Summary
Dit protocol beschrijft de toepassing van hoogfrequente ultrageluid (HFUS) voor imaging muizen cervicale lymfeknopen. Deze techniek optimaliseert visualisatie en kwantificatie van cervicale lymfeknopen morfologie, volume en de bloedstroom. Beeld-geleide biopsie van cervicale lymfeklieren en verwerking van lymfeweefsel voor histologische evaluatie wordt ook aangetoond.
Abstract
High-frequency ultrasound (HFUS) wordt algemeen gebruikt als een niet-invasieve werkwijze voor het afbeelden van interne anatomische structuren bij experimentele dieren kleine systemen. HFUS heeft de mogelijkheid om structuren te detecteren van slechts 30 urn, een eigenschap die is gebruikt voor het visualiseren oppervlakkige lymfeklieren in knaagdieren helderheid (B) -mode. Combineert vermogen Doppler met B-modus beeldvorming maakt meten bloedsomloop bloedstroom in lymfeknopen en andere organen. Terwijl HFUS is gebruikt voor lymfeknoop beeldvorming in een aantal muis modelsystemen, heeft een gedetailleerd protocol beschrijft HFUS beeldvorming en karakterisatie van de cervicale lymfeknopen bij muizen niet gerapporteerd. Hier tonen we aan dat HFUS kunnen worden aangepast voor het detecteren en karakteriseren cervicale lymfeknopen bij muizen. Gecombineerde B-mode en power Doppler beeldvorming kan worden gebruikt om verhogingen in bloedstroming in immunologisch vergrote cervicale knooppunten detecteren. Wij het gebruik van B-modus beeldvorming te beschrijven ook fijne naald biopten van cervicale lymfe geen gedragdes te lymfeweefsel voor histologische analyse halen. Tenslotte worden-software geholpen stappen beschreven op veranderingen in lymfeklieren volume te berekenen en om veranderingen in de lymfeklieren morfologie volgende beeld reconstructie te visualiseren. Het vermogen om veranderingen in cervicale lymfeknopen biologie visueel controleren mettertijd een eenvoudige en krachtige techniek voor de niet-invasieve bewaking van halskliermetastasen veranderingen in preklinische muismodellen van mondholte ziekten.
Introduction
Lymfedrainage van interstitiële weefselvocht is de belangrijkste methode van verspreiding van besmettelijke micro-organismen en kankers die ontstaan in de orale en maxillofaciale regio 1,2. Klinische evaluatie van cervicale lymfeknopen is een gangbare diagnostische praktijk toegepast om de aanwezigheid of progressie van aandoeningen die ontstaan in de mondholte te bepalen. Dit onderstreept het belang van het verzamelen cervicale lymfeknopen waardevolle anatomische plaatsen voor orale ziektediagnose 3. Verscheidene gespecialiseerde imaging methodes worden klinisch gebruikt voor het identificeren van zieke cervicale lymfeknopen. Deze omvatten positron emissie tomografie (PET), computertomografie (CT) en magnetische resonantie imaging (MR). Terwijl zeer waardevolle, deze werkwijzen vereisen alle uitgebreide patiënt bereiding, zeer gespecialiseerde apparatuur en / of chemische infusie in de circulatie te activeren of te versterken het belichtingsproces.
Echografische beeldvorming (echografie, VS) is een algemeen toegepaste techniek die gebruikt wordt om imleeftijd cervicale lymfeklieren presenteren met lymfadenopathie als gevolg van infectie of gemetastaseerde betrokkenheid 4-6. US wordt vaak gecombineerd met PET-CT en MR aan een uitgebreide weergave van de patiënt lymfeklierstatus verschaffen, waardoor stagering en noodzaak bepalen voor chirurgische excisie 7. De niet-invasieve karakter van US ook inherente voordelen boven andere beeldvormingsmodaliteiten, waaronder gebruiksgemak, lage kosten, minimaal ongemak voor de patiënt en voorbereiding. De oppervlakkige subcutane locatie van de meeste cervicale lymfeklieren laat voor ons om minimaal invasieve fijne naald aspiratie biopsieën begeleiden met grotere precisie, het verbeteren van diagnostische nauwkeurigheid 8.
Commerciële hoge frequentie (HF) US biedt gedetailleerde resolutie van interne anatomische structuren tot 30 pm 9. Met transducers gaande 22-70 MHz is HFUS is gemakkelijk toegepast op een verscheidenheid van experimentele knaagdier systemen om real-time beeldvorming van organen in vivo mogelijk.; HFUS is aangepast voor visualisatie van tumorvorming in gebruikelijke helderheid (B) -mode, alsook met een aantal algemene en specifieke contrastverbetering agents9. Met behulp van de macht Doppler met HFUS biedt de mogelijkheid om te controleren bloedstroom binnen muis tumoren, waardoor een uitgebreide beoordeling van angiogene perfusie in levende muizen 10,11. HFUS is gebruikt om zieke muizen lymfeklieren visualiseren in het hoofdlichaam holte, waaruit parallel nut van deze technologie voor de klinische praktijk. In het bijzonder ontstekings- en metastatische lymfeknoop viscerale veranderingen waargenomen in muismodellen van kanker borstkanker herbergen 12,13, pancreas 14, colorectal 15 en longen 16 tumoren, alsmede vezelachtige histocytomas 17 en een oude muismodel van verworven hydronephrosis 18 . Deze voorbeelden stollen de waarde van HFUS als krachtig onderzoeksinstrument voor tumor geïnduceerde lymfadenopathie in diverse rodeuk systemen.
Verschillende modellen van bacteriële infecties 19,20 en hoofd en nek geschubde cel carcinoom (HNSCC) 21,22 ontwikkeld om deze ziekten te bestuderen in de preklinische setting. In tegenstelling tot de mens, muizen bevatten drie cervicale lymfeklieren die lymfe enquête van mondholte weefsels (onderkaak, submandibulaire onderkaak en oppervlakkige parotis 23). Recent rapporteerden we het gebruik van HFUS de locatie en morfologie van deze lymfeknopen kaart, het beoordelen van wijzigingen lymfklier volume en de bloedstroom in een carcinogeen-geïnduceerde muismodel van HNSCC 24. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van HFUS voor het identificeren, beeldvorming en analyse cervicale lymfeknopen in levende muizen. Dit protocol toont ook de haalbaarheid van het gebruik HFUS om beeld- geleide fijne naald biopsie van vergrote muis cervicale lymfeklieren te voeren, waardoor histologische monitoring van veranderingen in de cervicale lymfeklieren inhoud en pathologieën dan tijd in hetzelfde dier. Dit protocol gemakkelijk kan worden aangepast om de gedetailleerde studie van cervicale lymfeknopen pathologieën verkregen vanuit invasieve mondholte ziekte in muizen.
Protocol
Alle dierlijke procedures aangetoond in dit protocol zijn beoordeeld en door de West Virginia University Animal Care en gebruik Comite onder protocollen 11-0412 en 14-0514 goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de beginselen en procedures die in de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van dieren.
1. Dierlijke Voorbereiding
- Verdoven een enkele muis in een inductie kamer met 3% isofluorane gemengd met 1,5 l / min 100% zuurstof. Verwijder het dier uit de inductie kamer en in een liggende positie op een grafisch platform voorverwarmd tot 40 ° C en gehouden tussen 37-42 ° C (figuur 2A). Bevestig verdoofd door het gebrek aan respons op een teen knijpen.
- Plaats de muis snuit binnen de neuskegel verbonden met de anesthesie-systeem. Breng anesthesie steady state sedatie (1,5% isofluorane gemengd met 1,5 l / min 100% zuurstof) te handhaven.
- Breng oog smeermiddel het elk oog om Dryin voorkomeng. Breng elektrodengel de elektroden en gebruiken tape aan elk van de vier poten vast aan de overeenkomstige elektrode. De elektroden zal ECG van het dier door aan de imaging-systeem om de controle op de hartslag en ademhaling mogelijk te maken. Smeer en plaats de rectale temperatuur sonde voor de continue monitoring van de lichaamstemperatuur. Normale muis lichaamstemperatuur is 36,9 ° C. 1-2 ° C variatie normaal terwijl onder narcose.
- Gebruik ontharingscrème om de vacht van de hals van de muis te verwijderen. Spoel de nek met water gedrenkt gaas om haar en overtollige ontharingscrème verwijderen. Optioneel gebruik van aanvullende toepassing van ontharingscrème om alle resterende lichaamsbeharing (Figuur 2B) te verwijderen.
2. Identificatie en Image Acquisition van Mouse cervicale lymfeklieren behulp HFUS
- Om te beginnen, een laagje verwarmd ultrasoongel het nekgebied zonder bont. Gebruik liberale toepassing van de gel voor optimaal beeldkwaliteit (Figuur 2C). Voorkomen dat er luchtbellen in de gel tijdens het aanbrengen, wat kan interfereren met ultrasone beeldvorming.
- Stel de imaging platform 20-30 °, zodat de muis wordt geplaatst met het hoofd licht verhoogd. Deze positie helpt om de optimale ademhalingssnelheid voor de muis waarborgen. Plaats de 40 MHz transducer dwars in het montagesysteem en kantel totdat de voorkant van de omzetter aftastkop wordt ondergedompeld in het ultrasone gel (figuur 2C).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen overmatige druk op de muis nek, omdat het onnodig ademnood veroorzaken. Bovendien is het nuttig voor de beeldvorming van een buffer van gel tussen de transducer en de muis hebben.
B-modus beeldvorming en detectie van de lymfeklieren:
- Met behulp van de computer regelen van de HFUS acquisitie software, de helderheid (B-) modus instellingen om de volgende parameters: Gain 22 dB, diepte 10,00mm, breedte 14,08 mm.
OPMERKING: Deze instellingen zijn een voorgestelde uitgangspunt, en kan een lichte correctie voor optimaal beeld overname tussen verschillende toepassingen vereisen. Normale cervicale lymfeklieren als ovale hypoechoic structuren in de buurt van het huidoppervlak in een omringende hyperechogeniciteit veld. Het uiterlijk van zieke lymfeklieren per model. Systematisch image alle lymfeklieren in de hals gebied gebruik maken van de volgende stappen:- Met de Y-as naar de nek te gaan in een craniaal naar caudaal gedragen jegens de thoracale gebied. Gebruik X-as naar het beeld te centreren.
- Identificeer belangrijke bezienswaardigheden: mondholte, tong, en schildklier (figuren 3A, B en C, respectievelijk); kantel de imaging platform horizontaal stellen het ventrale oppervlak van de muis hals, waardoor beide zijden van de nek verschijnen ook in beeld B-modus. De hoeveelheid kantelen afhankelijk van de fysiologie van elke individuele muis.
- Zoek de tong / mondholte regio (figuur 3A) en noteer de numerieke locatie op de Y-schaal.
- Zoek schildklier (figuur 3C) en noteer de numerieke locatie op de Y-schaal.
- Bereken het verschil tussen de verkregen waarden (2.4.1) en (2.4.2) aan de totale lengte in mm bepalen de afgebeelde halsgebied.
- Met de Y knop om de transductor te centreren op het middelpunt van de bepaalde inbouwlengte.
- Druk op "3D". Vul de totale lengte. Voor 3D stap grootte, gebruik 0,076 mm om het beeld-serie stack voor het hele nek regio te verwerven.
- Zodra het scannen is voltooid, selecteert u de rechter- of linkerkant van de nek en centreren de transducer op een individuele lymfeklier van belang, dan verhogen de 40 MHz transducer van de muis. Verwijder de 40 MHz transducer en vervangen door een 50 MHz microscan transducer (ook in transversale positie) van hogere resolutie beelden te verkrijgen. Vullen de ultrasone gel op de muis hals en laat het 50 MHz transducer in de ultrasone gel.
3D macht Doppler Imaging
- Gedragscode 3D scans met power Doppler aan ezels volume en vasculariteit van individuele cervicale lymfeklieren als volgt:
- Druk op de knop op het systeem toetsenbord aan de macht Dopper de volgende power-mode instellingen te verwerven en aan te passen: PRF 4 KHz, Doppler krijgen 34 dB, 2D gain 30 dB, diepte 5,00 mm, breedte 4,73 mm. OPMERKING: Zoals eerder, deze instellingen zijn een voorgestelde uitgangspunt en kan worden gewijzigd als nodig is voor een optimale beeldacquisitie in verschillende modellen.
- Zoek de schedel-punt van de lymfeklieren van belang en let op de locatie op de Y-schaal.
- Zoek het meest caudale punt van hetzelfde knooppunt en notede locatie op de Y-schaal.
- Bereken de afstand verschil met de totale lengte van de lymfeklieren te bepalen (zie stap 2.4.3).
- Centreer de transducer op het middelpunt van de bepaalde totale lengte, via de Y-schaal location.
- Druk op "3D" en voer totale lymfeklieren lengte. Gebruik 0,051 mm voor de stapgrootte.
OPMERKING: Vanwege de nabijheid van de transducer aan de borstkas, kan de 50 MHz transducer resulteren in een niet stabiel Doppler gevolg van de detectie van normale ademhalingscorrectie. Dit kan worden voorkomen door het gebruik van de "ademhaling Gating" optie beschikbaar onder het tabblad "Physiological '. - Omringen de geselecteerde lymfeklier met het gele vakje dat het gebied aangeeft die moeten worden geanalyseerd met macht Doppler en selecteer "3D scan" afbeeldingen ophalen. Verhoog de transducer weg van de muis en verplaatsen naar de andere kant van de hals. Laat de transducer op de muis en herhaal de hierboven beschreven stappen om image lymfeklieren aan deze zijde van de hals.
- Sla image sets voor verdere analyse.
3. Cervical lymfklierbiopsie
- Selecteer de gewenste lymfeklier voor biopsie en HFUS beeldvorming met de 50 MHz transducer behouden. Koos de grootste zichtbare halskliermetastasen aan iedere kant van de muis hals. Lymfeklier uitbreiding geeft doorgaans een ontstekingsreactie, en daarom deze knooppunten zijn ideale kandidaten voor biopsie.
Opmerking: we hebben gevonden is het zeer moeilijk om biopsieën voeren op cervicale knooppunten kleiner dan 10 mm 3. - Bereid de naald en spuit voor biopsie door het plaatsen van een spuit 1 ml met een aangesloten 27 G, 0,5 inch naald in de spuit houder. Stel de naaldhouder de naald oriënteren 90 ° hals muis (Figuur 4A).
- Bereid door het opvoeren van de gehele muispaneel het niveau van de naald. Dit te bereiken door het verwijderen van de 3D-motor en schakelen naar een hogere platfORM, of door het plaatsen van een vast object van geschikte hoogte onder de voorwaarde korte platform. Gebruik een kunststof microcentrifugebuis rack hiervoor. Indien nodig draait het platform 180 ° om biopsie knooppunten op de zijkant van de nek tegenover de naaldinrichting.
- Pas de overname instellingen door "Voorkeuren", dan door te kiezen voor 'Max & Extended buffer ". Vergroot het gezichtsveld tot een diepte van 8,00 mm en een breedte van 9,73 mm. Schakel de naaldgeleider met behulp van de Screen Keys bellen. De naald gids zal het pad van de naald op het scherm te voorspellen en stelt de gebruiker om line-up van de lymfeklieren van interesse in de juiste locatie voor biopsie.
- Controleer of de lymfeklier blijft constant gezien door centreren van de lymfeklier in het midden of iets links van het midden van het scherm (Figuur 4B). Om de hele cine loop van de procedure te verkrijgen, druk op Pre-trekker op het systeem toetsenbord voor het begin van de biopsie.
- Stel de naald houder totdat de naald komt in zicht en de contacten van de huid (Figuur 4B). Advance de naald met een stevige, snelle duwen om de huid te prikken. Doorgaan met de naald vooruit totdat de tip prikt ook de capsule (figuur 4C) en is zichtbaar in het merg (Figuur 4D).
- Wanneer de naald correct is gelegen in het knooppunt, trek de spuit zuiger tussen de 200-300 ul afbakeningen de biopsie (figuur 4D en 4E) voeren. Let biopsie materiaal is gewoonlijk niet zichtbaar in de injectiespuit.
- Verwijder voorzichtig de naald uit de muis nek. Verdrijf de inhoud spuit in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Trek de naald uit de injectiespuit, waarbij de naald in de buis. Verzamel 1 ml biopsie media (uit een hoeveelheid, los van de voorraad bron) met dezelfde spuit, en bevestig vervolgens weer de naald aan de spuit terwijl de naald in the buis.
- Spoel de spuit en naald met de biopsie media door het verdrijven van de biopsie media in de buis.
OPMERKING: Trek niet terug op de zuiger, terwijl de naald op elk moment na de biopsie wordt bevestigd. Dit vermindert het risico op verlies van het biopsie materiaal door de kleine steekproef.
- Spoel de spuit en naald met de biopsie media door het verdrijven van de biopsie media in de buis.
- Bevestig lymfeknoop gehalte histologische middelen (Figuur 4F) en geanalyseerd door andere methoden (histochemie, flow cytometrie, enzovoort) te worden verstrekt.
- Zodra biopsie is voltooid, schakelt u de verdoving en verwijder de rectale temperatuur sonde. Verwijder overtollige ultrasound gel uit muis met gaas en verwijder de tape van elke poot.
- Verwijder de muis uit de imaging platform en terugkeren naar een kooi. Minimal bloeden uit biopsie site kan optreden, maar dit stopt zonder tussenkomst. Bewaken van de muis tijdens het herstel tot de volledige activiteit wordt hervat.
4. Image Analysis van cervicale lymfeklieren
- Selecteer "3D gereconstrueerd beeld" in de linkerbovenhoek te klikken op de "Toon Single Pane" knop. Gebruik de zoomfunctie om het beeld te vergroten indien gewenst. Toggle "Display Layout" om de afbeelding alleen in de B-modus, die de kracht Doppler overlay verwijdert uit het zicht. Dit maakt het gemakkelijker om de randen van de lymfeklier zien tijdens daaropvolgende 3-D analyse. Blader door het beeld-serie naar het begin van de lymfeklieren te vinden.
- Om de lymfeklier omschrijven, ga naar het tabblad "3D instellingen". Selecteer "volume", dan is de "Start" knop naast "Parallel".
- Teken contouren rond het gebied van belang in afzonderlijke beelden door te bladeren. Ga door tot beelden die de hele lymfeklieren omvatten zijn gemarkeerd. Kies "Finish" omvoltooiing van de analyse.
- Aan de onderkant van het beeld, zal 3D volume% en vasculariteit automatisch weergegeven.
OPMERKING: 3D volume komt overeen met de lymfeklier volume en vasculariteit procent geeft het percentage van de lymfklier positief voor bloedstroming door stroom Doppler. - Toggle "Display Layout" om de macht Doppler imaging zien als een overlay op het B- mode. Aan de oppervlakte weergave te observeren een net overzicht van het volume gebied van belang. De afbeeldingen te exporteren in Tagged Image File (TIF) formaat of 3D scans als films (.avi) voor verder gebruik.
Representative Results
De algemene schema voor de beeldvorming en biopsie procedures wordt getoond in figuur 1. De belangrijkste stappen in de procedure onder goede voorbereiding van muis voor beeldverwerking, het cervicale lymfeknopen, correct opstellen en houden van de naald biopsie en analyse van B -mode en Doppler afbeeldingen volume en de hoeveelheid vascularisatie in elke geselecteerde knoop via computersoftware meten.
HFUS beeldvorming van muis cervicale lymfeknopen vereist het aanbrengen en handhaven van de juiste anesthesie gedurende het beeldvormende periode (figuur 2A), alsmede volledige verwijdering van het haar over de gehele halsgebied (figuur 2B). De liberale toepassing van ultrageluid gel aan de onthaarde regio zorgt voor een duidelijke HFUS signaal tijdens de procedure (figuur 2C).
HFUS beeldvorming van de nek wordt bevorderd door de visualisatie van anatomische cervicale die kenmerkend echografische beelden te produceren. Fig3 toont voorbeelden van de belangrijkste organen (figuur 3A-C), cervicale lymfeknopen in de B-mode (Figuur 3D) en macht Doppler modus (figuur 3E).
Real-time imaging HFUS in verdoofde muizen maakt geleide fijne naald biopsie halsklieren vergelijkbaar met wat gebeurt in de klinische praktijk. Plaatsing van de biopsienaald en gevoegd afnamespuit de controlerende microinjector apparatuur is getoond in figuur 4A. Latere B-mode echografische beelden tonen ideale plaatsing van de naald voorafgaand aan biopsie (Figuur 4B), naald binnenkomst in een cervicale lymfeklieren (Figuur 4C) en naaldstand tijdens biopsie (figuur 4D). Close-up beeld toont de naald in het verlengde van de lymfeklieren (Figuur 4E). De verwerking van de biopsie componenten door cytospin onthult overvloedige lymfoïde cel clusters en bijbehorende bindweefsel, verificatie succesvol lymfeklierenbiopsie (Figuur 4F).
Computational-gebaseerde analyse van HFUS beelden maakt het mogelijk gedetailleerde informatie te bekomen over lymfeklier architectuur, volume en vasculaire flow. Energieplannen Doppler modus 3D volume metingen procent vasculariteit (PV) worden berekend uit het aantal volledige knooppunten omvat (figuur 5A). Bovendien, 3D-imaging zorgt voor virtuele lymfeklieren reconstructie, het onthullen van de totale lymfeklier topografie (Figuur 5B).
Figuur 1:. Overzicht schema van de stappen die betrokken zijn bij diagnostische HFUS cervicale lymfeklieren beeldvorming bij muizen De belangrijkste stappen zijn onder 1: Voorbereiden van de muizen voor HFUS beeldvorming en het verkrijgen van 40 en 50 MHz resolutie beelden van de nek regio die de drie muis cervicale lymfeklieren . 2: fijne naald beeld-geleide biopsie van cervicale lymfeklieren en de daaropvolgende histologische analyse van biopsie materiaal. 3: Computerondersteunde beeldanalyse en 3D reconstructie lymfeknoopma- verkregen beelden in B-modus en het Doppler respectievelijke lymfeklier volume en percentage (%) van vasculaire stroom te bepalen.
Figuur 2:. Overzicht van de hoge resolutie in vivo micro-beeldvormingssysteem voor cervicale lymfeklieren assessment en biopsie (A) Het HFUS wordt getoond met een verdoofde muis voorbereid halskliermetastasen imaging. Ook getoond is de microinjector (MI) en 3D-motor fase (3D MS) accessoire apparatuur. (B) Close-up van een verdoofde muis voorbereid HFUS beeldvorming met haren verwijderd in de nek regio. (C) Dezelfde muis met de 50 MHz transducer op zijn plaats op de nek. Let op de extra ultrasound gel gebruikt om halsgebied beeldvorming te vergemakkelijken.
718fig3.jpg "/>
Figuur 3: Representatieve HFUS cervicale anatomie beelden in B-mode en power Doppler. (A, B) B-modus beelden van de mondholte, die de mondholte (BC) en de tong (T) gevisualiseerd door beeldvorming dichtste bij de neusholte. De drie cervicale lymfeknopen hebben aan elke zijde van de nek (aangeduid M, mandibulaire, SM, submandibulaire, SP, oppervlakkige parotis), weergegeven als een groep hypoechoic structuren in één beeldvlak zoals afgebeeld (B). (C) De schildklier (Th) zoals zichtbaar in de thoracale gebied, opgenomen als een vaste stof, echogene vlindervormige structuur. (AC) werden zichtbaar gemaakt met een 40 MHz transducer; schaal bar = 1 mm. (D, E) Representatieve beelden van normaal (D) en uitgebreid (E) cervicale lymfeknopen met B-mode en power Doppler (rood). Gestippelde lijnen schetsen afzonderlijke lymfeklieren. Schaal bar = 0,5 mm.
Figuur 4: Cervical lymfklierbiopsie set-up, beeldvorming en cytospine analyse van biopsie materiaal (A) De imaging platform die de micro-injector en naaldplaatsing bij de muis nek.. Een breed microcentrifugebuis rack (oranje blok) wordt gebruikt om iets te verhogen van het platform, zodat de juiste plaatsing van de naald terwijl u toch de ruimte voor de 3D-motor podium. Deze regeling vermindert de tijd doorgebracht het verwijderen van de motor podium voor elke muis. (B - D) Hele nek HFUS beelden uit een video van een cervicale lymfeklier biopsie met behulp van de 50 MHz transducer. Beeld HFUS B-modus waarin de naald geplaatst aan de kant van de hals vóór biopsie (B). De naald is de hyperechogeniciteit structuur net onder de positie van de naaldgeleider (groene stippellijn) gelegd tijdens beeldvorming om de naald traject te duiden. De lymfeklier is in het midden vanDe afbeelding. Schaal bar = 1 mm. (C) Naald binnenkomst in de lymfeklieren. (D) Biopsie van de cervicale lymfeklieren. (E) Zoomed biopsie van cervicale lymfeklieren. Schaal bar = 0,5 mm. (F) Cytospin analyse van representatieve biopsie lymfe materiaal bevestigt succesvolle biopsie. Schaal bar = 100 micrometer.
Figuur 5:. Computeranalyse van 3D halskliermetastasen afbeeldingen (A) Representatieve screenshot van een lymfeknoop geanalyseerd met computersoftware. Het knooppunt wordt afgebakend in het blauw; analyseresultaten tonen 3D Volume procent en vasculariteit (PV) zoals aangegeven. (B) Een oppervlakte afbeelding van hetzelfde knooppunt na 3D analyse view. Maakt volledige hoeveelheid lymfeklieren op basis van metingen die A.
Discussion
De beschreven protocol zorgt voor de visualisatie en in situ evaluatie van murine cervicale lymfeknopen met behulp van niet-invasieve beeldvorming HFUS. Het gebruik van B-mode en power Doppler imaging visualiseren halskliermetastasen morfologie, volume en lymfeknoop bloedtoevoer voorziet in een experimentele analyse van preklinisch muis modelsystemen vergelijkbaar met die toegepast voor het karakteriseren van de patiënt cervicale knooppunten in de klinische praktijk. De mogelijkheid om de cervial lymfeknopen via fijne naald biopsie monitoren verschaft ook een geschikte techniek voor het detecteren immuuncel wijzigingen en de aanwezigheid van vreemde celtypen of bacteriën tijdens mondholte ziekte geïnduceerde Lymfadenopathieën in muizen. Het gebruiksgemak en lage kosten verbonden aan HFUS zorgt de snelle screening van cervicale lymfeknoopstatus in diverse diermodellen.
Een kritische stap in dit protocol de eerste succesvolle identificatie van de cervicale lymfeknopen in HFUS afbeeldingen. Onze faciliteit heeft een assortiment van HFUS transducers zoals beschreven, zodat we ze hebben gebruikt om de hoogste kwaliteit beelden te verkrijgen. Indien de transducers beschrijven we niet beschikbaar zijn, is het mogelijk de beeldvorming op andere transducers passen. Daartoe aanpassing beelddiepte en breedte voldoende resultaat krijgt is alles wat nodig is. Resolutie van dergelijke beelden kan variëren, maar het moet toch mogelijk zijn om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen door het gebruik van HFUS. Imaging oriëntatiepunten van de mondholte en de schildklier sterk zal helpen bij het oriënteren van de gebruiker de juiste regio waar de lymfeklieren gelokaliseerd. De karakteristieke ovale, hypoechoic natuur en oppervlakkige ligging dicht bij het huidoppervlak zorgt voor een snelle bevestiging van de identificatie van de cervicale lymfeklieren in de juiste halsgebied. Hoewel alle drie knooppunten zichtbaar in een beeldvlak (figuur 3B) kunnen zijn, kenmerkend één of twee knooppunten gevangen tijdens beeldvorming. Kleine aanpassingen van de transducer positie kan worden uitgevoerd om te scheurener verschillende beeldvlakken toegankelijk, waardoor visualisatie van alle knooppunten op één zijde van de nek.
Terwijl we de beschreven techniek voor het identificeren betrouwbare cervicale lymfeknopen zijn gevonden, zijn er specifieke beperkingen voor de beeldvorming en biopsie techniek. De oppervlakkige aard van de muis cervicale lymfeknopen verleent overmatige mobiliteit die zelfs lichte druk wordt aangebracht op de huid via de transducer weg. Dit kan worden tegengegaan door langzaam toepassing van transductorkop in de ultrasone gel op de muis hals tot de landmark beelden worden geïdentificeerd. Lymfeklier mobiliteit kan ook compliceren de fijne naald biopsie, vooral bij gebruik van transducers in de hogere resolutie (50 MHz) bereik. Gecentreerde afbeeldingen lymfeklieren biopsie worden meestal uit het gezichtsveld geduwd als gevolg van de kracht van de biopsienaald die nodig is om de bovenliggende huid en capsule punctie. Dit kan worden verholpen door de excentrische plaatsing van de lymfeklieren in de richting van de naald binnenkomst,verschaffen van ruimte voor de lymfeklieren over worden geschoven maar nog steeds binnen het zichtsveld blijven gedurende biopsie. In onze ervaring, lymfeknopen> 10 mm 3 zeer moeilijk biopsie en vaak geduwd door de naald gepenetreerd in plaats van de naald vooruit. Zo wordt biopsie best gereserveerd voor vergrote lymfeklieren, waar de grootte is> 10 mm 3 om voldoende knooppunt beoogde omvang en stabiliteit binnen de cervicale regio. Bovendien kan biopsie materiaal onvoldoende aantallen cellen bevatten in procedures waarbij grote aantallen cellen zijn (bv flowcytometrie).
HFUS is gebruikt om succesvol visualiseren orthotope HNSCC tumoren 25, en heeft het potentieel om cervicale metastase in muizen met orale tumoren 24 volgen. Naast ultrageluid is bioluminescentiebeeldvorming ook gebruikt om orthotope orale tumorvorming en cervicale lymfekliermetastasen visualiseren in levende muizen 26,27. Als een alterntieve benadering, bioluminescentie beeldvorming heeft een duidelijk voordeel ten opzichte HFUS in staat om direct te kwantificeren progressie van de tumor en metastatische last over de tijd in hetzelfde dier. Terwijl onmiskenbaar nuttig, bioluminescentie beeldvorming kan niet veel van de parameters gevisualiseerd door HFUS, waaronder lymfeknoop morfologie of knooppunt volumes of bloed te meten. Bioluminescentie beeldvorming vereist ook gespecialiseerde donkere dozen om muizen te behouden tijdens de beeldvorming, waardoor deze techniek niet geschikt voor aanpassing voor fijne naald biopsie.
Bovendien bioluminescentie beeldvorming vereist productie van tumorcellen die stabiel tot expressie het luciferase-enzym, waardoor deze techniek alleen gebruikt in geval van orthotope xenotransplantaten met luciferase-getransfecteerde tumorcellen in immuungecompromitteerde muizen, of induceerbare weefselspecifieke transgene systemen die luciferase-expressie beperken in een ruimte-tijd manier die specifiek zijn voor het weefsel van de tumor oorsprong. In tegenstelling, kan HFUS u zijnsed in samenhang met bioluminescentie afbeeldingen in deze modellen, maar ook in staat beeldvorming cervicale lymfeknopen in modellen van carcinogeen-geïnduceerde orale tumoren bij muizen met volledige immuunsysteem 28,29. Terwijl HFUS kunnen meer aan te passen aan de meeste muismodellen van mondkanker, de gecombineerde informatie die kan worden verkregen van bioluminescentie en HFUS beeldvorming in systemen waarbij tumorcellen drukken luciferase kan een completer beeld van cervicale lymfeklieren betrokkenheid dan beide beeldvormingsmodaliteit alleen bieden.
Het vermogen om muizen cervicale lymfeknopen in real time geïdentificeerd en maakt deze techniek wordt gebruikt in de meeste modellen van orale ziekten die resulteren in inflammatoire lymfadenopathie waar het dier in een omgekeerde stand onder kortdurende anesthesie te handhaven. Detectie van lymfeknoop metastase of bacteriële infectie en de daarmee gepaard gaande gevolgen lymfeklier morfologie in levende dieren biedt een significant voordeel ten opzichte van traditionele methodendie vereisen lymfeklieren van dode dieren voor histologische verwerking worden verwijderd. De combinatie HFUS met fijne naald biopsie kan een middel voor het uitvoeren van routinematige pathologische analyse van cervicale lymfeknopen, vergelijkbaar met wat wordt uitgevoerd in de kliniek, een verbeterde werkwijze voor het bewaken van progressie van de ziekte in de meeste huidige muizenmodellen van mondholte ziekten.
Disclosures
Kosten van publicatie van dit artikel worden gesponsord door Visual Sonics.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Dorothy D. Radford Endowment fonds van de Universiteit van West Virginia Mary Babb Randolph Cancer Center. Het gebruik van de West Virginia University diermodellen en Imaging Facility (AMIF) en Microscopie Imaging Facility (MIF) (ondersteund door de Mary Babb Randolph Cancer Center en NIH subsidies RR16440 P20, P30 RR032138 / GM103488 en S10 RR026378) is dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
| Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
| Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
| Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
| Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
| Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
| Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
| Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
| Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
| Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
| Depilatory Cream | Carter Products | ||
| Cotton swabs | General Supply | ||
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
| Water | General Supply | ||
| Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
| Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
| 27 G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
| Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
| Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
| Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |
References
- Montone, K. T. Infectious diseases of the head and neck: a review. Am J Clin Pathol. 128 (1), 35-67 (2007).
- Bryson, T. C., Shah, G. V., Srinivasan, A., Mukherji, S. K. Cervical lymph node evaluation and diagnosis. Otolaryngol Clin North Am. 45 (6), 1363-1383 (2012).
- Joshi, P. S., Pol, J., Sudesh, A. S. Ultrasonography - A diagnostic modality for oral and maxillofacial diseases. Contemp Clin Dent. 5 (3), 345-351 (2014).
- Oz, F., et al. Evaluation of clinical and sonographic features in 55 children with tularemia. Vector Borne Zoonotic Dis. 14 (8), 571-575 (2014).
- Niedzielska, G., Kotowski, M., Niedzielski, A., Dybiec, E., Wieczorek, P. Cervical lymphadenopathy in children--incidence and diagnostic management. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 71 (1), 51-56 (2007).
- Ying, M., Bhatia, K. S., Lee, Y. P., Yuen, H. Y., Ahuja, A. T. Review of ultrasonography of malignant neck nodes: greyscale, Doppler, contrast enhancement and elastography. Cancer Imaging. 13 (4), 658-669 (2013).
- Stoeckli, S. J., et al. Initial staging of the neck in head and neck squamous cell carcinoma: a comparison of CT, PET/CT, and ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology. Head Neck. 34 (4), 469-476 (2012).
- Rottey, S., et al. Evaluation of metastatic lymph nodes in head and neck cancer: a comparative study between palpation, ultrasonography, ultrasound-guided fine needle aspiration cytology and computed tomography. Acta Clin Belg. 61 (5), 236-241 (2006).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Chen, J. J., Fu, S. Y., Chiang, C. S., Hong, J. H., Yeh, C. K. Characterization of tumor vasculature distributions in central and peripheral regions based on Doppler ultrasound. Med Phys. 39 (12), 7490-7498 (2012).
- El Kaffas, A., Giles, A., Czarnota, G. J. Dose-dependent response of tumor vasculature to radiation therapy in combination with Sunitinib depicted by three- dimensional high-frequency power Doppler ultrasound. Angiogenesis. 16 (2), 443-454 (2013).
- Bachawal, V. S. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Res. 73 (6), 1689-1698 (2013).
- Loveless, M. E., et al. A method for assessing the microvasculature in a murine tumor model using contrast-enhanced ultrasonography. J Ultrasound Med. 27, 12-1699 (2008).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Kodama, T., et al. Volumetric and angiogenic evaluation of antitumor effects with acoustic liposome and high-frequency ultrasound. Cancer Res. 71 (22), 6957-6964 (2011).
- Hwang, M., Hariri, G., Lyshchik, A., Hallahan, D. E., Fleischer, A. C. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. J Ultrasound Med. 29 (4), 597-607 (2010).
- Li, L., Mori, S., Sakamoto, M., Takahashi, S., Kodama, T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One. 8 (2), e55797 (2013).
- Springer, D. A., et al. Investigation and identification of etiologies involved in the development of acquired hydronephrosis in aged laboratory mice with the use of high-frequency ultrasound imaging. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 4, (2014).
- Papadopoulos, G., et al. A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites. J Vis Exp. (90), (2014).
- Vulcano, A. B., et al. Oral infection with enteropathogenic Escherichia coli triggers immune response and intestinal histological alterations in mice selected for their minimal acute inflammatory responses. Microbiol Immunol. 58 (6), 352-359 (2014).
- Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8 (1), 293-298 (2002).
- Kanojia, D., Vaidya, M. M. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol. 42 (7), 655-667 (2006).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312 (1-2), 12-29 (2006).
- Walk, E. L., McLaughlin, S., Coad, J., Weed, S. A. Use of high frequency ultrasound to monitor cervical lymph node alterations in mice. PLoS One. 9 (6), e100185 (2014).
- Pezold, J. C., Zinn, K., Talbert, M. A., Desmond, R., Rosenthal, E. L. Validation of ultrasonography to evaluate murine orthotopic oral cavity tumors. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 68 (3), 159-163 (2006).
- Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26 (3-4), 645-662 (2007).
- Sano, D., et al. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (4), 411-420 (2009).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clin Cancer Res. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vitale-Cross, L., et al. Chemical carcinogenesis models for evaluating molecular- targeted prevention and treatment of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2, 419-422 (2009).
