Hele Glasslegemet Dissection for Vitreodynamic Analysis

Introduction

Målet med denne fremgangsmåte er å detalj en teknikk for å isolere en hel, inntakt glasslegeme, med det glassaktige kjerne og cortex intakt, fra et kadaver øye, for det formål å vitreodynamic analyse. Som innen glasslegemet fysiologi har vokst, tverrfaglig forskere, for eksempel væskemekanikk forskere, undersøker de fysiske og biomekaniske egenskapene til glasslegemet ^1. For å oppnå dette, er det viktig å detalj en teknikk for å isolere hele, intakte glasslegeme for å hjelpe til tverrfaglig forskere.

Sebag et al. ² og andre ^tre utført elegante hele glass disseksjoner på menneskelige kadaver øynene og viste illustrasjoner av resultatene. Men den teknikk som benyttes, er ikke beskrevet i detalj og ikke-eksperter ville ikke være i stand til å replikere uavhengig av fremgangsmåten. Andre studier har høstet glasslegemet fra kadaver øyne benytter enklere metoder som aspirasjon eller delvis disseksjon,som begge ikke fører til en hel, inntakt glasslegeme. Gisladottis et al. ⁴ og Xu et al. ⁵ undersøke permeabilitet i glasslegemet høstet fra kadaver øyne. Men siden ingen metode for glasslegemet ekstraksjon ble beskrevet, ble det antatt at de suges inn i glasslegemet med en sprøyte. Watts et al. ⁶ gikk ett skritt videre ved å beskrive en fremgangsmåte for å isolere kanin glasslegemet med en kirurgisk teknikk. Men denne metoden resulterer i en isolering av bare glasskjernen og ikke glasslegemet cortex. Skeie et al. ⁷ senere organisert glasslegemet i fire unike områder og elegant beskrevet en metode for å dissekere ut hver del for analyse. Denne teknikken er imidlertid ikke resultere i en intakt glasslegemet som helhet.

Den nåværende Teknikken ble utviklet for å forenkle biofysiske eksperimenter som i dag kun utføres i kadaver øyne. Tidligere fremgangsmåter, som beskrevet enBove, er begrenset fordi 1) Ingen fullstendig isolere hele glasslegeme, 2) høstet glasslegemet kjerne og cortex homogeniseres, 3) glasslegemet anatomisk struktur ikke blir opprettholdt, eller 4) disseksjon teknikker ikke er tilstrekkelig detaljert til replikasjon av forskere i andre felt . I tillegg, på grunn av tettheten av sclera og årehinnen, visualisering av glasslegemet er begrenset i det intakte øyeeplet. Dette begrenser presisjonen og gjennomførbarheten av målinger som kan foretas innenfor hele øyet. I tillegg kan de anatomiske strukturer som omgir glasslegemet forvirrer studiet av biokjemiske og fysiske egenskaper for glasslegemet.

I de senere år, har hoveddelen av glasslegemet vitenskap vokst enormt, og det er grunn til å tro at hele glasslegemet har andre egenskaper enn de enkelte delene. Det er økende interesse for å undersøke de fysiske, biomekaniske og kjemiske egenskapene til glasslegemet for vitreodynamics research, som har programmer i klinisk medisin som levering av legemidler, intravitreal oksygene ⁸ og vitrektomi. Farmakologiske vitreodynamics, som bruker farmakologiske midler for å manipulere glasslegemet, kan brukes til å forbedre resultatene ⁹ vitrektomi. Biomekaniske egenskaper blir brukt til å modellere fluidstrømning i glasslegemet, som kan brukes til å forbedre intravitreal medikamentleveringsteknologier ^10-12. Fysiske egenskapene til ulike segmenter av glasslegemet er avgjørende for å forstå vitreoretinopati retinal oksygentransport ^13. Den foreslåtte glasslegemet disseksjon teknikken kan brukes til å studere forskjellige egenskaper til det intakte glasslegemet. Det gjør at benk-top eksperimenter som skal gjøres på hele, intakte glass kropper med bedre visualisering.

Oppsummert dagens metoder for studiet av glasslegemet enten ikke er tilstrekkelig beskrevet, eller føre til en ufullstendig isolert glasskjerne og cortex. Derfor er det et behov for å utføre experiments i en gjennomsiktig øye modell og samtidig beholde anatomi av glasslegemet som eksisterer i kadaver øyet.

Protocol

Alle erte utskrapte øyne var hentet fra et slakteri, og alle forsøk ble utført i henhold til institusjonelle biosikkerhet lover.

1. Sikre enucleated øye ned på en overflate. Gjør dette ved å plassere vev pins gjennom overflødig vev rundt øyet og feste det ned i en Styrofoam styret.
2. Dissekere og løsne perilimbal konjunktiva fra øyet.
   1. Bruk fine tang (0,3 tang) og microscissors (Westcott saks) til innsnittet conjunctiva ved limbus og uten omsvøp dissekere den av sclera. Skjær conjunctiva langs limbus som stump disseksjon fortsetter å tillate ytterligere disseksjon.
   2. Fjern conjunctiva hele veien rundt øyet (360 grader) for å eksponere så mye senehinnen som mulig.
      MERK: Det er nyttig å legge igjen en liten mengde konjunktiva å lette feste øyet med kirurgiske pinner eller en pinsett under resten av prosedyren.
3. Lag en full tykkelse scleral klaff langs enside av øyet (skalpellblad 69).
   1. Lag en ~ 5 mm scleral innsnitt parallelt for limbus og 3 mm posteriort for limbus ved forsiktig å kutte i sclera med en skalpell (skalpell blad 11) til mørkt pigmentert koroidea er synlig. Vær forsiktig så du ikke innsnittet årehinnen selv.
   2. Nøye dissekere langs planet mellom sklera og choroid, enten med saks (ved hjelp av stump disseksjon) eller med skalpell, inntil det er mulig å forstørre den potensielle rommet mellom disse vev ved å skyve choroid forsiktig innover.
   3. Lag en annen skleralt snitt vinkelrett på den første scleral snittet med skarpe microscissors, skaper en T-formet snitt.
   4. Deretter fortsetter å rett ut dissekere i en omkrets måte å fjerne scleral vev fra den underliggende årehinnen og skyv årehinnen bort fra sclera som nevnt ovenfor.
   5. Forstørre skleralt klaff etter behov.
      1. Forsiktig sløv dissekere årehinnen bort fra scleraunder hele prosessen.
      2. Forstørre klaffen inntil innsnitt gjort vinkelrett på limbus når den optiske nerven og innsnitt gjort parallelt limbus er minst en tredjedel av øyet omkrets (45 °).
      3. Bruk skleral klaff som en kilde av leverage for manipulering av øyet under sløv disseksjon. Kontra trekkraft på klaffen gjør det lettere for stump disseksjon.
   6. Gjenta forrige trinn på den andre scleral klaff.
4. Skjær bort scleral flaps for å avsløre et stort område av årehinnen.
5. Fortsett innsnitt gjort i trinn 3 rundt øyet omkrets (360 grader).
6. Fjern det gjenværende choroid-retina vev.
   1. Innenfor eksponert område, bruk en bomulls-tip å forsiktig børste av årehinnen-hinnen vev som gjenstår. Alternativt, forsiktig ta tak i vev med pinsett og skrelle den av den underliggende glasslegeme.
   2. Om nødvendig gjør et snitt i årehinnen starting fra synsnerven. Så skrelle bort årehinnen forsiktig å avsløre netthinnen og glass cortex.
7. Fortsett sløv dissekere årehinnen bort fra sclera og deretter skrelle bort årehinnen å få hele, intakte glasslegemet.
8. Bruk skleral felgen festet til hornhinnen for å posisjonere hele glasslegemet på ønsket sted. På dette punktet, blir glasslegemet festet til fremre sclera og linsen.
9. Blunt dissekere glasslegemet fra innsiden av senehinnen, rundt linsen, fjerner all sclera.
10. Bruk en butt verktøy til å skyfle linsen bort fra glasslegemet ved behov. Bruk prøven for ulike vitreodynamic eksperimenter.
    1. Plasser prøven i et glassbeger med kjent overflateareal eksponert for luft. Plasser oksygenfølsomme sonde på kanten av prøven. Bruk en mikromanipulator for å bevege sonden til en kjent avstand (r) inn i prøven.
    2. Bruk Fick lover diffusjon å få den teoretiske diffusjon ligningen. Med daTA samlet i trinn 10.1, få den eksperimentelle diffusjonskoeffisient / reaksjon sikt etc.

Representative Results

Følge protokollen vil føre til en vellykket glasslegemet disseksjon med kjernen og cortex (figur 3) intakt. Dette fremgår av de gjenværende deler av retina festet til glasslegemet cortex. Intakt hele glasslegemet kan benyttes på flere måter for bestemte vitreodynamic eksperimenter. I vårt tilfelle diffusjonshastigheten av oksygen i intakte glasslegemet, og det er tilsvarende tidskonstant er undersøkt (figur 2). Glasslegemet som ble dissekert (kjerne og cortex) ved bruk av vår metode ble plassert i et glassbeger med en kjent eksponerte overflaten. Dette ble sammenlignet med glasslegemet som ble høstet ved bruk av en tidligere publisert metode som bare isolerer glassaktig kjerne ^6. Alle andre faktorer ble holdt konsekvent på tvers av de eksperimentelle og kontrollgrupper. Den glassaktige overflate ble utsatt for luft, som har en kjent oksygentensjon (~ 160 mmHg). Oksygenet spenningen i glasslegemet var lav (<10 mm Hg). Basert på forekomsten av vitreous oksygenforbruk bestemt av ¹⁴ Shui et al. for glasslegemet i gelen staten, kan vi bruke ligningen for en dimensjonal oksygen transport (i jevn eller ustø statlige skjemaer). Ved måling av oksygenspenningen en kjent avstand i glasslegemet overflaten, kan vi eksperimentelt bekrefte diffusjonskoeffisienten. Oksygen spenning ble registrert med en oksygen sonde som Oxford, og feilraten var ± 10%. En prøve ble oppsamlet hvert 30. sek. Tilstedeværelsen av glasslegemet cortex påvirker diffusjonshastigheten av oksygen i midten glasslegemet. I nærvær av glasslegemet cortex, skjer diffusjon av oksygen i løpet av et lengre tidsintervall.

De fysiske egenskapene til det glassaktige kjernen og cortex ha en innvirkning på helse og sykdom. For eksempel, lokalisert, supplerende intraokulært oksygene har vært foreslått som en behandling av retinal ischemi ^8. Forstå de ulike diffusjonskoeffisientene for oksygen gjennom glasslegemet cortexKjernen vil gjøre det mulig forskere å forutsi den faktiske frekvensen av oksygentilførsel til netthinnen.

Fig. 1: tverrsnitt av øyet vise relevante anatomiske strukturer (modifisert fra National Eye Institute, National Institutes of Health) Hornhinnen er gjennomsiktig vev som danner den fremre mest delen av øyet, og gir en betydelig del av øyets optiske makt. Limbus er krysset av hornhinnen, conjunctiva og sclera. Sklera strekker seg fra limbus til den bakre mest aspektet av øyet, hvor den møter den optiske nerven. Conjunctiva er en tynn epitel som linjer meget utsiden av øyet, og danner grensen mellom det ytre miljø og sclera. De interne komponentene i øyet består av fremre kammer, linse, iris, ciliarkropp, bakre kammer, posterior hulrom, netthinnen og årehinnen. Den vitreous kjernen omfatter det sentrale område av glasslegemet, i det bakre hulrom av øyet. Glass cortex ligger rundt glasslegemet og er festet til netthinnen på flere punkter, inkludert Pars plana, retinal fartøy, optisk plate og makula. Glass basen er en tredimensjonal sone som strekker seg fra ~ 2 mm anterior til ora serrata til 3 mm posteriort for ora serrata. Årehinnen er et vaskulært vev lag som ligger mellom sklera og netthinnen og gir blodtilførsel til den ytre retina. Netthinnen er nevro laget av øyet som subserves lys sending kapasiteten av øyet. Sklera er hvit, ugjennomsiktig lag som gir hoveddelen av den strukturelle støtte for øyet veggen.

Figur 2:. Plot av oksygen spenningen i glasslegemet mot tiden Plot av oksygen spenning i glasslegemet kjerne (grønn linje) sammenlignet med intakt hele vitreous (blå linje). En oksygenføler probe ble plassert i midten av prøven og prøven ble utsatt for luft, som har et oksygenspenning på 160 mmHg.

Figur 3: Eksempel på isolerte hele glasslegeme. Top bilde er et eksempel på den intakte hele glasslegemet fremdeles er festet til skleral felgen. Middle bilde er et eksempel på hele intakte glasslegeme uten sclera, men med noe gjenværende netthinnevev. Bunnen er et eksempel på en hel, inntakt glasslegeme.

Discussion

Det er to viktige trinn som må være nøye utført i løpet av glasslegemet disseksjon. Trinn 3, noe som skaper en full tykkelse skleral klaff, er avgjørende for hele disseksjon. Forsiktighet bør tas for å ikke skjære i årehinnen når du oppretter full tykkelse scleral klaff. Den andre kritiske trinnet er å dissekere bort sclera fra årehinnen. Dette trinnet må være nøye gjort for å hindre å opprette flere hull i årehinnen hvorfra glasslegemet kan renne ut. Det er en måte å modifisere den protokoll og fremdeles dissekere intakte hele glasslegemet. Trinn 6 kan utsettes til trinn 8. choroid kan fjernes ved enden etter at glasslegemet vev er posisjonert på det ønskede sted.

Begrensningen med denne prosedyren er at under disseksjon, er det bare visuelle signaler som tyder på suksess og nøyaktigheten av intakt glasslegemet disseksjon. Siden glasslegemet kjernen og cortex er både gjennomsiktig og undistinguishable for det blotte øye, dennekan være utfordrende. Ved å legge merke til adhesjonen av netthinnen på glasslegemet er det mulig å bestemme om det lykkes disseksjon av glass cortex har oppstått. Ellers, farmakologiske stoffer, slik som Kenalog, kan brukes til å forbedre visualisering ¹⁵ av glasslegemet, men kan ikke lett tillater en å skille mellom glasslegemet cortex og glasskjernen. En annen begrensning ved denne teknikken er at det er mest effektivt for disseksjon av gelen glasslegemet. Menneskelig glasslegemet gel er en ikke-regenerativ vev som gjennomgår kondense med alderen. Denne kondense hindrer oss fra helt dissekere hele, intakte glasslegemet i øyet. Dermed utvider vår teknikk bare glasslegemet av dyr, som kuer, griser og kaniner, eller øynene til unge mennesker som ikke har betydelige mengder av kondensering. Glasslegemet i disse dyrene har en tendens til å være helt i en geltilstand.

Men for øyeblikket er det ingen etablert metode, som har vært synkendeblandet polymerfiber i detalj, for dissekere hele intakt glasslegemet fra kadaver øyne. Foreløpig den eneste glass disseksjon teknikker som har blitt godt beskrevet involvere disseksjon av unike, men separate regioner av glasslegemet ⁷ eller disseksjon av bare glasskjerne ^6.

Anvendelser av dissekert intakt glasslegemet er under verdsatt og under-utnyttet. Kirurgisk erfaring med glasslegemet, så vel som klinisk, histopatologiske og biokjemiske studier antyder at de kjemiske og strukturelle egenskaper av glasslegemet kan variere betydelig ^16,17. Derfor er det nødvendig å bevare strukturen av hele glasslegeme for å studere funksjonen av glasslegemet i okulær fysiologi og anatomi. Intakt glasslegemet kan eksplantert til en transparent verden for bedre visualisering under forsøkene. De kan da brukes for en rekke mekaniske / kjemiske tester for å forbedre målinger av fysiske / biomekanisk propskapene til glasslegemet. For eksempel foreslår vi at den dissekerte hele intakte glasslegemet kan anvendes i stedet for saltløsning, viskøse erstatninger eller glasslegemet kjerne i de siterte reologi eksperimentene ^6,18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 forceps	Storz Opthalmics	E1793
Westcott Tenotomy Scissors Curved Right	Storz Opthalmics	E3320 R
Scalpel Handle No. 3	VWR	25607-947
Scalpel Blade, #11, for #3 Handle	VWR	470174-844