Abstract
胸腺選択の有効性を制御する機構は不明確なままです。ここで紹介する方法は、自己と外来抗原に特異的なT細胞の開発および選択の分析、in vivoで可能にします。アプローチは、免疫不全SCIDレシピエントに様々な高齢のマウス由来の胸腺移植片の移植を必要とします。比較的短い期間にわたって受信者は、完全に移植胸腺移植片由来T細胞で再構成されています。唯一の胸腺細胞の分離時に胸腺を播種すると、選択を受け、成熟T細胞へと発展します。このように、年齢依存性胸腺イベントの関数として移植T細胞の性質および特異性の変化を評価することができます。技術的専門知識が成功した胸腺移植のために必要とされていますが、この方法は、 生体内に起因する病態の広い範囲または異常な胸腺機能および/ またはhomeostasの結果を研究するためのユニークな戦略を提供しますです。
Introduction
胸腺は、T細胞の発達における重要なイベントが1を発生する器官です。レジデント胸腺細胞は、T細胞受容体（TCR）αおよびβ遺伝子の再編成時に、胸腺2の皮質と髄質の地域でlymphostromalと抗原提示細胞（APC）との相互作用のシリーズを受けます。胸腺正の選択は、宿主の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIおよびII分子2-3との関連で抗原性ペプチドを認識する胸腺細胞を産生するために、皮質胸腺上皮細胞（TEC）によって媒介されます。その後の胸腺のネガティブセレクションは、髄TECまたは樹状細胞（DC）、MHCクラスI及びII分子によって結合された3自己タンパク質に由来する本発明のペプチドとの相互作用によって駆動される自己反応性胸腺細胞のパージを伴います。これらのプロセスの最終結果は、広いスペクトルに対応することができ、成熟CD4 +およびCD8 + T細胞のプールの確立であります外来抗原の自己タンパク質4に最小限の反応性を示しながら。
胸腺選択イベントの効率は胸腺成熟、髄質および皮質TEC、胸腺のDCのサブセット組成の頻度、および胸腺前駆体3の源を含む因子の宿主によって影響されます。特に、異常な胸腺選択は、それぞれ、自己免疫5または損なわ正または負の選択から生じる免疫不全の病態をもたらすことができます。胸腺選択を調節する分子のイベントは、しかし、よく理解されていない。 インビトロでは 、このような再凝集胸腺器官培養（RTOC）6のように近づき、胸腺選択に関連する基本的な事象を分析するために有用であるが、完全には進行中のダイナミクスを再現することができないことが証明されています生体内のイベントで 。その結果、この胸腺移植ベースのアプローチは、インビボ 7 でより良い研究の胸腺細胞選択イベントに設立されました
このプロトコルは、免疫不全SCIDレシピエントマウスに新生児と成人ドナーマウスから胸腺を移植について説明します。この技術は、正および負の選択胸腺、ならびに個体発生中の様々なT細胞サブセットの胸腺の出力を調節する機構の研究を可能にします。最近、このアプローチは、胸腺選択の効率は、初期の自己反応性T細胞の増加した開発、および外来抗原7に特異的な減少T細胞レパートリーをもたらすマウスにおいて生後限定されることを実証するために使用されています。
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Protocol
マウスの研究では、ノースカロライナ州チャペルヒル大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された、すべての動物のケアは、IACUCガイドラインに従いました。
新生児と成人胸腺の作製
- ドナーマウスを安楽死する前に、すべての試薬や機器を準備します。
- オートクレーブ処理または他の適切な方法によって手術器具を滅菌します。すべての外科的処置は、無菌状態を維持し、汚染を避けるために、層流フードの下で実行されなければなりません。ドナーマウスからの胸腺の抽出のために必要なツールを組み立てます。
- 滅菌1×PBS（pH7.4）で60ミリメートル皿を記入し、フードの内側に氷の上に置きます。これは、移植前にドナーマウスから切除簡単ストア胸腺に使用されます。
- 倫理指針に従って、頸椎脱臼に続くCO 2窒息により断頭し、成人ドナーマウスによって新生児ドナーマウスを安楽死させます。
- Rについて胸腺のemoval：滅菌吸収性ペーパータオルの上に背臥位でマウスを置き、前切開し、70％エタノールでスプレー。
- 皮膚を通して正中切開を行うことで、腹部や胸腔を公開します。胸腔を明らかにするために胸と前肢上の皮膚を折ります。
- 優れた縦隔を公開し、胸腔を前方する振動板と胸郭を介して2つの横方向の切開を行います。胸腺は、二つの白いローブすぐ上に、心臓に隣接するとして表示される必要があります。
- カプセルを破壊するために、特定のではないながら、微細な鉗子で胸腺を周囲の結合組織を離れていじめます。鉗子で胸郭をバック保持しながら、臓器の下に湾曲した鉗子を配置し、垂直方向に引っ張ることにより、胸腺の2つのローブを抽出するために鉗子の第二の対を使用しています。これは、新生児マウスから胸腺を抽出するための解剖スコープを使用して行うことができます。
- 60ミリメートルジに胸腺を配置SH結合地峡を介して切断することにより、氷と別々の胸腺葉の滅菌1×PBS（pHは7.4）を含有します。カプセルに損傷を与えない特定すること胸腺葉から任意の破片を除去し、移植のためのセクションの適切な数に胸腺をカット。
- 新生マウスから得た胸腺を操作しないでください。
注：2レシピエントマウス（受信者ごとに1葉）の最大のために使用されます。 - 4-6レシピエントマウスの最大に成体マウスから得た胸腺を移植。ピンセットを用いて、 図1に示すように、慎重に、大人一人胸腺葉を持ち、手術用はさみを使用して、3つの等しい部分に胸腺をカット。
- 繰り返しは、各ドナーマウスのための1.3〜1.4を繰り返します。胸腺が露出する時間を制限するために、一度に1ドナー胸腺を準備します。
2.胸腺移植腎臓被膜下
- 表1に記載されている予め滅菌装置を組み立てます。適切な無菌技術は汚染されたツールや試薬に移植レシピエントを露出しないようにする手順の過程で利用されるべきです。
- 移植前に、各レシピエントマウスの重量を量るとタグ。
- 層流フード中で解剖顕微鏡および麻酔回路を設定します。
- 電気かみそりを使用して、レシピエントマウスの左側を剃ると、髪の毛が切開を作るために使用される領域の周囲に残っていないことを確認します。
- イソフルラン気化器の電源を入れ、1〜2％の間の用量を用いてマウスを麻酔。前つま先のピンチ次反射の不在を確認することにより、外科的処置を開始する適切な麻酔を確かめます。
- マウスが適切に麻酔した後、乾燥を防ぐため、次のように移植のためにマウスを準備するために、マウスの目に獣医の軟膏を適用します。
- 剃毛側が上を向いているように右側臥位で解剖顕微鏡下でマウスを置きます。 Starti手術領域の中心にngの、ポビドンヨード（ベタジン）続い使い捨てトランスファーピペット70％エタノールを使用して円を描くように分配します。前切開部を作ることに、エタノール/ベータダイン処理を3回繰り返します。
- 解剖ハサミを使用すると、直接腎臓上記1〜2センチメートルフランク切開を行います。
- 腎臓に隣接する結合組織をつかみ、それが筋肉組織の上に位置するように静かに腎臓を持ち上げるメディア鉗子を使用して。筋肉組織の上に露出し、代わりに腎臓を維持するために、腎臓、腸骨を破壊しないように注意しながら、腎臓下の媒体鉗子の一方のアームを挿入します。
- 腎臓および腎臓被膜の操作が完了するまで、組織の乾燥を防ぐために、各ステップの間、滅菌1×PBS（pH7.4）で腎臓を洗浄。
- 細かい鉗子を使用すると、腎臓からそれを分離するための副腎への最も遠位の腎臓のエッジ付近カプセルをつまんで持ち上げます。
- 18ゲージを使用してください針は、ドナー胸腺（ 図2A）の準備片を挿入するのに十分な大きさの切開を作ります。時間をかけて移植片の転位を防止するために、可能な限り小さく莢切開を保つために確かめて下さい。
- カプセルを維持することは離れて腎臓から引っ張っているが、カプセルの下に移植片を挿入し、可能な限り莢切開（ 図2B）から前方まで胸腺をプッシュする微細な鉗子の第二の対を使用しています。
- 腎臓の下から鉗子を外し、静かに切開して元の位置に戻し、腎臓を返します。
- 腹膜壁を縫合し、一度閉じたベータダインを適用することにより、筋肉組織を閉じます。縫合が完了した後、真皮を閉じ、周辺地域にベタジンを適用するために、創傷クリップを適用します。
- 加熱ランプを使用して温めてきたケージにマウスを返します。
- それは完全な意識とモビリティを取り戻すまで、各術後マウスを監視し、マウスのTHAを置かないでくださいtは他の動物とのケージに次の麻酔を回復していません。
- 必要に応じて術後疼痛管理薬をマウスに扱います。このように1.6mg / mlの濃度で飲料水中のアセトアミノフェンのような術後の鎮痛薬をマウスに与えます。
- 繰り返しは、各レシピエントマウスのための2.3~2.9を繰り返します。
- マウスは、1時間後に手術内の通常の活動に戻ることを確認してください。移植手順の結果として生じる合併症を決定するために、術後の体重、運動能力、ならびに各マウスの飲料水や給餌活動を監視します。
注：術後の体重減少、術前の体重に比べ、ならびに移動度の変化や飲食に失敗すると合併症を示すことができます。 - 尾ニック経由でマウスを出血、末梢血中のT細胞再構成を監視し、製造業者の仕様に従ってLympholyte細胞分離媒体を使用してリンパ球を分離しました。 T細胞characterizaを達成T細胞マーカーCD3、CD4、およびCD8に特異的な蛍光標識抗体、ならびにそのような蛍光活性化スクシンイミジルエステル8として生き死識別器でリンパ球を染色することによってます。 図3に示すように、分析はシングレット、生細胞およびCD3陽性細胞にゲートを介して達成することができます。
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Representative Results
この方法の成功は、最小限の外科手術による外傷ならびに腎臓被膜下に移植片の正確な位置決めに依存しています。胸腺移植片は、図1に示すように、その後の移植のために適切なサイズの胸腺のセクションを確実にするために切断されるべきである。 図1の模式に続いて、胸腺は、新生児または成体マウスから一貫して再現性のT細胞移植の結果と成功被膜下移植のために使用することができます。述べたように、腎被膜下移植片の適切な配置は、移植片の長期生存、機能、および血管新生を維持するのに重要です。 図2に見られるように、胸腺移植片は莢切開（腎臓の後部）とは反対側の端部には、最も近い副腎（腎臓の前方）に、腎臓の上に配置する必要があります。 R、適切な造血環境とすることができる結合された成功した胸腺移植、30週7を超える生産emain。
移植後、移植、末梢血から得られたT細胞のフローサイトメトリー分析によって評価される。 図3および表2は、移植レシピエントの6週間、移植後に臓器や末梢血で観察されたT細胞の生着の典型的なレベルを示しています。この技術を使用して、我々のグループは、以前に、新生児および成体胸腺の移植レシピエントにおける経時末梢血中のCD4 +およびCD8 + T細胞再構成の動態を示しています。簡潔には、循環T細胞は、一週間の術後内周に観察することができ、CD4 +およびCD8 + T細胞の数は、末梢T細胞コンパートメントを完全に5~6週間の移植後7で再構成されるまで増加し続けます。
図2：嚢切開および胸腺移植片の配置の位置ドナー胸腺から調製された適切なサイズのセクションには、腎臓（A）の後端に腎被膜の小さな切開によって作成嚢下空間内に挿入されます。腎臓の前方には、最も近い副腎（図示せず）および莢膜切開部から反対側の端部で、（B）に示すように、カプセルの下に挿入される移植片のための最適な位置です。
末梢血やリンパ器官におけるT細胞再構成を経由して成功した生着を決定する図3。フローサイトメトリーデータは、T細胞再構成を代表するものであり、NB胸腺移植片のSCIDレシピエントにおいて6週間に、移植後を観察しました。 T細胞移植の同様のレベルは、末梢血、脾臓、膵臓リンパ節（PLN）で観察され、および腸間膜リンパ節（MLN）は胸腺移植の成功した移植後。
| ファイン解剖用鉗子 |
| ミディアム解剖鉗子（2） |
| ファイン解剖鉗子（湾曲した先端） |
| ベタジンソリューション |
| 70％エタノール |
| 18ゲージの針 |
| /光源W解剖顕微鏡 |
| ディsposable転送ピペット（2） |
| 疼痛管理のための薬：アセトアミノフェン |
| 無菌ワイプ |
| 太陽灯 |
| 電気かみそり |
| イソフルランおよびイソフルラン気化器 |
| 縫合糸（高速吸収、プレーンガット） |
| はさみを解剖 |
| 9ミリメートルステンレススチール創傷クリップ |
| 創傷クリップ除去ツール |
| 滅菌1×PBS |
| 60ミリメートルディッシュ |
表1：レシピエントマウスの腎臓被膜下に胸腺を移植するために使用される必要な材料を外科的に胸腺移植の際に必要な物質一覧。指定された材料の量は、括弧内に記載されています。
| 踏太CD4 T細胞のL個 | CD8 T細胞の総数 | |
| 血 | 1,652細胞/υl | 351細胞/υl |
| 脾臓 | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364918 |
| MLN | 2182266 | 532059 |
胸腺移植レシピエントの末梢血やリンパ器官に存在するT細胞の表2の合計数。CD4 +およびCD8 + T器官から回収した細胞の合計数だけでなく、新生児胸腺移植レシピエントの末梢血から6週間後移植。これらの数は、典型的には、成功した新生児および成体胸腺移植レシピエントにおいて観察されるCD4 +およびCD8 + T細胞の細胞性の代表です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
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