Protocol
3％の2-ヒドロキシエチルアガロースの調製
- 清浄な乾燥した100mlのガラス瓶に、2-ヒドロキシエチル0.9gのアガロースを添加（アガロースVII）を蒸留水30mlに続きます。
- 電子レンジ15秒間混合し、穏やかに渦巻きます。アガロース粉末が完全に溶解するまで、この手順を少なくとも3回繰り返します。
- 15分間この溶液を含むボトルをオートクレーブ。
- アガロース溶液は、さらに、使用前に室温まで冷却します。この溶液を室温で保管してください。
底層の調製：0.6％アガロースゲル
- 取り扱いの際にピペットで固化からアガロースを防止するために、37℃のインキュベーターで事前に暖かい、いくつかの5ミリリットルと10ミリリットルピペット。
- 部分的にボトルの蓋や電子レンジで15秒のための前作られた3％の2-ヒドロキシエチルアガロース溶液を緩めます。そして、静かに別の15秒のためのソリューション、電子レンジが渦巻きます。注意：agaroを旋回するときは注意してくださいSEソリューションソリューションは、空気にさらされると波及することができたときに上昇するためです。
- ボトル内の残留固体ゲル、さらに数秒間マイクロ波が存在する場合。
- 途中で固化からアガロース溶液を防止するために、次のステップの間に45℃の水浴中でアガロース溶液の入ったボトルを保管してください。
- 37℃の水浴中で暖かいMCF10DCIS媒体。注：MCF10DCISメディアはDMEM / F12、5％ウマ血清、5％のペニシリンストレプトマイシンから成ります。
- 転送滅菌50mlコニカルチューブに予め温めたピペットを用いて、3％アガロース溶液3ml。
- すぐに暖かいMCF10DCISメディアの12ミリリットルを加え、穏やかにメディアとアガロースを混合するためにコニカルチューブを反転。それは後にコロニー計数を妨害するように気泡を形成しないようにしてください。
- ゆっくりと気泡を形成することなく、6ウェル培養プレートの各ウェルにこの混合物を2mlを加えます。
- 6ウェル培養プレートのhorizontaをインキュベートLLY 1時間4℃で平らな面には、混合物が固化することを可能にします。
- 混合物が固化した後、30分間37℃のインキュベーターにプレートを配置します。底層が使用できるようになりました。
細胞を含有する層の調製：0.3％アガロースゲル
- トリプシン処理MCF10DCIS細胞および4×10 4 / mlの細胞濃度になるように、それらを希釈します。
- 予め温めたピペットを用いて、3％アガロースの2ミリリットルを取り、滅菌50mlコニカルチューブに移します。
- すぐにコニカルチューブにMCF10DCISメディアの8ミリリットルを加え、穏やかにメディアとアガロースを混合することが反転します。任意の気泡を形成することは避けてください。
- MCF10DCIS細胞（4×10 4 / ml）を2ミリリットルを取り、BB-CLA（0μM（DMSO）または1μM）で処理します。
- 1：1希釈、0.6％アガロースで細胞を混ぜます。
- 細胞 - アガロース混合物の1ミリリットルを取り、静かに6ウェル培養pの底層の上に追加します後期（2×10 4細胞/ ml）。
- 上層が固化することを可能にするために、少なくとも15分間、4℃で平坦な面に水平に6ウェル培養プレートに置き。
- 混合物が固化した後、給電層を追加する前の週の37℃のインキュベーターにプレートを配置します。
フィーダー層の4製造：0.3％アガロースゲル
- 電子レンジ15秒あらかじめ用意された3％の2-ヒドロキシエチルアガロース溶液。静かに別の15秒のためのソリューション、電子レンジが渦巻きます。
- 45℃の水浴中でアガロース溶液のボトルを平衡化します。
- 37℃の水浴中でMCF10DCIS媒体を温めます。
- 50mlコニカルチューブに暖かいMCF10DCISメディアの9ミリリットルで3％アガロース溶液1mlを混合し、穏やかにメディアとアガロースを混合するために反転します。気泡を形成することは避けてください。
- BB-CLA（0μM（DMSO）または1μM）との混合物を扱います。
- 静か用なし（この混合物の1ミリリットルを追加明は、底部とソフト層を含む6ウェル培養プレートの各ウェルに）泡。
- 混合物を固化することを可能にするために、少なくとも15分間、4℃で平坦な面に水平に6ウェル培養プレートに置き。
- フィーダー層が固化した後、37℃のインキュベーターにプレートを配置します。
- コロニー形成が観察されるまで、新しいメディアで細胞を補充するために、既存のフィーダー層の上に、0.3％アガロース/中/処理溶液の1ミリリットルを重ねることによって、この給紙手順を毎週繰り返します。注：柔らかくフィーダー層で寒天は非常に柔らかく、従って、フィーダー層からの追加の栄養素が容易に細胞に到達するために、細胞を含有する層中に拡散しています。
5.データ収集
- 軟寒天における細胞成長の2.5週間後、光学顕微鏡を用いて、各ウェル中のコロニーの数を数えます。定量化を容易にするために、透明性の上にグリッドを印刷しにグリッドを添付6ウェルプレートは、細胞がカウント中にある場所を特定するのに役立ちます。 （各コロニーの直径によって定量化されるように）、コロニーサイズが異なりますので、採点されるコロニーを判断するための基準コロニーサイズを事前に定義。例えば、70ミクロン以下のデータ分析が大きいのコロニーの大きさがあります。
- さらにコロニー形成を防止し、将来のカウントのために4℃でサンプルを保管してください。乾燥からゲルを防ぐためにパラフィルムで6ウェル培養プレートをシール。
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Representative Results
軟寒天コロニー形成アッセイは、癌細胞の腫瘍形成能を記録幅広い用途に使用することができます。この手法の主な利点は、半固体マトリックスが選択的足場に依存しない方法で増殖できる細胞の増殖に有利に働くということです。この特性は、主に癌細胞によってではなく、正常細胞によって示されます。我々は、主に薬剤による腫瘍増殖阻害の有効性を試験するために、この技術を使用して、乳癌細胞の腫瘍形成能にPADI遺伝子を含む目的の我々の遺伝子の過剰発現または枯渇の効果を試験します。ここでは、PADI2過剰発現MCF10DCIS細胞（図1及び2）の腫瘍形成阻害に対するBB-CLAの効果を評価しました。
結果は、BB-CLAが有意MCF10DCIS細胞由来のコロニーの形成を阻害することを実証する。3図は 、そのPADI阻害剤の存在下で、T DMSO対照と比較した場合、ここで両方のコロニー形成及びコロニーサイズの減少がありました。 [注：BB-CLA DMSOに溶解し、従って、DMSOを対照として使用した。】BB-CLAはDMSOためのコロニーのサイズながらMCF10DCIS細胞は20〜100ミクロンの範囲内に主だったために処理されたコロニーのサイズ制御は、成長の2.5週間後には70〜150μmのより広い範囲を示しました。
70ミクロンよりも大きいコロニーを計数した（ 図4）を分析しました。唯一の1967コロニーが軟寒天培地の2.5週間後にBB-CLA処理群で見られたのに対し、DMSO対照で3536コロニーの平均がありました。これは、PADI阻害剤による乳癌細胞の有意な腫瘍形成阻害（MCF10DCIS細胞）を示す、1μMBB-CLAの存在下での平均コロニー形成における44％の減少を表します。
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BB-CLAの図1.化学構造。
軟寒天コロニー形成アッセイのためのプロトコルの図2の概要図6ウェル培養プレートの各ウェルを、第一の0.6％アガロースゲル（下層）を塗布しました。 MCF10DCIS細胞およびBB-CLA阻害剤（1μM）またはDMSO（コントロール）のいずれかを含有する0.3％アガロースゲル混合物を0.6％ゲルの上に重層しました。週に一度、（BB-CLAを含む）を0.3％アガロースゲル混合物を、軟質層の上に添加しました。 2〜4週間後、コロニー形成が観察された、データ分析のためにカウントした。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
BB-CLAで処理されたMCF10DCIS細胞におけるコロニー形成の図3.イメージ。MCF10DCIS細胞は、BB-CLA（0μMDMSO）の存在（1μMBB-CLA）または非存在下で軟寒天中で増殖させました。 2.5週間後、コロニーを、低倍率画像と高倍率画像の光顕微鏡用倒立顕微鏡を用いて画像化した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
MCF10DCISコロニー数の定量化は、図4 BB-CLAの治療。MCF10DCIS細胞は、BB-CLA（0μM（DMSO）、または1μMBB-CLA）の異なる濃度で軟寒天中で増殖させた後 。 2.5週間後、個々のコロニー大きな目70ミクロンを計数しました。実験は4回繰り返した（N = 4）。対照および処理試料間の全細胞数の差の統計的有意性は、二つの標本スチューデントt検定（* p <0.005）によって決定しました。
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Discussion
軟寒天におけるコロニー形成の速度は、細胞型9によって異なり。したがって、細胞の数を最適化し、それに応じて調整されるべきで開始します。提案さ始動範囲は6ウェルプレートを使用してあたり4×10 2〜1×10 5細胞の間です。また、コロニーの大きさは、各細胞の増殖速度に応じて変化します。そのため、コロニーの大きさのために事前に定義されたカットオフは、下流定量分析のための個々のコロニーに注釈を付けるために必要とされます。ここでは、70ミクロンは最初のプレーティング由来の非増殖細胞の混入を避けるために、定量化されたよりも大きなコロニー。
3Dアガロースゲルを製造する際に最適な成長のために、それは、通常、2次元細胞培養に使用される同一の細胞培養培地を使用することが望ましいです。しばしば回培地を交換することは、したがって、細胞が新しい培地に適応できるようにする追加の継代を必要とする、細胞の増殖速度を変化させるためです。例えば、MCF10DCIS細胞は、RPMI-1640、DMEM、またはDMEM / F12培地中で最適に増殖させることができます。 MCF10DCIS培地をDMEM / F12にRPMI-1640から変更された場合しかし、細胞の増殖速度の顕著な減少があります。さらに、注意が血清を含まない、コロニー形成を10阻害される、ので、一定レベルの血清中濃度を維持するように注意すべきです。アガロースがマイクロ波された後さらに、ボトルメディア細胞を過熱を防ぐために細胞を含むと混合する前に45℃の水浴中で平衡化することを可能にします。アガロースは室温で急速に固化することを考えると、我々はまた、すべてのピペットと6ウェル培養プレートは、処理中に早期の凝固を防ぐために、アガロース溶液を添加する前に、37℃のインキュベーター内で予熱されることをお勧めします。
軟寒天コロニー形成法は、癌細胞株の範囲内で腫瘍形成能を測定するための貴重なツールであるが、いくつかの行は、軟寒天中で増殖しません。 Anot方法の彼女の潜在的な欠点は、軟寒天にプレーティングされた後、生存細胞を回収することができないことです。化合物は、より短い生物学的利用能期間がある場合はさらに、供給ステップは、より頻繁に（ すなわち、一日おきに）実行する必要がありますし、サンプルが7日未満に収集することができる必要があります。コロニーの大きさの閾値はまた、まだ観察する試料間の電位差を可能にしながら縮小する必要があります。これらの例では、コントロールは、偽陽性と偽陰性の結果を最小化するために、実験パラメータを最適化するために組み込まれる必要があります。多数のサンプルをテストするときさらに、この技術は時間がかかり、困難であることができます。しかし、技術の進歩は、これらの制限のいくつかを克服するために役立っています。 （この原稿に記載されているように）従来のソフトアガーアッセイは、典型的には、6ウェル培養プレートまたは6ミリメートル培養皿を使用しています。自動プレートリーダーでは、しかし、multiplE試料は384ウェルプレート11で処理することができます。例えば、アラマーブルー及びテトラゾリウム色素コロニーとして染料と研究者プリロードされた腫瘍細胞は、このように手動でコロニー数11をカウントする必要がなくなり、プレートリーダーを用いて定量化されます。この高スループット能力は、従って、大規模ながん薬物スクリーニングのために適しています。
要するに、軟寒天アッセイは、薬物、ホルモンに対する感受性に関して、癌細胞（乳癌、前立腺癌、卵巣癌、など）の広範囲の腫瘍原性を評価するために使用することができる貴重な前臨床技術であります熱、低酸素症、およびその他の処理条件の多数。アッセイは、より良い癌の進行のメカニズムを理解し、新しい癌治療の抗腫瘍性をテストしたい癌研究者のための簡単かつ有益なツールを提供し続けています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
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