Introduction
El objetivo de este método es al detalle una técnica para aislar todo un cuerpo vítreo, intacta, con el núcleo vítreo y la corteza intacta, a partir de un ojo de cadáver, para los fines de análisis vitreodynamic. A medida que el campo de la fisiología del vítreo ha crecido, investigadores multidisciplinarios, como la mecánica de fluidos investigadores, están investigando las propiedades físicas y biomecánicas del vítreo 1. Para ello, es esencial al detalle una técnica para aislar todo el cuerpo vítreo intacta para ayudar a los investigadores multidisciplinarios.
Sebag et al. 2 y otros 3 elegantes realizaron disecciones vítreas enteros en los ojos de cadáveres humanos y mostraban ilustraciones de los resultados. Sin embargo, la técnica utilizada no se describió en detalle los no expertos y no sería capaz de replicarse independientemente del método. Otros estudios han cosechado vítreo de los ojos de cadáver utilizando métodos más simples como la aspiración o la disección parcial,ambos de los cuales no dan lugar a todo un cuerpo vítreo, intacto. Gisladottis et al. 4 y Xu et al. 5 investigar la permeabilidad en el humor vítreo cosechado de ojos de cadáver. Sin embargo, desde que se describe ningún método de extracción del vítreo, se asumió que aspiran el humor vítreo con una jeringa. Watts et al. 6 fue un paso más allá mediante la descripción de un método de aislamiento de conejo humor vítreo con una técnica quirúrgica. Sin embargo, este método da lugar a un aislamiento de sólo el núcleo vítreo y no la corteza vítreo. Skeie et al. 7 más tarde organizó el vítreo en 4 regiones únicas y elegantes describe un método para diseccionar cada parte para su análisis. Esta técnica sin embargo, no resulta en una vítreo intacta como un todo.
La técnica actual fue desarrollado para facilitar experimentos biofísicos que se realizan en la actualidad sólo a los ojos de cadáver. Los métodos anteriores, como se ha descrito unBove, están limitados porque 1) no aislar por completo a todo el cuerpo vítreo, núcleo vítreo 2) cosechada y la corteza se homogeneizan, 3) estructura anatómica vítreo no se mantiene, o 4) técnicas de disección no se detallan de manera adecuada para la replicación por investigadores de otros campos . Además, debido a la opacidad de la esclerótica y la coroides, la visualización del cuerpo vítreo está limitado en el globo ocular intacta. Esto limita la precisión y la viabilidad de las mediciones que se pueden hacer dentro de todo el ojo. Adicionalmente, los estructuras anatómicas que rodean a la del vítreo puede confundir del estudio de propiedades bioquímicas y físicas del humor vítreo.
En los últimos años, el cuerpo de la ciencia vítreo ha crecido enormemente y no hay razón para creer que todo el cuerpo vítreo tiene diferentes propiedades que sus partes individuales. Existe un creciente interés en la investigación de las propiedades físicas, biomecánicos, y químicas del vítreo para vitreodynamics research, que tiene aplicaciones en la medicina clínica, tales como la administración de fármacos, la oxigenación intravítrea 8 y vitrectomía. Vitreodynamics farmacológicos, que utiliza agentes farmacológicos para manipular el vítreo, se pueden utilizar para mejorar los resultados de vitrectomía 9. Propiedades biomecánicas se utilizan para modelar el flujo de fluido vítreo, que se puede utilizar para mejorar las tecnologías de administración de fármacos intravítrea 10-12. Propiedades físicas de los diversos segmentos del vítreo son cruciales para entender el transporte de oxígeno vítreo-retiniana 13. La técnica de disección vítreo propuesto puede ser utilizado para estudiar diversas propiedades del humor vítreo intacto. Permite sobremesa experimentos por hacer en los cuerpos vítreos enteros, intactos, con mejor visualización.
En resumen, los métodos actuales para el estudio del vítreo o bien no describen adecuadamente, o dan lugar a un aislamiento incompleta el núcleo vítreo y la corteza. Por lo tanto, hay una necesidad de realizar experimentos en un modelo de ojo transparente al tiempo que conserva la anatomía del vítreo que existe en el ojo de cadáver.
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Protocol
Todos los ojos enucleados se obtuvieron de un matadero y todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las leyes de bioseguridad institucionales.
- Asegure ojo enucleado abajo sobre una superficie. Para ello, la colocación de pasadores de tejido a través del exceso de tejido alrededor de los ojos y la obtención abajo en un tablero de espuma de poliestireno.
- Diseccionar y separar la conjuntiva del ojo perilimbal.
- Utilice unas pinzas finas (0,3 fórceps) y micro tijeras (tijeras Westcott) para incidir la conjuntiva en el limbo y sin rodeos diseccionarlo de la esclerótica. Cortar la conjuntiva a lo largo del limbo como la disección roma procede a permitir una mayor disección.
- Retire conjuntiva todo el camino alrededor del ojo (360 grados) para exponer tanto esclerótica posible.
NOTA: Es conveniente dejar una pequeña cantidad de la conjuntiva para facilitar fijando el ojo con los pasadores quirúrgicos o un fórceps durante el resto del procedimiento.
- Crear un colgajo escleral de espesor total a lo largo de unolado del ojo (hoja de bisturí 69).
- Hacer un ~ 5 mm incisión escleral paralela al limbo y 3 mm posterior al limbo cortando suavemente en la esclerótica con un bisturí (hoja de bisturí 11) hasta que coroides pigmentación oscura es visible. Tenga cuidado de no incidir la propia coroides.
- Diseccionar cuidadosamente a lo largo del plano entre la esclerótica y la coroides, ya sea con tijeras (utilizando disección roma) o con el bisturí, hasta que sea posible para agrandar el espacio potencial entre estos tejidos empujando la coroides suavemente hacia adentro.
- Hacer otra incisión escleral perpendicular a la primera incisión escleral con micro tijeras afiladas, la creación de una incisión en forma de T.
- Luego continuar para diseccionar sin rodeos de una manera circunferencial para eliminar el tejido de la esclerótica de la coroides subyacente y empuje suavemente la coroides lejos de la esclerótica como se mencionó anteriormente.
- Agrandar el colgajo escleral según sea necesario.
- Suavemente blunt diseccionar la coroides lejos de la escleróticadurante todo el proceso.
- Ampliar la solapa hasta que la incisión hecha perpendicular al limbo alcanza el nervio óptico y la incisión hecha paralela al limbo es de al menos un tercio de la circunferencia del ojo (45º).
- Utilice el colgajo escleral como una fuente de apalancamiento para manipular el ojo durante la disección roma. El contra-tracción en la solapa hace que sea más fácil para la disección roma.
- Repita el paso anterior en el otro colgajo escleral.
- Cortar las aletas esclerales para exponer una gran área de coroides.
- Continuar la incisión hecha en el paso 3 alrededor de la circunferencia del ojo (360 grados).
- Retire el tejido coroides-retina restante.
- Dentro de la región expuesta, utilice una punta de algodón para cepillar suavemente el tejido coroides retina restante. Alternativamente, agarra suavemente el tejido con pinzas y despegarlo el cuerpo vítreo subyacente.
- Si es necesario hacer una incisión en la coroides starting desde el nervio óptico. Luego retire la coroides suavemente para exponer la retina y la corteza vítrea.
- Continuar contundente disección de la coroides lejos de la esclerótica y luego retire la coroides para obtener todo el vítreo, intacto.
- Utilice el borde escleral unido a la córnea para colocar todo el vítreo en el lugar deseado. En este punto, el vítreo se adjunta a la esclerótica anterior y la lente.
- Blunt diseccionar el vítreo desde el interior de la esclerótica, alrededor de la lente, la eliminación de todos esclerótica.
- Utilice una herramienta contundente para sacar la lente de distancia del vítreo si es necesario. Usa el ejemplo de varios experimentos vitreodynamic.
- Coloque la muestra en un vaso de precipitados de vidrio con superficie conocida se expone al aire. Coloque oxígeno sonda sensible en el borde de la muestra. Use un micro-manipulador para mover la sonda a una distancia conocida (r) en la muestra.
- Utilice Ley de Fick para obtener la ecuación de difusión teórica. Con la data recogido en el paso 10.1, obtenga el término coeficiente de difusión experimental / reacción, etc.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo dará lugar a una disección vítreo éxito con el núcleo y la corteza (Figura 3) intacta. Esto es evidente a partir de las piezas residuales de retina adheridas a la corteza vítreo. Intacto humor vítreo conjunto se puede utilizar de varias maneras para experimentos vitreodynamic específicos. En nuestro caso, el índice de difusión del oxígeno en humor vítreo intacto y TI de constante de tiempo correspondiente se estudió (Figura 2). Vítreo que se disecó (núcleo y la corteza) usando nuestro método se colocó en un matraz de vidrio con un área de superficie expuesta conocido. Esto se comparó con vítreo que se cosechó utilizando un método publicado previamente que sólo aísla núcleo vítreo 6. Todos los demás factores se mantienen consistentes entre los grupos experimentales y de control. La superficie vítrea se expuso al aire, que tiene una tensión de oxígeno conocido (~ 160 mmHg). La tensión de oxígeno dentro del vítreo fue baja (<10 mmHg). Basado en la tasa de vitrconsumo de oxígeno eous determine Shui et al. 14 de vítreo en el estado de gel, podemos usar la ecuación para el transporte de oxígeno 1 dimensiones (en formas de estado estable o inestable). Mediante la medición de la tensión de oxígeno una distancia conocida dentro de la superficie vítrea, podemos validar experimentalmente el coeficiente de difusión. La tensión de oxígeno se registró con una sonda de oxígeno, tal como Oxford, y la tasa de error fue de ± 10%. Una muestra se recogió cada 30 seg. La presencia de corteza vítreo afecta a la tasa de difusión de oxígeno en el vítreo media. En presencia de corteza vítreo, la difusión del oxígeno se produce durante un intervalo de tiempo más largo.
Las propiedades físicas de la base del vítreo y la corteza tienen un impacto en la salud y enfermedad. Por ejemplo, localizada, la oxigenación intraocular complementaria ha sido propuesto como un tratamiento para la isquemia retiniana 8. La comprensión de los diferentes coeficientes de difusión de oxígeno a través de la corteza vítreanúcleo permitirá a los investigadores predecir la tasa real de la entrega de oxígeno a la retina.
Figura 1:. Vista en sección transversal del ojo se presentan las estructuras anatómicas relevantes (modificado de Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud) La córnea es el tejido transparente que forma la anterior más la sección del ojo y proporciona una parte significativa de la de óptica ojo poder. El limbo es la unión de la córnea, conjuntiva y la esclerótica. La esclerótica se extiende desde la limbo a la posterior más aspectos de ojo donde se une con el nervio óptico. La conjuntiva es un epitelio delgada que recubre el exterior del ojo y forma el límite entre el ambiente externo y la esclerótica. Los componentes internos del ojo consisten en la cámara anterior, cristalino, iris, cuerpo ciliar, la cámara posterior, la cavidad posterior, la retina y la coroides. El vitreous núcleo comprende la región central del cuerpo vítreo, dentro de la cavidad posterior del ojo. La corteza del vítreo se encuentra alrededor del cuerpo vítreo y se une a la retina en varios puntos, incluyendo la pars plana, vasos retinianos, disco óptico y la mácula. La base del vítreo es una zona tridimensional que se extiende desde ~ 2 mm anterior a la ora serrata a 3 mm posterior a la ora serrata. La coroides es una capa de tejido vascular que se encuentra entre la esclerótica y la retina y proporciona suministro de sangre a la retina externa. La retina es la capa neurosensorial del ojo que subordina la capacidad de enviar la luz del ojo. La esclerótica es la capa opaca blanca que ofrece mayor del soporte estructural a la pared del ojo.
Figura 2:. Parcela de tensión de oxígeno del humor vítreo contra el tiempo Parcela de la tensión de oxígeno en el núcleo vítreo (línea verde) en comparación con todo intacto vitreous (línea azul). Una sonda de detección de oxígeno se coloca en el centro de la muestra y la muestra se expone al aire que tiene una tensión de oxígeno del 160 mmHg.
Figura 3: Ejemplos de aislado cuerpo vítreo conjunto. Foto superior es un ejemplo de todo el cuerpo vítreo intacta todavía unido a la llanta escleral. Foto Medio es un ejemplo de todo el cuerpo vítreo intacta sin esclerótica pero con algo de tejido de la retina restante. El fondo es un ejemplo de todo el cuerpo vítreo, intacto.
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Discussion
Existen dos pasos críticos que se deben realizar con cuidado durante la disección vítreo. Paso 3, la creación de un colgajo escleral de grosor completo, es crucial para toda la disección. Se debe tener cuidado para no cortar en la coroides cuando se crea el colgajo escleral de grosor completo. El otro paso fundamental está diseccionando de distancia de la esclerótica de la coroides. Este paso debe hacerse con cuidado para evitar la creación de múltiples orificios de la coroides de la que el humor vítreo puede derramarse. Hay una manera de modificar el protocolo y todavía diseccionar intacta humor vítreo conjunto. Paso 6 se puede retrasar hasta el paso 8. La coroides puede ser eliminado al final después de que el tejido vítreo se coloca en la ubicación deseada.
La limitación de este procedimiento es que durante la disección, sólo hay señales visuales para sugerir el éxito y la precisión de la disección vítreo intacto. Desde el núcleo vítreo y la corteza son ambos transparente y indistinguibles a simple vista, estepuede ser un reto. Por darse cuenta de la adhesión de la retina en el vítreo es posible determinar si se ha producido una disección éxito de la corteza vítreo. De lo contrario, las sustancias farmacológicas, tales como Kenalog, se pueden utilizar para mejorar la visualización 15 del vítreo pero no pueden permitir fácilmente a uno distinguir entre la corteza y el núcleo vítreo vítreo. Otra limitación de esta técnica es que es más eficaz para la disección de vítreo gel. Gel vítreo humano es un tejido no regenerativa que se somete a la licuefacción con la edad. Esta licuefacción nos impide disección completamente todo el vítreo, intacta desde el ojo. Por lo tanto, nuestra técnica se extiende sólo al vítreo de los animales, como vacas, cerdos o conejos o los ojos de los seres humanos jóvenes que no tienen cantidades significativas de licuefacción. El humor vítreo en estos animales tiende a estar completamente en estado de gel.
Sin embargo, en la actualidad, no existe un método establecido, que ha sido descRibed en detalle, para la disección de toda vítreo intacto de ojos de cadáver. En la actualidad, las únicas técnicas de disección vítreas que han sido bien detallados implican la disección de regiones únicas pero separadas del vítreo 7 o la disección de sólo el núcleo vítreo 6.
Las aplicaciones de diseccionado humor vítreo intacta están bajo apreciadas y subutilizadas. Experiencia quirúrgica con el vítreo, así como los estudios clínicos, histopatológicos y bioquímicos sugieren que las propiedades químicas y estructurales del vítreo pueden variar significativamente 16,17. Por lo tanto, es necesario para preservar la estructura de todo el cuerpo vítreo para estudiar la función del vítreo en la fisiología ocular y la anatomía. Vítreo intacto puede explantó a un globo transparente para una mejor visualización durante los experimentos. Ellos pueden entonces ser utilizados para una variedad de pruebas / químicas mecánicos para mejorar las mediciones de prop física / biomecánicopropie- del humor vítreo. Por ejemplo, se sugiere que el vítreo intacta toda diseccionado se puede utilizar en lugar de la solución salina, sustitutos viscosos, o núcleo vítreo en los experimentos de reología citados 6,18.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 forceps | Storz Opthalmics | E1793 | |
| Westcott Tenotomy Scissors Curved Right | Storz Opthalmics | E3320 R | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | 25607-947 | |
| Scalpel Blade, #11, for #3 Handle | VWR | 470174-844 |
References
- Siggers, J. H., Ethier, C. R.
- Sebag, J. Age-related changes in human vitreous structure. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 225 (2), 89-93 (1987).
- Grignolo, A.
- Gisladottir, S., Loftsson, T., Stefansson, E. Diffusion characteristics of vitreous humour and saline solution follow the Stokes Einstein equation. G Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247 (12), 1677-1684 (2009).
- Xu, J., Heys, J. J., Barocas, V. H., Randolph, T. W. Permeability and diffusion in vitreous humor: implications for drug delivery. Pharm Res. 17 (6), 664-669 (2000).
- Watts, F., Tan, L. E., Wilson, C. G., Girkin, J. M., Tassieri, M., Wright, A. J. Investigating the micro-rheology of the vitreous humor using an optically trapped local probe. Journal of Optics. 16 (1), 015301 (2014).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), e2455 (2011).
- Abdallah, W., Ameri, H., et al. Vitreal oxygenation in retinal ischemia reperfusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 1035-1042 (2011).
- Goldenberg, D., Trese, M. Pharmacologic vitreodynamics: what is it? Why is it important. Expert Review of Ophthalmology. 3 (3), 273-277 (2008).
- Choonara, Y. E., Pillay, V., Danckwerts, M. P., Carmichael, T. R., du Toit, L. C. A review of implantable intravitreal drug delivery technologies for the treatment of posterior segment eye diseases. J Pharm Sci. 99 (5), 2219-2239 (2010).
- Balachandran, R. K., Barocas, V. H. Computer modeling of drug delivery to the posterior eye: effect of active transport and loss to choroidal blood flow. Pharm Res. 25 (11), 2685-2696 (2008).
- Smith, C. a, Newson, T. a, et al. A framework for modeling ocular drug transport and flow through the eye using micro-CT. Phys Med Biol. 57 (19), 6295-6307 (2012).
- Quiram, P. A., Leverenz, V. R., Baker, R. M., Dang, L., Giblin, F. J., Trese, M. T. Microplasmin-induced posterior vitreous detachment affects vitreous oxygen levels. Retina. 27 (8), 1090-1096 (2007).
- Shui, Y., Holekamp, N. The gel state of the vitreous and ascorbate-dependent oxygen consumption: relationship to the etiology of nuclear cataracts. Arch Ophthalmol. 127 (4), 475-482 (2009).
- Burk, S. E., Da Mata, A. P., Snyder, M. E., Schneider, S., Osher, R. H., Cionni, R. J. Visualizing vitreous using kenalog suspension. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 645-651 (2003).
- Spaide, R. Visualization of the Posterior Vitreous with Dynamic Focusing and Windowed Averaging Swept Source Optical Coherence Tomography. Am J Ophthalmol. S0002-9394 (14), 00537-00536 (2014).
- Domalpally, A., Gangaputra, S., Danis, R. P. Diseases of the Vitreo-Macular Interface. 21, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. 21-27 (2014).
- Stocchino, R., Repetto, A., Cafferata, C. Experimental investigation of vitreous humour motion within a human eye model. Phys Med Biol. 50 (19), 4729-4743 (2005).
