Summary
Mikroglia aktivering og mikrogliose er centrale reaktioner på kronisk neurodegeneration. Her præsenterer vi metoder til in vivo, langsigtet visualisering af retinale CX3CR1-GFP + mikrogliaceller celler ved konfokal oftalmoskopi og til grænsen og morfometrisk analyser at identificere og kvantificere deres aktivering. Vi overvåger mikrogliaceller ændringer i løbet tidlige stadier af aldersrelateret glaukom.
Abstract
Mikroglia, som er CNS-hjemmehørende neuroimmune celler, omdanne deres morfologi og størrelse som reaktion på CNS-skader, skifte til en aktiveret tilstand med tydelige funktioner og genekspressionsprofiler. Roller mikroglial aktivering i sundhed, skade og sygdom forbliver ufuldstændigt forstået på grund af deres dynamiske og komplekse regulering som svar på ændringer i deres mikromiljø. Således er det vigtigt at ikke-invasivt at overvåge og analysere ændringer i mikroglial aktivering over tid i den intakte organisme. In vivo studier af mikroglial aktivering er blevet forsinket på grund af tekniske begrænsninger til sporing mikroglial adfærd uden at ændre CNS miljø. Det har været særligt udfordrende ved kronisk neurodegeneration, hvor langsigtede ændringer skal spores. Nethinden, et CNS orgel modtagelig for ikke-invasiv levende billeddannelse, tilbyder et kraftfuldt system til at visualisere og karakterisere dynamikken i mikroglia aktivering under kroniske lidelser.
in vivo billeddannelse af retinal mikroglia, hjælp konfokal oftalmoskopi (cSLO) og CX3CR1 GFP / + reporter mus, at visualisere mikroglia med cellulære opløsning. Også, beskriver vi fremgangsmåder til at kvantificere månedlige ændringer i celleaktivering og tæthed i store celleundergrupper (200-300 celler pr nethinden). Vi bekræfter brugen af somal område som en nyttig parameter til levende sporing af mikroglial aktivering i nethinden ved at anvende automatiseret tærskel-baserede morfometriske analyse af in vivo-billeder. Vi bruger disse levende billede erhvervelse og analyserer strategier til at overvåge de dynamiske ændringer i mikroglial aktivering og mikrogliose under tidlige stadier af retinal neurodegeneration i en musemodel af kronisk glaukom. Denne tilgang bør være nyttigt at undersøge bidrag mikroglia til neuronal og axonal fald i kroniske CNS-lidelser, der påvirker nethinden og synsnerven.
Introduction
Mikroglia er neuroimmune celler, der udelukkende bor i det centrale nervesystem (CNS), da tidlig fosterudvikling og i hele voksenlivet. Udstyret med en kompleks repertoire af receptorer, der mikroglial aktivitet og regionalt heterogenitet reguleret af deres tovejs samspil med nabolandene neuroner, glia, blod-hjerne-barriere og infiltrerer neuroinflammatoriske celler 1,2. Basal mikrogliaceller funktioner bidrager til fysiologiske vedligeholdelse og reparation, da de prøve deres område forstyrrelser i homøostase 3,4. Under CNS skade eller sygdom, mikroglia er de første respondenter til neuronale signaler, så udløser deres overgang til en reaktiv fænotype, kaldet "aktiveret mikroglia 2,5-7. Mikroglia aktivering involverer en indviklet cyklus af genet og proteinekspression, som er koblet til celle soma og proces resizing og remodeling 6-9. Mikroglia aktivering, samt celle omfordeling ogklyngedannelse, kan ledsages den lokale samlede stigning i antallet af celler (betegnet mikrogliose). Dette kan skyldes celleproliferation og selvfornyelse, med eller uden rekruttering af monocytter blodafledte 3,4,7,10-14. I en lang række aldersbetingede afhængige, kroniske CNS-sygdomme, vedvarende mikrogliose og mikroglia aktivering parallel sygdomsprogression 15-19. Hvor mikroglia indvirkning neurodegeneration fortsat uklart, hovedsageligt fordi de spille både neurobeskyttende og skadelige roller, som kan have forskellige bidrag til sygdomsdebut og progression. Levende billeddiagnostiske undersøgelser med henblik på at forstå kroniske CNS sygdom har overvåget mikroglial adfærd i den beskadigede CNS dyremodeller og mennesker, og viste, at mikrogliaceller ændringer er påviselige begyndelse ved sygdom stadier tidlige 15-17,19,20. Således er det afgørende at udvikle metoder til at opdage og overvåge mikroglial aktivering in vivo.
Non-invasiv DETEktion af regionale ændringer i hjernens mikroglia aktivering blev etableret som en vigtig in vivo indikator for neurodegenerativ sygdomsprogression, hjælp molekylær billeddannelse eller bioluminescens og positronemissionstomografi eller magnetisk resonans 18,21,22. Disse meget kvantitative og ikke-invasive molekylære og nuklear billeddiagnostiske metoder registrerer gliose med regional opløsning. Alternativt har to-foton konfokal billeddannelse i CX3CR1 GFP / + mus tillod observation af hjernen mikroglia med cellulære opløsning 3,4,9,20,23-28. Imidlertid begrænser denne tilgang langsigtet og gentagen observation af kroniske mikrogliaceller ændringer på grund af den potentielle risiko for at forstyrre deres adfærd ved selv minimalt invasive hjerne billeddiagnostiske procedurer 29. Alternativt nethinden giver optimale betingelser for direkte, in vivo visualisering og gentagen overvågning af mikroglia i deres intakte CNS niche i hele aldring, efter akut skade, ogpotentielt under kroniske neurodegenerative sygdomme. Således har nyere undersøgelser vist sig gennemførligheden af høj opløsning billeddannelse af retinale mikroglia udtrykker GFP ved at tilpasse det konfokale scanning laser oftalmoskopi (cSLO) til billedet levende CX3CR1 GFP / + mus. Dette er blevet brugt til at spore ugentlige ændringer i GFP + celleantal i individuelle mus i op til 10 uger efter akut induceret skade eller okulær hypertension 30-36.
Vi har udvidet denne fremgangsmåde til at udføre langvarig billeddannelse over flere måneder, og kvantitativt spore ændringer i mikroglia aktivering baseret på soma størrelse ved hjælp morfometriske analyse. Somal størrelse blev defineret som en nyttig metrik af mikroglia aktivering med levende billeddannelse undersøgelser under anvendelse af to-foton konfokal mikroskopi i kortikale skiver til at udføre in vivo-billeddannelse af CX3CR1-GFP + microglia 9. Disse og andre undersøgelser viste også sammenhængen mellem somal størrelse og niveauer af Iba1 proteinekspression, which øger også med aktivering 9,37. Således kan aktiverede mikroglia identificeres med levende mus, og deres antal og fordeling overvåget over tid under CNS sundhed og sygdom.
Denne protokol beskriver metoder til cSLO levende billede indsamling og analyse til at overvåge mikrogliaceller celle numre, distribution og morfologiske aktivering under retinal ganglion celle (RGC) degeneration (figur 1). Således er denne undersøgelsen anvendes: 1) en musemodel for nedarvet glaukom (DBA / 2J), der undergår aldersafhængig synsnerve og retinal neurodegeneration og viser bemærkelsesværdig variabilitet i sygdomsprogression mellem 5 og 10 måneders alderen 38,39, 2) månedligt cSLO in vivo-afbildning for langsigtet visualisering af GFP + -celler i nethinden og ikke-myelinerede synsnerve af heterozygote CX3CR1 GFP / + DBA / 2J-mus i alderen 3-5 måneder, 3) direkte billedvisning analyse ved segmentering og tærskling at isolere celle somata og foranstaltning denir område. Disse strategier anvendes til at vurdere kinetikken af retinale microgliale aktivering stater i de tidlige stadier af kronisk glaukom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo imaging udføres i patogenfrie anlæg, som anvender protokollerne godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Utah.
BEMÆRK: Denne billeddannelse protokol bruges til reporter mus, i hvilke retinale microglia og infiltrerende monocytter / makrofager udtrykker grønt-fluorescerende protein (GFP) under kontrol af den fractalkin receptor locus (CX3CR1).
1. In Vivo Imaging af retinal GFP + Mikroglia af Konfokal Scanning Laser oftalmoskopi (cSLO)
- Tænd for vandet-kontrollerede varmesystem, indstillet til at stabilisere musen temperatur mellem 35-37 ºC under proceduren, og forbinde to varmepuder.
- Starte systemet konfokale scanning laser oftalmoskop (cSLO) (figur 2A). Åbn cSLO programmet, indtast de oplysninger, der kan identificere den enkelte mus og sætte en hornhinde krumning på 2 mm (Patient data menu).
- Forbered imaging. Sikkert passe en ren 55º bredt felt objektiv på sin sokkel. Forbered oftalmoskop imaging platform ved at sikre en varmepude dækket med rent papir. Brug clips til at flade puden og papir og holde dem fra at blokere bevægelsen af objektivlinsen.
- Bedøver musen ved intraperitoneal injektion af 1,3% 2,2,2-tribromethanol og 0,8% tert-amylalkohol (250 mg / kg legemsvægt; 0,5 ml / 25 g legemsvægt) ved anvendelse af en 30½ G nål fastgjort til en 1 ml engangs sprøjte. Retur musen til sit bur, holdt over en varmepude.
BEMÆRK: levering af bedøvelsesmiddel ved injektion versus indånding tillader nemmere placering af musen til billedbehandling og uhindret adgang til øjnene, fri for næse kegler og slanger. - Når dyret stopper, og ikke reagerer til hale knibe, fremkalde elev dilatation med Tropicamid og phenylephrin (0,5% hver), ved at placere dyret tilbøjelige og dækker begge øjne med dråberne for 7 min.
- Efter 5 minutter pblonde musen udsat på midten af oftalmoskop platform, og fit kontaktlinser over begge øjne, anvende minimalt tryk.
BEMÆRK: Kontaktlinser er små og skrøbelige, men kan forsigtigt håndteres med fingrene, selvom pincet kan bruges i stedet 40. Brugen af kontaktlinser er valgfrit, men anbefales, da det minimerer øjet tørhed og bevarer hornhindens transparens under billedbehandling. - Efter 7 min, orientere musen med højre øje vender objektivlinsen og bane parallelt med objektivlinsen, at holde dyret og uindskrænket nær kanten af platformen (figur 2B). At indsamle billeder af sammenlignelig mætning og orientering, konstant holde afstanden fra øjet til objektivlinsen, samt tilpasningen af øjet til lysbanen hele imaging sessioner. Clip lange whiskers interfererer med observation af øjet.
BEMÆRK: For den næste 8-10 min, vil musen ikke flytte eller blinker, og vil ånde med blide trækmenter, der spores af cSLO Eye Tracking ART (automatisk realtid) tilstand, som justerer scanningen hoved holdning baseret på landemærker fundus med høj kontrast. Past det tidspunkt begynder mus pustende og blinker, hvilket gør imaging upraktisk. - Hvis billeddannelse udføres uden anvendelse af kontaktlinser, gælder PBS falder til begge øjne hver 2-3 min for at forhindre dem i at tørre.
- Saml en fundus billede af den retinale vaskulatur og optisk disk, der fokuserer på den indre nethinde.
- Vælg den infrarøde funktion (IR) og justere indstillinger til 820 nm excitation, 100% laser magt, 40-60% følsomhed (figur 2C).
- Arbejde i high-speed mode (12,6 ramme / sek), find øjet ved hjælp af joysticket til at drive oftalmoskop. Ved lav forstørrelse, inspicere hornhinden og linsen for skader eller opacitet, og udelukke fra undersøgelsen øjnene med defekter eller skader, der vil påvirke billeddannelse nethinden (figur 3A).
- Find den optiske disk-området (overfladesynsnervehovedet, ONH) ved at bringe målet tættere på øjet, derefter centrere billedet på det og lås denne position ved at skrue på joysticket. Denne tilpasning af øjet til oftalmoskop er nøglen til at opnå jævn fokusere og emission henover billedet.
- Visualisere de indre plan i nethinden, samt ONH, ved hjælp af de store blodkar placeret på glaslegemet overfladen af nethinden som reference brændplan (59 og 60 D), eller dybere (55 D) i øjnene viser udgravet optik diske. Den optimale fokus bør løse cirkulerende blodceller inden store blodkar, med deres lumen og vægge klart adskilte.
- Optimer billedet mætning ved at justere drejeknappen på berøringsskærmen kontrolpanelet, indtil en hvid glorie af ensartet belysning spænder i det meste af 55º fundus felt omkring den optiske disk (ved hjælp af let overeksponering). Dernæst sænke mætning for at optimere kontrasten indtil blodlegemer bevæger sig langs de større fartøjer kan tydeligt løst. Hvis omdrejningspunkt mørkeområder fortsætter, ikke skyldes beskadigelse af nethinden, justere øjet til kameraet, indtil en ensartet lyst billede opnås. Denne justering er afgørende at fange reproducerbare sæt billeder på plads og kvalitet.
- Indsamle en høj opløsning IR billede af den centrale nethinden (1,4-1,7 mm i diameter, afhængigt af alder), i gennemsnit 30 billeder i realtid (4,7 billeder / sek, normaliseret), for at forbedre signal-til-støj-forhold (figur 2D ).
- Umiddelbart erhverve et fluorescens-billede af GFP + microglia og / eller infiltrerende monocytter lokaliseret til de indre plan i nethinden og ONH.
BEMÆRK: Optimering af IR fundus billede af nethinden bestemmer beslutning af fluorescensen billedet af GFP + -celler, såvel som omfanget af indre nethinde kalibreret. Manglende fokusere de indre plan i nethinden, som kan påvises ved dårlig opløsning af karrene, vil resultere i dæmpede GFP + celle visninger (figur 3B). Manglende tilpasning IR Saturation korrekt og ensartet påvirker fluorescensbillede (FA), indføring artefakt-variationer i GFP + celle intensitet og størrelse (figur 3C).- Skifte mellem at fluorescensimagografi mode (FA) i touch screen panel, bruger blå, 488 nm laser excitation (460-490 nm barriere filtersæt), og indstillinger erhvervelse (100% laser magt og 100-125% følsomhed), der holdes konstant for alle mus (Figur 2E).
- Saml et enkelt xy-punkt, todimensionale fluorescens billede af nethinden, og straks tage et fundus billede med samme position (100x scan gennemsnit; 55º scan vinkel for begge billeder, figur 2F).
- Fang en multipunkt billede ved at vælge "komposit" i kontrolpanelet (Figur 2G) og flytte oftalmoskop højre og venstre, panorering nethinden tværs nasal-temporale akse (figur 2H).
BEMÆRK: Efter scanning af et enkelt xy-punkt billede (100x skan gennemsnittet), softwaren automatisk gennemsnit nye scanninger af de samme og nye områder (afgrænset med en grøn cirkel i løbet optimal scanning eller rød, når scanningen er umuligt), og sømme alle xy-positioner i realtid. Det resulterende sammensatte billede spænder 1,5-1,7 mm på den vandrette akse x 3-4 mm i den lodrette akse (55 ° x 120-124º scan vinkel).
- Komplet billeddannelse af hver mus inden for 15 min efter induktion af anæstesi, før blinke og motion genstarter.
- Fjern kontaktlinser, hydrat øjne med PBS og sende dyret tilbage til sin varmet bur, kontrol adfærd indtil fuld genopretning af motilitet.
- For langsgående undersøgelser under anvendelse intermitterende cSLO-imaging sessioner i det samme individ mus, gentag billeddannelse ikke mindre end 3 dage fra hinanden for at undgå den kumulative toksicitet af anæstesi, samt irritation corneal.
2. Levende Billedbehandling og -analyse
- Sekventiel billede tilpasning:
- Justerfundus billeder for en tidsserie af det samme øje hjælp vaskulaturen og optisk disk som pejlemærker. Åbn alle billeder i en kommerciel slide-show præsentation program, ved at trække hvert billede i den foregående indtil deres optiske diske justeres på xy- plan (den øverste billede vises semitransparent mens at blive trukket), og drej den øverste billedet, indtil dets store blodkar overlapper vaskulaturen på billedet nedenfor (fokus på fartøjer længst fra optikken disken). Optag rotationsvinklen for hvert billede, og gemme denne tidsserier for fremtidig reference, holde styr på mus og øjne identitet.
- Juster tilsvarende serie af enkelt xy-point fluorescensbilleder ved at anvende den indspillede vinkel at korrigere xy rotation på hvert tidspunkt under anvendelse af en raster grafisk editor program. Derudover justere opløsning til 300 dpi (uden rescaling) og baggrund (i RGB-tilstand, skal du vælge Niveauer og prøve lumen af et blodkar som sort). Gem disse billedersom TIF-filer, tilføje "justeret" til deres navne.
- Mikroglial celle segmentering:
- For at identificere GFP + celler i den centrale nethinden, åben i FluoRender på "justeret" TIF-fil, der svarer til den tidligste tidspunkt / alder. Zoom billedet så det passer til skærmen, definere derefter Render visning (komposit, retvinklede, interpoleret) og dets egenskaber (0,58 gamma, 255 mætningspunkt, 255 luminans, 195 alfa og 1,00 skygge), vælge både RG kanaler som synlige (skjul B-kanal ved at dobbeltklikke på den i Workspace ramme; figur 4A).
- At vælge individuelle celler, tærskel den røde kanal (skal fremhæves på Workspace ramme), ved at øge lav tærskel indtil hovedparten af cellerne er maskeret (hvid) med minimum overlap og celle processer (cyan), samtidig med at den høje tærskel konstant (255). Den lave tærskelværdi varierer mellem 100 og 170, afhængigt af fluorescensintensitet (figur 4B </ Strong>).
- Gemme denne visning med den røde kanal kun synligt (Capture kommando) som en ny TIF fil, tilføje "cellsegm" til sit oprindelige navn (figur 4C). Ved hjælp af en generisk raster grafisk editor software, vend sin gråtoner og justere opløsning til 300 dpi som ovenfor, og gemme igen som RGB (figur 4D).
BEMÆRK: Slet mapper (projekter) automatisk skabt af FluoRender, og gemme den anvendte tærskel for fremtidig reference.
- Mikroglial soma segmentering og morfometri:
- For at identificere GFP + celle somata for området kvantificering bruge billedanalyse software med automatiserede intensitet målinger og tærskel kapaciteter samt tærskel-baserede objekt optælling og måling. Åbn "cellsegm" TIF-fil, og vælg rescaling metoden (spline) og den røde kanal (klik røde fane i RGB). Forbedre visualisering ved at fravælge "view-kanal i farver" (højreklik på den røde RGFanen B), og vælge "supplere farver" (billede / Juster billede) for at vende gråtoner og se cellerne i grå / sort på hvid baggrund (Figur 4E).
- Kalibrer billedet til 1,4-1,7 mm afhængig af alder, ved at trække en vandret linje på tværs af hele billedet (kalibrering, Quick Calibration).
- Segment individuel celle somata ved at anvende intensitet tærskling (figur 4B). Til dette arbejde på den røde RGB kanal og åbn Threshold Intensitet funktionen (Object Count, vælge kommandoen "count update") for at spore todimensionale parametre for hver tærsklingsbehandlet region af interesse (ROI), der repræsenterer individuelle somata.
- Definer tærsklen intensitet i intensiteten histogrammet ved at vælge den laveste 50-60% af de 255 niveauer og raffinering endelige tærskelværdi ved visuelt vurdere overlapning mellem tærsklen farve masken (blå) og cellen soma omkreds (grå) i individuelle celler (Figur 4E).
- Vurdere nøjagtigheden af celle soma masker til at repræsentere de somal dimensioner ved at måle området før og efter segmentering i 10 celler og acceptere det valgte tærskel interval, hvis målingerne afviger mindre end 10% (brug Binary Toolbar og Kommenterede Målinger).
- Identificere manuelt somal ROIs der omfatter flere celler og adskille disse elementer (fjerne eller separate ROIs hjælp af Binary Toolbar kontrol, eller Object Catalog), mens skifte til / fra den binære til direkte visualisere celler (Figur 4F).
- Klassificere mikrogliaceller som ROI'er med somal områder større og mindre end 50-60 um 2 for at diskriminere celle somata svarende til aktiveret mikroglia og deaktiveres mikroglia henholdsvis ved hjælp Area Begrænsning.
BEMÆRK: Hver celle somal delmængde identificeres med en anden pseudocolored binær lag, og kan yderligere karakteriseres for andre morfologiske parametre (perimeter, cirkularitet, etc.), såvel som kvantificeret inden diskrete retinale sektorer (figur 4G). Gem det analyserede billede som en ND2 fil. - Kontroller processen og forgrening kompleksitet i individuelle aktiverede mikrogliaceller, ved overlejring af somal maske og enkelt xy -point billede (kontrast steg 50% Figur 4H). Tæller manuelt processerne direkte strækker sig fra cellen soma eller måle diameteren af polygon omfatter den lysthus (brug Binary Toolbar og Kommenterede Målinger).
BEMÆRK: Aktiveret celler mangler processer eller bære få (<4) og korte (<2x somal diameter) dem, i modsætning til ikke-aktiverede celle processer, som omfatter en forgrenet og omfattende lysthus (> 3-10x somal diameter) omkring deres relativt lille soma. - Identificere celler manuelt med somata mindre end <20 um 2 og / eller GFP-ekspression under detektionsgrænsen, som derfor uopdaget af itensity tærskelværdiansættelse. Brug Taksonomi kommando i Noteringer at tælle manuelt identificerede elementer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores seneste in vivo studier brugt disse levende indsamling og analyse af billedet metoder til at visualisere og spore kinetik og mønstre af ONH og retinale mikrogliaceller ændringer i de tidlige stadier af kronisk glaukom og deres forhold til sen neurodegeneration 59. Her illustrerer vi en cSLO billede erhvervelse protokol at visualisere mikrogliaceller over et stort område i den centrale nethinden i individuelle unge heterozygote CX3CR1-GFP DBA / 2J nethinder (figur 5). Baseret på den høje celle opløsning, anvender vi live-billedet tærskelværdiansættelse og morfometriske analyser, som tillader automatisk segmentering af individuelle GFP + celler og somata (figur 6).
For at overvåge udviklingen af den lokale mikrogliose og / eller mikroglia aktivering ved aldre forud påviselig neurodegeneration i denne model for kronisk glaukom, målte vi månedlige variationer af total mikroglia celletæthed i de enkelte unge heterozygot Cx3CR1-GFP DBA / 2J nethinder (n = 10) mellem 3-5 måneders alderen (figur 7A). Overensstemmelse med det variable progression af neurodegeneration i individuelle øjne 41-44, vores analyse afslører variable niveauer for retinal mikroglia aktivering og mikrogliose tværs øjne på hver alder (figur 7B), og detekterer dynamiske ændringer i densiteten af samlede og aktiverede mikroglia inden for de enkelte nethinder (Figur 7C). Mærkbart, er antallet af aktiverede mikroglia frakoblet fra samtidige ændringer i alt GFP + celletæthed. Disse in vivo resultater bekræfter tidligere ex vivo analyse af microgliale ændringer i DBA / 2J-mus 45. Således cSLO levende påvisning og måling af retinal mikroglial aktivering kan tjene som indikatorer for tidlig sygdomsprogression inden for de enkelte øjne, og kan potentielt være knyttet til at indlede begivenheder glaukom patogenese.
Figur 1:. Livebillede erhvervelse, behandling og analyse workflow cSLO blev brugt til at billeddata hundredvis af GFP + mikrogliaceller / perifere monocytceller lokaliseret til den centrale ~ 1,7 mm 2 af musen indre nethinde. Fluorescensbilleder (FA) blev erhvervet månedligt for de samme mus, og tilpasset hjælp infrarøde (IR) fundus billeder af den retinale vaskulatur og vitreal overflade som reference. Segmentering af GFP + -celler og somata resulterede anvendelsen to separate trin af intensitet-tærskelværdier til FA retinale billeder. Morfometrisk analyse af binære repræsenterer celle somata tillod måling af individuelle somal områder. GFP + celler med somal området over 50 um 2 blev klassificeret som aktiveret. Densitet af totale og aktiverede GFP + -celler blev målt for individuelle retinale FA billeder, og undersøgelse af arbor udvidelse og forgrening kompleksitet blev udført ved direkte observation af FA billeder.
Figur 2: Levende kontrol billedoptagelse i cSLO Spectralis (A) Manuel touch screen panel display på indvielse.. (B) cSLO software billedbehandling vindue, som viser hovedet af en levende mus. (C) Indstillinger udvalgt til infrarød billeddannelse (lyser blåt). (D) Fundus billede af nethinden under tidstro erhvervelse (venstre panel) og gennemsnit (højre panel). Normalisering kommandoen angivet med sort cirkel. Arterier og vener udstråler fra synsnervehovedet er synlige (i parentes), som er de optiske axonale bundter (pile) i mellem blodkarrene. (E) Indstillinger udvalgt til fluorescens billeddannelse inden for en enkelt xy punkt. (F) Single-point fluorescens (FA, 488 nm) billeddannelse under anskaffelse (middelværdi). Than mindre billede (til venstre) viser en individuel scanning, det større billede (til højre) viser forløbet af intensitet gennemsnit. (G) Indstillinger udvalgt til erhvervelse af en multipunkt (komposit), fluorescens billede. (H) Multipoint fluorescensimagografi erhvervelse, viser scanningen i gang, som softwaren identificerer sig med en grøn cirkel (eller rød, når erhvervelsen er ikke muligt). Scale søjler repræsenterer ~ 5 mm (B) eller 250 um (DH) Klik her for at se en større version af dette tal. .
Figur 3: Vigtige okulære fejl og billedbehandling fejl, der kan forhindre korrekt cSLO billeddannelse af mikrogliaceller (A - C) Okulær skader eller mangler, samt billedoptagelse fejl.s kan forhindre pålidelig billeddannelse af GFP + celler lokaliseret til de inderste planer nethinden. (A) Nogle brutto øje defekter er let påviselige i fundus billeder, herunder hornhinde eller linse opacitet, eller skade og uddybning af den optiske disk-området, som alle forhindre klart billeddannelse af GFP + -celler. (B) Fokusering enten over (væggene i fartøjerne bliver skelnes fra lumen) eller under den indvendige overflade af nethinden (skibene er knap synlige) reducerer spores GFP-fluorescens emission fra cellerne placeret på nerve fiber og ganglion celle lag. (C) Saturationsniveauet forkert eller ujævnt sæt kan resultere i lyse men overmættede billeder (med celler mangler opløsning) eller billeder med overstregede områder. Scale søjle repræsenterer 250 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Binær tærskling-baserede kvantificering af mikrogliaceller celletal og somal område (A - D) Trin af celle segmentering i FluoRender (A) Navigation vindue med afsmeltet visning af en repræsentativ single-point fluorescens billede af mikroglia i den centrale nethinden.. (øverste panel); svarende rendering egenskaber (lavere panel). (B) Det samme billede under en celle segmentering rutine, ses som RGB, med tilsvarende tærskel indstillinger (nedre paneler). Tærsklingsbehandlet celler er repræsenteret af hvide pixels og overlejret til deres processer i cyan. (C) Billede af celle masker opnået efter celle segmentering. (D) Forrige maske med inverterede gråtone værdier for yderligere billedbehandling. (E - H) Trin af somal tærskelværdiansættelse og kvantificering. (E) Anvendelse af intensitet tærskel at segmentere mikroglia somata baseret på deres tidligere segmentering celle. RGB intensitet histogram (venstre) tillader tærskelværdier ved direkte udvælgelse af det lavere 50-60% vifte af intensiteter (0 til 127 til 153). Denne segmentering skaber en kvantificerbar maske, der isolerer individuelle mikroglial somata (blå). Billeder er skaleret ved hjælp af spline-funktionen (oval til højre). (F) Automatiske tærskel-baserede målinger af individuelle ROI / somata (øverste panel) og ROI silhuetter (Object Butik, bund panel), der anvendes til at korrigere overlappende ROI'er bruger Binary Tools (højre panel) for manuel separation eller erosion. (G) Klassificering af de enkelte somal områder efter område Restriction (øverst til venstre panel). Segmenteret somata er klassificeret som ROI'er mindre og større end 50-60 um 2, og de binære lag til hver klasse af somata tildeles forskellige farve pixels (grøn ennd magenta, henholdsvis). (H) Overlay for segmenterede somata (grøn) på det oprindelige billede (med øget kontrast), der anvendes til direkte observation af processen kompleksitet i individuelle aktiverede celler (venstre panel). Forstørret visning af celle dorne. Scale søjler repræsenterer 250 um (AH), eller 50 pm (H, indsat). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Høj opløsning visualisering af CX3CR1- GFP + mikroglia / monocytter lokaliseret til det indre mus nethinden af levende konfokal scanning laser imaging (A) Single xy- punkt cSLO billede, der viser GFP + celler i det centrale. nethinden i en 2 måned gamle DBA / 2J mus (venstre). Forstørret visning (til højre), der viser ONH området (cirkel), blodkar (poster) foret med perivaskulær mikroglia / makrofager og parenkymal mikroglia flisebelægning den centrale nethinden. (B) Multipoint billede, opsamlet umiddelbart efter enkelt punkt at visualisere mikroglia i et større område retinal (⅓ af nethinden). (C, D) Identiske billeder, vist med omvendt gråtoner for optimal observation af cellemorfologi og kompleksitet (minimalt korrigeret for kontrast og opløsning). Somal størrelse og form kan løses i de fleste celler (venstre). Lysthuset udvidelse og celle forgrening kan løses i cellerne med store somata (højre, og 3 individuelle celler). (E) Infrarød fundus billede af vaskulaturen og optisk disk anvendes til xy -plane tilpasning af sekventielle billeder. Scale søjler repræsenterer 250 um (A, B og E), og 25 um (C, yderst til højre).es / ftp_upload / 52731 / 52731fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Segmentering af mikroglial celle og somata (A) GFP + celler leveres af segmentering i 2D hjælp FluoRender. (B) tilsvarende celle somata, detekteres ved hjælp tærsklingsrutine konfokal billedanalyse-software. (C) Binary maske af celle somata modtagelig for kvantitativ analyse. (D) Klassificering af segmenteret celle somata efter område at diskriminere aktiverede mikrogliaceller (> 50-60 um 2, magenta) og ikke-aktiverede celler (<50 um 2, grøn). Dim og små celler (<10-20 um 2, gul asterisk) identificeres manuelt i det oprindelige billede med inverteret gråtoner (
Figur 7:. Longitudinal sporing af mikroglial celletæthed og aktivering i unge DBA / 2J nethinder (A) Levende cSLO fundus og FA billeder af det samme øje, erhvervet fra 3-5 måneder gamle. Sekventielle FA billeder blev anvendt til at kvantificere ændringer over tid i samlede antal CX3CR1-GFP + -celler lokaliseret i den centrale ~ 1,7 mm2 af nethinden. Tæller inkluderet parenchymale og perivaskulær mikroglia, men udelukkede celler grupperet på ONH (position indikeret med hvid cirkel). (B) tidsforløbet analyse af retinal mikroglia celledensitet og aktivering ved aldre foregåendeneurodegeneration i DBA / 2J kronisk glaukom (n = 10 nethinder pr alderen). Antal samlede GFP + celler og aktiverede mikrogliaceller (somal område> 50 um 2) pr mm2 af centrale nethinden. Hvert datapunkt repræsenterer et enkelt retina, og midler til hver aldersgruppe er repræsenteret med en vandret linie. (C) Den månedlige sporing af antallet af totale GFP + -celler og af aktiverede mikrogliaceller i en enkelt nethinden. Der er parallelle men kvantitativt forskellige ændringer i de samlede og aktiveret celledensitet, med mere dynamisk variation i densiteten af morfologisk aktiverede celler. Scale søjle repræsenterer 250 um (A). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levende overvågning af mikroglial celleantal og morfologiske aktivering under en neurodegenerativ sygdom kræver brug af ikke-invasive billeddannende metoder, der tillader den detaljerede visualisering af celle- funktioner. Efter billeddannelse skal mikrogliaceller isoleres (segmenteret) for morfometrisk analyse ved brug af flere tærskelværdier skridt til at vurdere somal størrelse og / eller proceskompleksitet som udlæsninger for mikroglia aktivering. I denne protokol, beskriver vi metoder til live-billedet erhvervelse hjælp cSLO, og kvantitativ analyse af mikroglial aktivering baseret på sekventiel celle og soma segmentering. Vi anvender disse strategier til at vurdere kinetikken for retinal mikroglia aktivering og mikrogliose over 2 måneder i forbindelse med en kronisk neurodegenerativ sygdom i nethinden.
Reporter mus og microglia / perifere monocytter celletyper
Anvendelsen af mus, som udtrykker GFP under kontrol af den fractalkin receptoren (CX3CR1)locus 46 muliggør pålidelig identifikation af bosiddende mikroglia, og robust GFP-ekspression tillader bemærkelsesværdig in vivo visualisering 30-32,34,36. Her bruger vi en understamme af DBA / 2J mus, afledt ved tilbagekrydsning C57BL / 6.129P- CX3CR1 tm1Litt / J-mus 46 i DBA / 2J genetisk baggrund 59. Perifere monocytter og makrofager, som kan invadere CNS under sygdom eller tilskadekomst, også udtrykker GFP tag 15,46,47.
Levende billeddannelse undersøgelser af mikroglia i den neurodegenerative retina
Vores in vivo sporing af CX3CR1-GFP / + retinale celler under anvendelse cSLO bygger på tidligere undersøgelser, der overvåges ændringer i retinal GFP + celleantal efter akut skade i op til 10 uger 30-32,34,48. Her, vi visualisere CX3CR1-GFP / + mikroglia / perifere monocytter med cellulær opløsning ved månedlige cSLO billeddannelse af nethinden i den tidlige progression af kronisk glaukom. Endditionally bruger vi levende billede automatiseret tærskel-analyse til at påvise og kvantificere celle resizing og remodellering med nok rumlig og tidsmæssig opløsning at overvåge ændringer i aktiverede og totale mikroglia tæller inden for de enkelte øjne og på tværs enkeltpersoner.
Tekniske begrænsninger cSLO billeddannelse af GFP + mikroglia i nethinden
Vi fandt billedkvalitet at være konsekvent og reproducerbar, som illustreret ved en sammenligning af single versus multi- xy punkt billeder opnået i en enkelt session (figur 5). , Konsekvent og reproducerbar erhvervelse GFP + cell imaging, i en enkelt session og over tid, er dog kritisk afhænger af valget af stabile parametre for fundus og fluorescens cSLO billeddannelse. Tilpasning af øjet og optisk disk til cSLO mål bestemmer ensartethed mætningsniveauer og fokus på konfokal plan interesse 49. Unøjagtige og / eller uensartet specificatipå af mætningsniveauer kan generere artefakt variationer i GFP afsløring, autofluorescens baggrund, og celle og lysthus opløsning. Til korrekt at fokusere på mikroglia lokaliseret til nerve fiber og ganglion cellelag, er det afgørende at tilpasse og fokusere på de retinale blodkar og på axonale bundter på vitreal overflade ved IR fundus billeddannelse. Dette tilvejebringer et referenceplan for at lokalisere GFP + -celler ved FA. Den nødvendige fokusering er nødvendig for at skifte fra IR til FA kan være styret af erhvervelsen af flere FA billeder med lidt forskellige dybder (55-60 D) i hver eksperimentel session. Dette kan også bidrage til at kompensere for anatomiske forskelle på grund af alder, elev dilatation og patologi (optisk disk udgravning). Da billedopløsning og celle detalje afhænger den optimale specifikation af mætningsniveauer hele fundus, og omhyggelig justering af øjet i forhold til kameraet 49, billedsekvenser erhvervet over tid for det samme øje skal vise fundus IR-billeder med consistent og sammenlignelige fokus, belysning, opløsning og retinal felt span. Manuelle tællinger af de samlede GFP + celletal i billeder erhvervet i en enkelt session (1,5-1,7 mm 2 af nethinden, n = 13 nethinder, i alderen 3-5 måneder) bekræftede konsekvent og reproducerbar kvantificering af cellularitet (3-4% variation; data ikke vist). Dette er nødvendigt for billeder til at være modtagelig for GFP + celle segmentering via tærsklen analyse baseret på et lignende intensitet interval, og sammenligning af ændringer over tid.
Threshold og morfometrisk analyser af retinal mikroglia i levende cSLO billeder
Først for nylig har in vivo visualisering af hjernens mikroglia med høj cellulær opløsning af to-foton konfokal mikroskopi aktiveret kvantitativ analyse af mikrogliaceller Soma og procesparametre, og diskrimination af morfologisk aktiveret mikroglia 9,50. Som det fremgår af disse forfattere, somal størrelse er den mest iøjnefaldende morfologiskeparameter påviselig over tid i levende to-foton-konfokal billeddannelse af hjernen mikroglia, under anvendelse af iterativ intensitet-baserede tærskelværdier for at reducere signal-til-støj variationer 9. Endvidere ændringer somal størrelse korrelerer med opregulering af Iba1 ekspression i aktiverede celler 9. Her, bruger vi cSLO live billeder og anvende sammenlignelige sekventiel segmentering af mikrogliaceller og somata efterfulgt af morfometrisk analyse for at kvantificere antal af total og aktiveret CX3CR1-GFP + -celler lokaliseret til nethinden.
Vi bruger specialiseret konfokal rendering software (FluoRender) til segmentet GFP + celler i den centrale nethinden. Disse billeder, er yderligere tærsklingsbehandlet bruger en kommercielt tilgængelig konfokal billedanalyse pakke, til i sidste ende gøre det muligt for automatiske segmentering og tærskel-baserede kvantificering af somal område. Vores levende billede analyser bekræftede brugen af soma størrelse som en morfologisk metrisk af mikroglial aktivering i live-billedanalyse 9. Somaltærskel-baserede tæller tillod karakterisering af mønstre og stigninger i retinal mikrogliose, som tidligere demonstreret ved ex vivo billedanalyse 50. Vi finder, at cSLO detekterer GFP + microglia med bedste opløsning og detaljer i musen centrale nethinden (<2 mm 2), hvor celler kan afbildes på samme konfokal plan. Mod nethinden periferien, fluorescens-signalet viser variabilitet og fordrejninger, der forhindrer identiske imaging behandling og tærskel analyse som for GFP + celler detekteret i fladere centrale nethinden. Endelig vores protokol viser, at cSLO in vivo billedanalyse af retinal mikroglia tilbyder et relativt højt gennemløb. Antallet af parenkymal mikroglial der kunne være visuelt isoleret og kvantificeret i den centrale retina varierede mellem ~ 200-300 totale celler, og ~ 10-180 aktiverede celler. Således musen retinal mikroglia tilbyder en optimal befolkning til at studere in vivo deres transformation og roller dnder patogenesen af neurodegeneration.
Anvendelse på andre CNS kroniske sygdomme
De in vivo billede analysemetoder er beskrevet her bør gælde for at vurdere akutte eller kroniske mikrogliaceller ændringer i andre mus retinale sygdomme og skade modeller. Endvidere kan denne protokol tjene til at vurdere retinal mikroglia / perifer monocyt ændringer som følge af kroniske CNS-patologier, såsom Alzheimers, Parkinsons og multipel sklerose, eftersom nethinden og synsnerven er målrettet til neurodegeneration i disse sygdomme 51-56. I tråd med dette, brug af levende påvisning af nethinden og ONH patologi for tidlig Alzheimers ledelse sygdom er under intens undersøgelse 54,57,58.
Afslutningsvis vores resultater tyder på, at levende, langsgående sporing og kvantificering af ændringer i retinale mikroglia tal og morfologiske aktivering, kan tjene som pålidelig neuroimaging biomarkører til at opdage sygdomsdebut og tidlig progression. Disse in vivo-billeddannelse og analyse metode gælder for aldersrelateret glaukom, og potentielt til andre neurodegenerative sygdomme, der påvirker nethinden og synsnerven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 and 00582 | Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift. |
| 30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe | BD, East Rutherford, NJ | 305106 and 309659 | |
| 2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 and P4417 | Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week. |
| Heat therapy T/Pump | Gaymar Industries, Orchard Park, NY | TP-650 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 23-400-100 | |
| Tropicamide 1% | Bausch & Lomb, Rochester, NY | NDC 24208-585-64 | |
| PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center | Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK | G003709 | Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes. |
| HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software | Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA | Version 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Redmond, WA | Version 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, San Jose, CA | Version CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah | Version 2.13 | Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Melville, NY | Version 4.30.01 |
References
- Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A.
- Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763 (2012).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
- Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
- Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
- Jacobs, A. H., Tavitian, B.
- Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
- Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
- Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A.
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
- Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910 (2011).
- Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
- Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
- Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
- Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
- Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
- Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
- Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
- Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
- Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
- Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
- Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
- Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
- Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
- Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
- Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
- Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
- Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
- Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
- Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
- Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
- Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
- Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
- Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
- Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
- Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
- Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
- Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).
