Pfortader ermöglicht. Während nach diesem Protokoll, habe technische Störungen der Perfusion Maschine nicht auf, und alle Transplantate waren gut perfundierten und gut mit Sauerstoff. Die Ex-situ perfundierten Lebern hatte stabile Hämodynamik und waren metabolisch aktiv, wie die Produktion von Gallenflüssigkeit 16,17 festgelegt.
Dies ist ein gut etabliertes Protokoll für die Maschine Perfusion des menschlichen Spenderlebern. Diese Technik weist zahlreiche Vorteile gegenüber dem herkömmlichen Verfahren des SCS 21. Maschine Perfusion bietet die Möglichkeit, Spenderleber Transplantate bei verschiedenen Temperaturen in Abhängigkeit vom beabsichtigten Endpunkt der Organkonservierung zu bewahren. Hypothermie mit Sauerstoff angereichert Maschine Perfusion bietet eine bessere Durchblutung und Wash-out der microvasculture und kann erlp, um intrazelluläre Energieinhalt durch die Stimulierung Adenosintriphosphat (ATP), die Regeneration wieder herzustellen. , Vollständige Bewertung der Transplantatüberlebensfähigkeit erfordert jedoch Perfusion bei einer physiologischen Temperatur (subnormothermic oder Normothermie). Mit zunehmender Durchblutung Temperaturen, wird die Leber metabolisch aktiver geworden und beginnen, Galle zu produzieren. Eine aktuelle Studie hat vorgeschlagen, dass Galle Produktion als Indikator der Leberfunktion kann von Vorteil bei der Ex-situ-NMP zu Transplantatüberlebensfähigkeit vor der Transplantation zu bewerten. Diese Studie zeigte, dass Galle Produktion mit dem Lebergewebe ATP-Ebene und histologischen und biochemischen Markern der Leberschädigung 17 korreliert. Diese Ergebnisse bleiben, um von klinischen Studien bestätigt werden. Obwohl Galle Produktion ist ein geeigneter potentieller Marker des Leberparenchyms Lebensfähigkeit sind Marker der Gallengang Lebensfähigkeit, die während der Ex-situ-NMP bewertet werden können noch aus. Daher ist es zur Zeit noch nicht möglich ist, vorherzusagen, whether eine Leber während NMP beurteilt wird NAS nach der Transplantation oder nicht entwickeln. Jedoch unter Verwendung dieses Protokolls, ex situ NMP ergab keine Verschlechterung der Gallengang Verletzungen während 6 Stunden NMP. Darüber hinaus hat diese Technik das Potenzial, zur Vorbehandlung des Transplantats vor der Transplantation zu ermöglichen, was zu einer verringerten nach der Transplantation Verletzungen oder Wiederauftreten von Grunderkrankungen 22.
Das optimale Fluid für die ex situ oxygenierten Maschine Perfusion von Spenderlebern ist abhängig von der verwendeten Temperatur. Die Löslichkeit von Sauerstoff in Wasser ist temperaturabhängig und die Menge an Sauerstoff, die in einer wässrigen Flüssigkeit mit steigender Temperatur 23 gelöst werden kann. Bei Verwendung niedriger Temperaturen MP kann die Menge an Sauerstoff in der Perfusionsflüssigkeit gelöst ausreichen. Jedoch bei 37 ° C ein Sauerstoffträger sollte der Perfusionsflüssigkeit gegeben werden, um genügend Sauerstoff im Transplantat bereitzustellen. Für hypo MP, einem Preservation Lösung wie Belzer Maschinen Perfusionslösung kann ausreichend sein 11. Für subnormothermic oder normothermen MP, haben komplexere Perfusion Flüssigkeiten, die auch Nährstoffe und ein Sauerstoffträger enthalten, in verschiedenen Studien 15,16 verwendet. In unseren Studien über normothermen MP, die wir verwendet haben ABO und Rhesus Matched roten Blutkörperchen aus dem lokalen Blutbank als Sauerstoffträger 16 verpackt. Es bleibt zu prüfen, ob ähnliche Ergebnisse mit künstlicher Hämoglobin-basierte Sauerstoffträger wie Hemopure oder Hemarina erhalten werden.
Die kritischsten technischen Aspekte für die erfolgreiche Perfusion von menschlichen Lebern: vollständig sichern die Kanülen in der Pfortader und supratruncal Aorta-Segment, um alle kleinen Seitenzweige zu ligieren, um ein Austreten der Perfusionsflüssigkeit, die die Druck- und Strömungs Vorschriften der stören könnten, zu vermeiden, Maschine, um eine physiologische Umgebung für die Leber vor allem durch Einstellen des pH einer aufrechtzuerhaltennd Elektrolytkonzentrationen der Perfusionsflüssigkeit und die Sterilität der Perfusion Umgebung aufrechtzuerhalten.
Aufgrund technischer Beschränkungen kann das Perfusionsvorrichtung in dem beschriebenen Protokoll die Temperatur der Perfusionsflüssigkeit unter 10 ° C nicht verringern. Obwohl dies als eine Beschränkung ist, liefert es nicht wirklich ein Problem bezüglich Ischämie. Der Grund dafür ist, daß mehr als ausreichende Mengen an Sauerstoff zu der Perfusionsflüssigkeit durch die beiden Membranoxygenatoren ungeachtet der Temperatur zugeführt werden. Ein Vorteil ist, dass die Temperatur kann leicht während der Perfusion Periode, die allmähliche Wiedererwärmung des Spenderleber können eingestellt werden. Eine kürzlich durchgeführte Studie in Schweineleber hat wichtige Vorteile allmähliche Wiedererwärmung vor normothermic Reperfusion unter Verwendung der gleichen Vorrichtung wie hier beschrieben, 18 gezeigt.
Die Möglichkeit, Spenderlebern bei unterschiedlichen Temperaturen durchströmen und die Möglichkeit des Hinzufügens von Extra agents in die Perfusionsflüssigkeit während Organperfusion bieten die Möglichkeit zur Bewertung und Verbesserung Organqualität vor der Transplantation. Daher kann dieses Verfahren wesentlich erhöhen die Anzahl an verfügbaren Organen für die Transplantation.
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Disclosures
Die Autoren des Manuskripts habe keinen Interessenkonflikt offen zu legen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde finanziell durch Zuschüsse von Innovatief Actieprogramma Groningen (IAG-3), Jan de Cock Kornelis Stichting und Tekke Huizingafonds vorgesehen, die alle in den Niederlanden unterstützt. Wir sind dankbar für alle niederländischen Transplantation Koordinatoren für die Ermittlung der potentiellen verworfen Leber und informierte Zustimmung erhalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Assist | Organ Assist | OA.Li.Li.140 | Perfusion device |
| Liver Assist disposable package | Organ Assist | OA.Li.DP.540 | Disposable set and cannulas |
| Meredith No.8 | Vygon Nederlands B.V. | 1362082 | Bile duct cannula |
| Human albumin 200 g/L / ALBUMAN | Sanquin | 15522598 | 100 ml |
| Modified parenteral nutrition | Baxter Nederland B.V. | N14G30E | 7.35 ml |
| Multivitamins for infusion / CERNEVIT | Baxter International Inc. | 9800927 | 7 μl |
| Concentrated trace elements for infusion / NUTRITRACE | B. Braun Melsungen AG | 14811332 | 7.35 ml |
| Metronidazole 5 mg/ml | Baxter Nederland B.V. | 98181882 | 40 ml |
| Cefazoline / SERVAZOLIN | Sandoz B.V. | 15611337 | 2 ml |
| Fast acting insulin | various vendors | 20 ml | |
| Calcium glubionate, intravenous solution 10%, 137.5 mg/ml | Sandoz | 97038695 | 40 ml |
| Sterile H2O | Fresenius Kabi Nederland B.V. | 98084453 | 51.3 ml |
| NaCl 0.9% | Baxter Nederland B.V. | 15262510 | 160 ml |
| Heparin 5,000 IE/ml for i.v. administration | LEO Pharma B.V. | 98026178 | 4 ml |
| Sodium bicarbonate 8.4% | B. Braun Melsungen AG | 97973874 | The amount depends on the pH |
| Packed red blood cell (in SAGM) | Blood bank (Sanquin) | N0012000 | 750 ml |
| Fresh frozen plasma | Blood bank (Sanquin) | N04030A0/N04030B0 | 900 ml |
References
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- op den Dries, S., Sutton, M. E., Lisman, Y., Porte, R. J. Protection of bile ducts in liver transplantation: Looking beyond ischemia. Transplantation. 92 (4), 373-379 (2011).
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