Summary
Анализ сократительных свойств химически кожей или проницаемыми, скелетных мышечных волокон предлагает мощные средства, с помощью которых для оценки функции мышц на уровне одной мышечной клетки. В этой статье мы опишем действительный и надежный способ для подготовки и тестирования проницаемость скелетных мышечных волокон в пробирке.
Introduction
Основная функция скелетных мышц является создание силы. Мышцы сила вызвала в естественных условиях через сложную последовательность событий, которая включает двигатель нервные потенциалы действия, нервно-мышечную передачу, мышечное волокно потенциалы действия, выпуск внутриклеточного кальция и активацию системы регулирования и сократительных белков. Поскольку формирование сил является конечным результатом этой последовательности, дефицит силы могут быть вызваны отказа одного или нескольких отдельных этапов. Основной особенностью проницаемость подготовки волокна, что он устраняет большинство шагов, необходимых для генерации силы в естественных условиях, только с нормативными и сократительных функций, связанных с миофибриллярных аппарат остальные. Следователь предполагает контроль за доставкой активации кальций и энергию (АТФ), и награжден упрощенной системе, что позволяет оценить изолированных нормативных и сократительных структур в родном сотрудничествеnfiguration. Измерения силы, использующие проницаемыми скелетных мышечных волокон, таким образом, ценный при оценке изменений в мышечной функции, наблюдаемой в естественных условиях. Например, мы использовали эту технику, чтобы охарактеризовать сила генерирующих мощностей волокон из миостатинового дефицитных мышей 1 и оценить причину постоянной мышечной слабости выставлены следующие хронические вращающей манжеты слезы 2,3.
Современные проницаемыми методология волокна можно проследить начале влиятельных исследований 4,5 и в настоящее время используется в ряде исследовательских групп. Хотя методы были описаны в литературе, они еще не были представлены в видеоформате. Цель этой статьи заключается в иллюстрации обновленный, достоверной и надежной техникой для измерения максимальной силы генерирующих мощностей отдельных волокон из химически проницаемыми скелетных мышц образцов. Для этого, отдельного сегмента волокна (именуемые здесь как ̶0; волокна ") извлекают из заранее проницаемыми пучка волокон и помещают в экспериментальной камере, содержащей спокойного решение, отличительной чертой которых является концентрация кальция, что <10 нМ. Затем волокно прикреплен одним концом к силовым-преобразователя и на другом конце с длиной-контроллера. С волокном, в котором в оптимальной длины саркомера, он переносится на активирующего раствора, имеющего концентрацию кальция достаточной, чтобы вызвать максимальную активацию и, таким образом, максимальное изометрическое сокращение силы. Данные Force приобретаются, сохраняются и анализируются с помощью персонального компьютера.
Protocol
Все процедуры, связанные с животного или человека предметы должны быть выполнены в соответствии с соответствующими руководящими принципами, правилами и регулирующими органами. Мичиганский университет комитета по использованию и уходу за животными (UCUCA) и Мичиганского университета Медицинского центра Institutional Review Board утвердил все животное и человека действия, описанные в этой статье.
1. Убедитесь, Пройдя и хранение маточного раствора
Примечание: Окончательные объемы, указанные в следующих инструкциях можно масштабировать вверх или вниз по желанию.
- В 1000-мл стакан добавляют 800 мл деионизированной воды (ASTM тип 1). Поддержание нежный ажиотаж, добавить все соединения, перечисленные в таблице 1 в деионизированной водой и дайте им раствориться.
Соединение Желаемый Конц. (М) Формула Вес (г / моль) Добавить в 1 л (г) </ TR>К-пропионат 0,250 112.17 28,040 Имидазол 0.040 68.08 2.720 ЭГТА 0,010 380,40 3.800 MgCl 2 6H 2 • О 0,004 203,31 0,813
Таблица 1: Анатомический и хранение маточного раствора компонентов.
- Довести до конечного объема 1000 мл деионизированной воды. Следует отметить, что нет необходимости рН раствора в данный момент. Хранить исходный раствор при 4 ° С.
2. Убедитесь, решение для хранения
- Чтобы сделать 200 мл раствора для хранения, начинаются с 100 мл рассечения и хранение маточного раствора в 250 мл химический стакан. Добавить достаточно Na 2 H 2 ATP принести окончательное аденозинтрифосфат (АТФ) концентрация до 2 мм. Довести до конечного объема 200 мл глицерина. Доведения рН до 7,00 с помощью гидроксида калия (KOH). Храните решение для хранения при -20 ° С.
Примечание: Из-за вязкой природы глицерина это может быть трудно точно распределить по объему. Из-за этого, мы, как правило, добавляют глицерин по весу (100 мл глицерина весит примерно 126 г).
3. Сделайте Пройдя Решение
- Чтобы сделать 200 мл раствора рассечения, начинаются с 100 мл вскрытии и хранения маточного раствора в 250 мл химический стакан.
- Добавьте достаточное Na 2 H 2 ATP довести конечную концентрацию АТФ до 2 мм. Регулировка рН до 7,00 с помощью КОН. Доведите до конечного объема 200 мл с помощью деионизированной воды. Аликвоты в объемах 2,5 мл и хранят при -80 ° С.
4. Сделать Пройдя решение с Бридж 58
Примечание: Бридж 58 неионных моющих средств, что нарушает (permeabilizes) бислоев.
<ол>5. Убедитесь, тестирование решения
Примечание: Ниже взято из Moisescu и Thieleczek 1978 (6). См Обсуждение в дополнительных комментариях по подготовке тестирования решений.
- Подготовьте три отдельных 1000 мл стаканы помечены "Расслабляющий", "Pre-активирующий" и "Активация". Добавить 400 мл деионизированной воды на каждую мензурку.
- Добавить соединений, указанных в таблице 2 в соответствующий химический стакан и затем нагреть решения между 70 ° C и 80 ° C. Поддержание температуры раствора 70-80 ° С в течение 30 мин при непрерывном перемешивании.
Примечание: температура 70-80 ° C помогает в Elimiнации угольной кислоты, образованный взаимодействием карбоната кальция с EGTA в активирующего раствора. В раствор отдыха и предварительно активации растворы обрабатывают таким же образом, как и активирующим раствором, чтобы обеспечить согласованность.
| РАССЛАБЛЯЮЩИЙ РЕШЕНИЕ | PRE-активизирующий раствор | АКТИВАЦИЯ РЕШЕНИЕ | |||||
| Соединение | Формула Вес (г / моль) | Требуемой концентрации (мМ) | Обязательно Масса (г) | Требуемой концентрации (мМ) | Обязательно Масса (г) | Требуемой концентрации (мМ) | Обязательно Масса (г) |
| HEPES (кислота) | 238,30 | 90,0 | 10,724 | 90,0 | 10,724 | 90.00 | 10,724 |
| MgO | 40.31 | 10.3 | 0,208 | 8.5 | 0,171 | 8.12 | 0,164 |
| ЭГТА (кислота) | 380,40 | 52,0 | 9,890 | 52.00 | 9,890 | ||
| HDTA (кислота) | 348,36 | 50,0 | 8,709 | ||||
| СаСО 3 | 100.10 | 50.00 | 2.503 | ||||
Таблица 2: Relaxing, предварительно активирующий и активирующие компоненты решения.
- Охлаждают раствор до комнатной температуры и добавить достаточное NaN 3 / KOH до конечной концентрации NaN 3 до 1 мм.
ВНИМАНИЕ: NaN 3 (азид натрия) является ядовитым. Обратитесь к MSDS химических До установки этого химического вещества.- Чтобы сделать 100 мл 100 мМ раствора азида натрия, добавляют 0,65 г NaN 3 до 10 мл 1 N КОН. Регулировка до конечного объема 100 мл деионизованной воды.
- Доводят рН до примерно 7,10 с использованием КОН.
- Следующим шагом 5.4 добавить достаточное Na 2 H 2 ATP довести конечную концентрацию АТФ до 8 мм и достаточную Na 2 CRP до конечной креатина phosophate (CRP) концентрации 10 мМ.
- Доведите каждый раствор до конечного объема 500 мл с использованием деионизованной воды. Холод или тепло решения до температуры, при которой будет выполняться эксперименты, затем с помощью КОН, чтобы довестирН 7,10 при поддержании этой температуры.
- Добавить отдыха раствор в химический стакан, содержащий предварительно активирующим раствором, так что конечная предварительно активации раствор 1 часть отдыха раствора в 500 предварительной активации раствора. Аликвоты в объемах 2,5 мл и хранят при -80 ° С.
6. Сделайте Шовный Loops
- Начните с цепи нестерильной USP 10-0 мононити нейлона шва.
- Используйте пинцет, чтобы создать цикл с использованием нити сверху вниз технику двойной узел. Уменьшите узел в размере до 750 мкм диаметром. Диаметр петли можно оценить под микроскопом с помощью окуляр картографической сетки маркировку.
- Используйте microdissecting ножницы, чтобы удалить лишнюю нить, оставив только петлю и малых (500 мкм) хвосты по обе стороны. Пример готовой петли показан на рисунке 1.
- Повторите шаги 6,2-6,3 до 4 используемые петли были сделаны. Магазин петли в силиконового эластомера покрытием петря блюдо для использования в будущем.
Примечание: Четыре шовные петли требуется для каждого тестируемого волокна.
7. Пакет Образец
Примечание: Следующие шаги описывают процедуру вскрытия оригинальный образец на более мелкие экспериментальных "пучков", из которого отдельные волокна в конечном счете быть извлечены и проверены. Во все времена образец следует относиться с осторожностью. Для целей этого описания, инструкции будут даны как если исследователь правша.
- Получить образец интерес и перенести его на объекте, где рассечение состоится.
Примечание: Методы биопсии будет варьироваться в зависимости от экспериментальной модели и дизайна исследования. Где это возможно, мышцы перфузии не следует поддерживать вплоть до момента проведения биопсии. - Если образец должен быть передан между сайтом сбора и рассекает сайта, транспортировать его в пробирку, содержащую охлажденный раствор при поддержании рассекает на льду.
- Подготовьте 5 см силиконового эластомера покрытием Петри с охлажденной решения рассекает и 2:58 насекомых монтажных штифтов (диаметр 100 мкм, нержавеющая сталь).
- Перенести пробу в чашке. Убедитесь, что образец остается под водой, добавив больше рассекает решение, если необходимо.
- Проверьте образец под микроскопом и манипулировать ею, чтобы выровнять продольные оси волокна к правому плечу исследователя (рисунок 2). Затем закрепите образец к блюду, закрепив в углах.
Примечание: Используйте любой оставшейся соединительной ткани, якорь точки в это время, так как это будет максимально использовать образец и сохранения целостности волокна. Пучок может быть прикреплены в небольшое напряжение, чтобы помочь в определении прибыли между волокнами. - С пинцетом в левой руке и microdissecting ножницы в правой, начинают осторожно рассекает связку вдоль продольных краев между волокнами
Примечание: в зависимости от егоОбщая длина, дополнительно рассекают связку в многочисленных небольших пучков. - Убедитесь, что размеры пучка измерения примерно 0.5-1 мм в ширину и ≥3 мм в длину. Оценить размеры с помощью микроскопа с координатной сетки разметки в окуляр, или путем размещения линейку под блюдо.
- Удаляют любую ткань, которая пострадала от щипцов или штифтов в результате процесса вскрытии.
- Повторите процесс, пока достаточное количество пучков не были рассечены или пока образец был исчерпан.
Примечание: количество пучков, которые могут быть получены, будет зависеть от многих факторов, включая размер и состояние исходного образца, морфологии мышц, и от мастерства исследователя.
8. проницаемыми волокна
- Перенесите пакеты из рассекает раствора в пробирку, содержащую 2,5 мл свежего, охлажденного, рассекает раствора неионогенного моющего средства «Бридж 58 'добавил(0,5%, вес / объем). Инкубируют на льду в течение 30 мин при периодическом, осторожном встряхивании. Убедитесь, что пучки оставаться под водой в течение инкубации.
- В конце 30-минутной инкубации, передачи пачки во флакон, содержащий свежий раствор рассекает (не Brij 58) и перемешивают осторожно и кратко, чтобы удалить остатки моющего средства.
9. Подготовьте Связки для хранения
- Передача пучки во флакон, содержащий охлажденное решение для хранения и инкубируют в течение ночи при 4 ° С.
10. Храните Связки
- На следующий день, подготовить ящик для хранения, способный выдерживать -80 ° C, с достаточно отдельные 0,5 мл винт крышки конические трубы, чтобы вместить всех пучки, полученные в процессе рассечения (одно расслоения на пробирку). Каждый коническую трубку должны быть заполнены с 200-400 мкл свежим раствором для хранения.
- Перевести пучки в отдельности меченых конических труб. Убедитесь, что пакет не придерживалсясторона конической трубе или плавающие на поверхности раствора. Крышка конические трубки и не хранить образцы при -80 ° С до дня испытаний.
11. Подготовка экспериментальной установки
Примечание: на заказ аппарат состоит из стадии, что дома контроллера длина и датчик силы, движущейся системе камеры и рассечение микроскоп 10X. Микрометр привод установки позволяют для точного манипулирования крепления волоконно поверхностей. Шаблоны лазерной дифракции используются для оценки длины саркомера. Данные, полученные в ходе экспериментов записывается на персональном компьютере. Обратитесь к рисунку 3 для аннотированных изображений экспериментальной установки.
- Оттепель один флакон каждый из спокойного, пре-активирующих и активирующих растворов и поддерживать на льду. Обратите внимание, что АТФ и ГОС лабильные соединения, которые должны быть сохранены при низких температурах.
- Подготовка микроскопа, тестирование аппарат и связанное компьютер для использования. Заполните первый экспериментальный камеру с отдыха решения. В нашем аппарате, первая камера содержит призмы, которые позволяют исследователь сфотографировать волокно со стороны. Заполните вторую экспериментальную камеру с раствором предварительно активирующего и третье активации решение.
- Отрегулируйте температуру таким образом, чтобы дисплей термометр-камеры считывает 15 ° C. Автор двух подготовленные шовные петли на поверхностях из нержавеющей стали крепления, проходящих от обоих форс-преобразователя и длины-контроллера (рис 5А).
12. Выписка проницаемыми для одиночных волокон
- Оттепель расслоение интересов, и передать в силиконовый эластомер-покрытием чашке Петри с свежие, охлажденные, расслабляющий решения. Закрепите пучок с булавками на любом конце и убедитесь, что он погружен в воду.
- Использование щипцов, держитесь волокно на одном конце и начать плавно его извлечения вдоль его продольной оси.
Примечание: сжатие ущербконец волокна, вызванного щипцов не относятся в это время, так как свойства сократительные в этой области не будет проверяться. Следует, однако, соблюдать осторожность при извлечении волокна из пучка, так как спайки между волокнами и внеклеточного матрикса может привести к чрезмерному напряжению, в конечном счете, приводит к растянуть-индуцированного повреждения. Следует отметить, что значительные различия существует среди мышц в той степени, в которой волокна прилипают к окружающим внеклеточным матриксом. Волокна, которые подозреваются были повреждены таким участке должны быть отброшены. - Используйте лезвие бритвы или скальпель, чтобы изменить кончик пипетки, как показано на рисунке (4). Введем волокна в наконечник вместе с небольшим количеством отдыха раствора. Передача одного волокна из силиконового эластомера-покрытием чашке Петри в экспериментальной камере, содержащей раствор спокойный.
13. Установите Одноместный волокна
Примечание: шаг за шагом depictiна можно рассматривать на рисунке 5.
- Руководящие осторожно пинцетом удалите волокна от кончика пипетки и привязать его к длине-контроллера (слева) с использованием первого шва петлю.
- Используйте один, плавное движение при затягивании петли с щипцами. Убедитесь, что равны и противоположны напряжение прикладывается к обеим сторонам шва.
- Первый контур должны быть привязаны около 1 мм до 2 мм от конца поверхности крепления Длина-контроллера.
- Манипулирование другой конец волокна в направлении форс-преобразователя (справа) и закрепите волокно используя ту же процедуру. Удалите излишки нити с помощью microdissecting ножницы (рис 5в).
- Поместите волокно под небольшим количеством напряженности путем увеличения расстояния между длиной-контроллера и датчиков силы-оружия, используя координаты х микрометра диск (рис 3а).
- Автор второй петлю первой и закрепить волокнов точке в пределах 0,2 мм от конца поверхности крепления сила-преобразователь (рис 5D).
- Удалите излишки нити с помощью microdissecting ножницы.
- Процесс прикрепления волокна может привести к потере раствора из камеры. При необходимости добавить больше спокойного решение для обеспечения поверхности раствора плоская (ни вогнутой, ни выпуклой). Плоская поверхность имеет важное значение при оценке длины саркомера, используя лазерной дифракции.
- Выравнивание волокна параллельно боковым стенкам экспериментальной камере, регулируя положение длины контроллер в направлении оси у.
- Рассмотрите волокна с использованием призмы вид сбоку и регулировать положение длины-контроллера в направлении оси до тех пор, пока волокна параллельна полу камеры.
Примечание: позиционирование волокон параллельно полу камеры может быть достигнуто без камеры призм, сосредоточив внимание в первую очередь на одном конце волокна и ткурица, без регулировки фокуса микроскопа, в результате чего другой конец волокна в фокусе, используя его ось г микрометра диск. - Если волокно в любом случае искаженное, скручены или повреждены в результате процесса монтажа, волокна должны быть отброшены, и новое волокно прилагается.
14. Установить Оптимальное саркомера Длина
- Когда волокна правильно выровнены в камере, вставьте калиброванный целевой экран на передней поверхности микроскопа и выровняйте его по первой экспериментальной камере.
Примечание: Целевое экран откалиброван с использованием стандартного решетки уравнение, λ = sinθ SL, где SL является длина саркомера, θ представляет собой угол дифракции между 0 ° и 1 ° дифрагированных пучков и λ является длиной волны лазера. - Включите лазера и регулировки положения стадии таким образом, что лазер проходит через центр волокна.
ВНИМАНИЕ: Концентрированный свет лазера может быть повреждение тО зрение. Ни в коем случае, чтобы визуализировать волокна под микроскопом, когда лазер включен. - Расположите слой с относительно лазерного луча дифракция лазерного света и наблюдать интерференционную скороговоркой на калиброванной целевой экране (рисунок 6). Выключите свет, чтобы представить себе эту картину более четко.
Примечание: Если, с правильным позиционированием лазерного луча, никакой интерференционной картины не наблюдается, это говорит о том, что миофибриллярные компонента волокна являются аномальными / поврежден и что волокна должны быть заменены на свежую. - Чтобы установить саркомера длина, увеличить или уменьшить натяжение волокна с использованием длины контроллера X-оси микрометра диск до желаемого интервала дифрагированного света не наблюдается на целевом экране.
Примечание: оптимальная длина саркомера волокна, будет зависеть от вида животного, из которого был получен образец. Длина саркомера 2,7 мкм обычно считается оптимальной, когда ослыпеть волокна из ткани 7,8 человека. - После оптимальная длина саркомера был установлен, измерить расстояние между двумя сокровенные швов. Это наиболее легко сделать с помощью цифровой дисплей на диске микрометра, который управляет ось х движение камеры. Расположите камеру таким образом, что вертикальное поперечное волосы окуляра выравнивается по внутренней границе внутренней шва и нулю цифровой дисплей на микрометра диск.
- Перевести этап вдоль оси Х относительно микроскопом до достижения другой самый внутренний шов. Цифровой дисплей укажет длину волокна. Это значение должно быть записано как длина волокна, L ф.
Примечание: Следует иметь в виду, что расстояние между двумя швами внутренность определит функциональная длина сократительной ткани оценивается. Следователь должен стремиться к согласованности в этом измерении (т.е. L F) в течениесерия экспериментов.
15. Оценка площадь поперечного сечения (CSA)
- Поддержание волокна в L F и использовать микроскоп монтажа камеры для захвата большом увеличении изображение центральной части волокна из верхней и боковым видом. Побочные просмотр изображений может быть захвачен с помощью призмы, встроенный в сторону камеры.
Примечание: При переключении между верхней и боковым видом важно для перемещения микроскопа только в направлении у, чтобы гарантировать, что два изображения "в регистре" и, следовательно, показывают две различные точки зрения того же сечении волокна. - Получение измерения в это время, чтобы нормализовать абсолютное силы позже в исследовании. Способы получения этих измерений описаны ниже и проиллюстрированы на фигурах 7А и 7В.
16. вызывают изометрическое сокращение
Примечание: В то время как данные, созданные в ходе этих экспериментовс может быть собрана и интерпретировать без использования компьютера, программного обеспечения, что позволяет для приобретения, отображения, хранения и анализа ответов силовых выгодно. Заказ в LabVIEW программное обеспечение, созданное нашей лаборатории позволяет эти функции, а также возможность создавать "движения поездов", которые регулируют действия длины-контроллера во время эксперимента.
- Убедитесь, что температура спокойного предварительной активации и активирующие растворы стабильны при 15 ° С.
- Используйте программное обеспечение управления камеры для перемещения волокна в камеру, содержащую предварительно активирующий раствор и инкубировать там в течение 3 мин.
Примечание: перед активацией раствор слабо забуференный для Ca 2+, что приводит к очень быстрой активации и силы развития при введении волокна к активирующим раствором. - С 10 сек, оставшийся в растворе до активации и длины волокна, поддерживаемой при L F, установить в нуль FOУровень RCE в экспериментальной записи.
Примечание: Движение "Найти Force нуля" от длины-контроллера показывает уровень силы-преобразователь, который соответствует нулевому силы (то есть волокна кратко становится слабину в результате движения). Пассивный сила разница между этой нулю, а уровень силы незадолго до преобразователя обнуления движения. - В конце 3 мин, перемещения волокна в камеру, содержащую активирующий раствор и обеспечить максимальную изометрической силы развивать, о чем свидетельствует плато в силу, что предшествует быстрый рост.
- После достижения максимальной изометрической силы, использовать длину-контроллер, чтобы определить выход силовой преобразователь, который соответствует нулевому силы в камеру, содержащую активирующий раствор.
Примечание: Это необходимо потому, что выходной силовой преобразователь, который соответствует нулевому силы, в общем, отличается для каждого раствора заполненные камеры. - После достижения второй силы плateau, вернуть волокна в камеру, содержащую расслабляющей решение. Тестирование завершено. Чтобы проверить несколько волокон во время одной сессии аспирации все решения и добавлять новые, охлажденные решения.
Примечание: велосипедные протоколы Бреннера следует учитывать при выявлении максимальных сокращений в течение длительного периода времени. Этот протокол был показан, чтобы сохранить структурные и механические свойства в максимально активированного волокна 9.
Representative Results
Здоровые, химически проницаемость отдельных волокон должно появиться однородными по форме и имеют последовательное расстояние исчерченности, если смотреть под большим увеличением. Волокна, которые являются негибкими, когда манипулируют с помощью пинцета или имеют очевидные структурные повреждения должны быть отброшены.
Большом увеличении цифровые изображения, полученные на этапе 15, анализируют на 5 измерений парных диаметр вдоль средней части волокна. Волоконно CSA оценивается в предположении эллиптическое поперечное сечение и усреднение 5 отдельных измерений CSA, как показано на фиг.7А. 7В также служит для иллюстрации того, как размеры волокон в одном окне может быть значительно отличается по сравнению с парными размеры в другой точки зрения (т.е. поперечного разделы не являются, в общем, круглый).
Представительства следы силу с человека медленных и быстрых волокон приведены на рисунках 8A и 8B, соответственно. Трансформате выход форс-преобразователя приобрела во время испытания и преобразуется в усилие (MN) с помощью сбора данных и программного обеспечения для анализа (LabVIEW). Рисунок 9 иллюстрирует подход, используемый для оценки максимальной активной силы (F о), который рассчитывается путем вычитания Усилие, необходимое для поддержания волокна при оптимальной длине саркомера, а в расслабленном состоянии (пассивную силу, F P), с наибольшей силой изометрической разработанной во максимальной активации волокна (полная сила, F T). С выхода силового-преобразователя, который соответствует нулевой силы, в общем, отличается для каждого из различных камер купальных кратко ослабить волокно как в предварительной активирующей и активации решения для захвата уровень нулевой силой в Экспериментальная запись. Нормализация максимального активного волокна силы CSA используется для генерации более информативный значение удельной силы (SF O). Потому что учитывает CSA волокна, научная О
Типичные характеристики здоровых, взрослых волокна из Клафлин и др. 2011 10 для человека, Mendias др. 2011 1 для мыши и Gumucio др. 2012 2 для крыс подробно в таблице 3. Все данные, представленные в таблице 3, были получены с использованием Методы, описанные в этой статье.
| Человек (Латеральной широкой) | Мышь (EDL) | Крыса (Подостная) | ||||
| Мужчина | Женщина | Мужчина | Мужчина | |||
| Тип 1 | Тип 2а | Тип 1 | Тип 2а | (Не набрали) | (Не набрали) | |
| CSA (мкм 2) | 4880 - 6900 | 5270 - 8380 | 3870 - 5470 | 4010 - 5610 | 1850 - 3080 | 5290 - 8010 |
| Ф О (MN) | 0.79 - 1.17 | 1.02 - 1.54 | 0,64 - 0,97 | 0.71 - 1.07 | 0,14 - 0,25 | 0.55 - 0.97 |
| мП о (кПа) | 142 - 182 | 165 - 210 | 156 - 193 | 172 - 214 | 67 - 94 | 102 - 131 |
| N | 129 | 160 | 149 | 207 | 37 | 94 |
Таблица 3. Типичные характеристики здоровых, взрослых волокон из человеческого латеральной широкой 10 мышь разгибатель большого пальца 1 и крысы подостная 2 мышцы. Оптимальные длины саркомера были установлены на уровне 2,7 мкм для человека волокон 7,8 и 2,5 мкм для обоих мыши (36, 37) и крысы волокна (38). Диапазоны Экспериментальное L F (25-й и 75-й квартили) были 1.39-1.73 мм, 1.17-1.53 мм и 1.32-1.59 мм для человека, мыши и крысы соответственно. Диапазоны, приведенные указать 25-й и 75-й квартили и п количество волокон испытания.
Наиболее распространенные проблемы, возникшие в ходе тестирования включают в себя скольжение шов петля, в результате чего сила RESPONSе с "поймать", такие, как показанные на фиг.10А, и частичным или полным разрывом толщины волокна, что приводит к реакции силы, которая возвращает к резко или (разрыве) нулю, а волокна по-прежнему погружен в раствор активации (фиг.10В). Если скольжение, разрыв или разрыв происходит во время эксперимента, волокна должны быть отброшены, и данные исключены, хотя поддержание запись отказов волоконно также может быть информативным 11. Еще одним негативным результатом, который можно встретить в преждевременная активация волокна в то время как в предварительной активации раствора (рис 10С). Частичное активации в предварительно активирующей решения предполагает значительное кросс-а загрязнение (т.е. непреднамеренного увеличение концентрации кальция в предварительно активирующей хорошо). В этом случае, все ванны должны быть отсасывают и хорошо промывают деионизированной водой. Сушка разделительные поверхности между камерами также рекоменДед, как влаги или конденсата в этих областях может привести к влагу из раствора между ваннами. Решение включить или исключить данные будут в конечном итоге зависеть от экспериментального внимания и должны, таким образом, должна рассматриваться при разработке исследования.
Рисунок 1: Шов петля (10-0 мононити нейлона шов).
Рисунок 2:. Связка рассечение пинцет в левой руке, микродиссекции ножницы в правой руке. Красная линия указывает на благоприятный ориентацию запястья и ножниц с продольным осям волокон.
Рисунок 3: (Б) Длина-контроллер. (С) группа-преобразователь. (D) Источник света. (Е) Длина-контроллер XYZ микрометра привод с цифровым дисплеем. (Е) микрометра привод с цифровым дисплеем. (Г) Силы преобразователь XYZ микрометра диск. (Ч) Платформа для калиброванного целевой экране лазерного дифракционного. (Я) Виброизоляция стол. (Б) Крупным планом экспериментальных камер. Поверхность (J) привязанность нержавеющей стали, проходящий от длины-контроллера. Поверхность (к) привязанность нержавеющей стали, проходящий от форс-преобразователя. (Л) вид сбоку призмы. (М) Корпус для термоэлектрических охлаждающих модулей. (П) термопары для отчетности камеры тэmperature.
Рисунок 4: Измененный 100 мкл наконечник пипетки, используемый для передачи волокна из рассечение блюдо экспериментальной камере.
Рисунок 5:. Монтаж одного волокна на экспериментальной установки () Подготовленные петли шовные резьбой на поверхности из нержавеющей стали крепления. (Б) волокна переносили в экспериментальной камере. (С) Волоконно якорь на поверхности из нержавеющей стали крепления на первой паре шовных петель с избытком шва удаляется. (D) Вторая пара шовных петель резьбовых поверх первых петель шва и связаны на месте.
Рисунок 6: саркомера длина оценивается проекции рисунком лазерной интерференционной на калиброванной целевой экран (а) лазерного источника.. (Б) Зеркало. (С) Целевая экран. (D) Лазерная интерференционная картина.
Рисунок 7: (а) Определение площади волокна поперечного сечения по оптимальной длины саркомера (человек = 2,7 мкм). Предполагая, эллиптическим поперечным сечением, CSA рассчитывается для каждого из пяти местах вдоль волокна средней части и в среднем из пяти отдельных измерений сообщается как волокна CSA. 2а представляет верхний диаметр вид и одна ось эллипса, 2b представляет собой боковой вид диаметр и другая ось эллипса. (Б) Типичные волокна изображения, иллюстрирующие каждый из измерений пяти соответствующего диаметра, принятых в верхней и боковой проекции.
Рисунок 8: Типичные следы силу с здорового человека латеральной широкой мышечных волокон () Тип 1 волокно (CSA: 5710 мкм 2, F O: 0,89 мН и SF O: 156 кПа).. (Б) Введите 2а волокна (CSA: 9510 мкм 2, F O: 1,66 мН и SF O: 174 кПа). Волоконно миозина типа тяжелой цепи была определена путем использования электрофоретического разделения и окрашиванием серебром методов 22.
OAD / 52695 / 52695fig9.jpg "/>
Рисунок 9: Расчет максимальной активной силы (F O) () Расширенное представление ответа волокна силы во время затишья вызывающие движения длины-контроллера, начатого в предварительной активации решения.. F P это усилие, требуемое, чтобы поддерживать длину саркомера 2,7 мкм с волокном в состоянии покоя. (Б) Расширенное вид длины контроллера вялый вызывающие движения. Обратите внимание, что F O = F T - F P.
Рисунок 10: скольжения () шовный цикл, о чем свидетельствует "поймать" в форс следа во время подъема силы. Проверьте, чтобы убедиться, петли безопасности перед использованием волокна. (B), волоконно-брейк во время активации. Может быть из-за плохого целостности волокна или агрессивного лечения волокон во время шовного месте петлиния. (С) Преждевременная активация частичного волокна из-за загрязнения предварительной активации камеры с Са 2+.
Discussion
Оценки сократительных свойств проницаемыми одиночных волокон скелетных мышц используются для изучения мышечной функции в самых разнообразных контекстах. Примеры включают в себя исследования, которые оценивали влияние старения 12, 10,13,14, осуществляют космический полет 15, травм 2,3,16, медикаментозное лечение, болезнь 17,18 19 и генетических манипуляций 20,21 на волокнистой структуре и функции. Из-за способности непосредственно оценивать производительность сократительную миофибрилл на родном конфигурации, этот метод обеспечивает привлекательный платформу для формирования понимания миофибрилл функции отсутствуют потенциально мешающих эффектов, которые присутствуют при нервно-мышечной передачи сигнала возбуждения и индуцированного высвобождения кальция включены в изучаемой системе. Кроме того, функциональное тестирование отдельных волокон может быть использован, чтобы дополнить результаты идентификации сократительных белков, таких как те,получить через иммуногистохимического или гель-электрофореза + блоттинга 22.
Одной из основных функций скелетных мышц является создание силы. Следовательно мП о, мера внутренней силой, генерирующей способности системы сократительной, представляет большой интерес для физиологов мышц. Надежные оценки SF O требует точных показателей как волокна CSA и F о. Так волокна, в общем, ни круглое поперечное сечение, и однородными по CSA вдоль их длины, большое внимание должно быть принято при оценке CSA. С этой целью измерения производятся в нескольких местах вдоль длины волокна и, в каждом месте, с двух точек зрения, разделенных на 90 °. Надежные меры F O требуют внимания нескольких деталей, включая учет пассивную силу, укорачивания саркомера увеличить перекрытие толстых и тонких нитей, используя активирующий раствор с концентрацией кальция тРезультаты шляпа в максимальной активации, поддержания требуемого экспериментальной температуры и поддержания оптимальных условий хранения (температура и продолжительность) волокон предыдущих дня эксперимента.
В то время как действия, описанные здесь описать процедуру оценки максимально изометрической силы, часто желательно, чтобы оценить другие важные функциональные свойства скелетных мышечных волокон. Это может быть достигнуто путем расширения экспериментальный протокол, чтобы включать в себя дополнительные механические манипуляции волокна. Например, измерение скорости, с которой волокно сокращает против ряда различных нагрузках позволяет определить взаимосвязи сила-скорость, сила, с которой мощности и скорости отношения мощности может быть вычислена 10,23,24. Кроме того, скорость ненагруженного укорочение может быть определено посредством использования "провисание тест" 25, которые состоят из применяя серию слабину вызывающие сокращение и шагов measuriнг время, необходимое волокна для удаления слабину. Еще кинетическая параметр, который часто сообщалось является к TR, константа скорости силы перепланировки после механическое возмущение, что временно отделяет всего 26 crossbridges. Наконец, соотношение между концентрацией кальция и генерации активной силой ("сила-PCA отношения"), часто представляют интерес 18 и может быть определено путем воздействия на волокно в серии растворов с концентрацией кальция в диапазоне от ниже порога активации сократительной Система для тех, достаточной для получения максимальной активации и поэтому максимальное усилие (F O).
Хотя большая часть указанного оборудования необходим для оценки одного сократимость волокна, другое оборудование не является абсолютно необходимым. Длина-контроллер, например, имеет важное значение для любого экспериментального протокола, который требует быстрого или точного удлинение или укорочение волокон,но не является абсолютно необходимым для оценки максимальной изометрической силы (хотя нулевой уровень силы в записи сила должна еще быть идентифицированы с помощью некоторых средств). Призмы, которые позволяют наблюдать волокна со стороны, в то время как полезны для оценки площади поперечного сечения, не являются абсолютно необходимыми при позиционировании волокна в экспериментальной камере. Кроме того, альтернативные средства для воздействия на волокно в различных экспериментальных решений могут быть использованы, в том числе разработки ручным управлением системы камер или одной камеры, что позволяет для быстрого заполнения и опорожнения решений. Наконец, в то время как суб-физиологические экспериментальные такие как температура 15 ° С, как правило, используются для улучшения воспроизводимости измерений механических 1,2,3,5,8,12,17,27, можно генерировать действительные данные при других температурах 23 28 до тех пор, как влияние температуры на свойства раствора (концентрация кальция, рН и т.д.) принимаются во внимание. Составы тестирования решений являются одними из самых важных аспектов проницаемыми методов, описанных волокон здесь. Соображения относительно состава раствора, являются сложными и выходит за рамки данной статьи. Решения, описанные в шаге 5 раздела протокола разработаны с акцентом на быстрый активации проницаемыми волокна после его передачи от предварительного активации, чтобы активировать решений при поддержании постоянной ионной силы, катионный состав, и осмолярность 6,29. Другие подходы к состава раствора были использованы с заметным успехом другими исследовательскими группами и, как правило, используют опубликованных констант связывания и вычислительных средств 27,30,31. Концентрации ионов кальция в различных активирующих растворов является особенно важным в исследованиях с субмаксимальной активации, такие как сила-PCA оценок. Для экспериментов, в которых волокна полностью активированных, таких как описываютd здесь, концентрация кальция в активирующим раствором, как правило, превышает удобным краем, что необходимое для достижения максимальной силы, что делает его точное знание менее критичным. Добавление креатинфосфата важно для буферизации intramyofibrillar АТФ и АДФ колебания, которые иначе были бы связаны с сократительной активности. Креатинкиназы требуется катализируют перенос фосфата от креатинфосфата к АДФ. В экспериментальных условиях, которые приводят к высокому уровню АТФ оборота, в том числе работающих при высоких температурах или измерения высокоскоростной укорочение волокон в быстрых 32, креатинкиназы должен быть добавлен к раствору, чтобы дополнить эндогенного креатинкиназы, что остается связанным с волокном. Для менее требовательных условиях эксперимента, система регенерации АТФ менее критично 27.
Ограничения проницаемыми одной технике волокна включают в себя следующее. Данные, полученные в этих тестах определитьсократительные свойства конкретного миофибрилл блока, который был прикреплен к экспериментальной установки. Следовательно, это отражает только малую часть всей многоядерных волокна, из которого был получен сегмент, который, в свою очередь, представляет собой малую часть от общего количества волокон в мышце. Следователи должны, таким образом, рассмотреть внимательно выборки, необходимой для поддержки каких-либо выводы из экспериментов. Кроме того, оценка воздействия лечебной физкультуры вмешательства функции волокна предполагает, что волокна оценивали действительно были набраны во время обучения. Хотя протокол попытки имитировать естественную среду внутриклеточный волокна, процесс пермеабилизации сарколеммы является неспецифическим и необязательно позволяет растворимые внутриклеточные компоненты свободно диффундировать в купальных решений. Еще одним следствием проницаемости мембраны происходит изменение осмотического баланса свидетельствует отек в объеме волокна 33.волокна отек увеличивает расстояние между актина и миозина нитей приводит к снижению чувствительности к кальцию системы myofilament 34,35, но может быть изменено путем введения больших, осмотически активных соединений 34. Окончательный ограничение, чтобы рассмотреть следствием техники, используемой для подключения волокна с экспериментальным аппаратом. Это неизменно требуется искажая пространственное соотношение в системе нитей на и вблизи точек крепления, с посещением функциональные дефициты. В частности, регионы волокна в и прилегающих к точек крепления функционально скомпрометированы, и, таким образом, внести свой вклад следов искусственной серии эластичность измерительной системы.
В целом, мы описали средства, с помощью которых можно оценивать силы-генерирующей мощности химически проницаемыми скелетных мышечных волокон в пробирке. Хотя фокус этой статьи был на оценке максимальной изометрической силы generatinг емкость скелетных мышечных волокон человека, экспериментальный подход может быть изменена и расширена, чтобы определить различные кинетических параметров и отношений в целом ряде видов млекопитающих, или иным образом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
| 0.5 ml screw cap microcentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
| 0.5 ml microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
| Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
| Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
| LabVIEW software | National Instruments | - | |
| Computer | Varied | - | |
| Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
| Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
| Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
| Reagents | |||
| K-proprionate | TCI America | P0510 | |
| Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
| MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
| EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
| HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| KOH (1 N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
| HCL (1 N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
| Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
| pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 | |
References
- Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation. J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).
- Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy. J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).
- Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears. J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).
- Moss, R. L. Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths. J Physiol. 292, 177-192 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers. Biophys J. 53, 935-946 (1988).
- Moisescu, D. G., Thieleczek, R. Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution. J Physiol. 275, 241-262 (1978).
- Walker, S. M., Schrodt, G. R. I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human. Anat Rec. 178, 63-81 (1974).
- Gollapudi, S. K., Lin, D. C. Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers. J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).
- Brenner, B. Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers. Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).
- Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).
- Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).
- Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. What do single-fiber studies tell us about exercise training. Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).
- Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).
- Trappe, S. Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology. J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).
- Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics. J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Russell, A. J., et al. Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases. Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).
- Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).
- Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice. J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).
- Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).
- Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system. Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).
- Hill, A. V. The heat of shortening and the dynamic constants of muscle. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).
- Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence. J Physiol. 495, 573-586 (1996).
- Edman, K. A. The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres. J Physiol. 291, 143-159 (1979).
- Brenner, B., Eisenberg, E. Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution. PNAS. 83, 3542-3546 (1986).
- Moss, R. L. The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit. J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).
- Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle. Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).
- Ashley, C. C., Moisescu, D. G. Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils. J Physiol. 270, 627-652 (1977).
- Godt, R. E. Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration. J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).
- Fabiato, A., Fabiato, F. Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells. Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles). Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).
- Godt, R. E., Maughan, D. W. Swelling of skinned muscle fibers of the frog. Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).
- Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers. Biophys J. 64, 187-196 (1993).
- Millman, B. M. The filament lattice of striated muscle. Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).
- Edman, K. A. Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers. J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).
- Phillips, S. K., Woledge, R. C. A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle. Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).
- Stephenson, D. G., Williams, D. A. Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat. J Physiol. 333, 637-653 (1982).
