Sammanlagt Glaskroppen Dissektion för Vitreodynamic Analys

Introduction

Målet med denna metod är att specificera en teknik för att isolera en hel, intakt glaskroppen, med den glasartade kärnan och cortex intakt, från ett lik öga, i syfte att vitreodynamic analys. Eftersom området glasaktigt fysiologi har ökat, tvärvetenskapliga forskare, såsom strömningsmekanik forskare undersöker de fysiska och biomekaniska egenskaperna hos glaskroppen ^1. För detta ändamål är det nödvändigt att specificera en teknik för att isolera det hela, intakta glaskroppen för att underlätta tvärvetenskapliga forskare.

Et al. Sebag ² och andra ³ utförs eleganta hela glas dissektioner på människolik ögon och visade illustrationer av resultaten. Emellertid var den teknik som användes beskrivs inte i detalj och icke-experter skulle inte kunna replikera metoden självständigt. Andra studier har skördat glaskroppen från kadaver ögonen med enklare metoder såsom aspiration eller delvis dissekering,vilka båda resulterar inte i en hel, intakt glaskropp. Gisladottis et al. ⁴ och Xu et al. ⁵ undersöka permeabilitet i glaskroppen skördas från kadaver ögon. Men eftersom ingen metod för vitros extraktion beskrevs, antog man att de aspireglaskroppen med en spruta. Et al. Watt ⁶ gick ett steg längre genom att beskriva en metod för att isolera kaninglaskroppen med en kirurgisk teknik. Detta resulterar emellertid metoden i en isolering av bara den glasartade kärnan och inte den glasartade cortex. Skeie et al. ⁷ senare organiserade glaskroppen i 4 unika regioner och elegant beskrivit en metod för att dissekera ut varje del för analys. Denna teknik dock inte resulterar i en intakt glaskroppen som helhet.

Den nuvarande tekniken har utvecklats för att underlätta biofysiska experiment som för närvarande endast utförs i kadaver ögon. Tidigare förfaranden, såsom beskrivs enBove, är begränsad eftersom 1) ingen helt isolera hela glaskroppen, 2) skördas glaskroppen kärnan och cortex homogeniseras, 3) glaskroppen anatomisk struktur inte upprätthålls, eller 4) dissekering tekniker inte är tillräckligt detaljerad för replikering av forskare inom andra områden . Dessutom, på grund av opaciteten hos senhinnan och åderhinnan, visualisering av den vitrösa kroppen är begränsad i den intakta ögongloben. Detta begränsar den precision och genomförbarheten av mätningar som kan göras på insidan av hela ögat. Dessutom kan de anatomiska strukturer som omger glaskroppen förväxla studien av biokemiska och fysikaliska egenskaper hos glaskroppen.

Under de senaste åren, har kroppen glasaktigt vetenskap växt enormt och det finns anledning att tro att hela glaskroppen har olika egenskaper än de enskilda delarna. Det finns ett växande intresse för att undersöka de fysiska, biomekaniska och kemiska egenskaper hos glaskroppen för vitreodynamics research, vilket har tillämpningar inom klinisk medicin, såsom läkemedelstillförsel, intravitreal syresättning ⁸ och vitrektomi. Farmakologiska vitreodynamics, som använder farmakologiska medel för att manipulera i glaskroppen, kan användas för att förbättra vitrektomi utfall ^9. Biomekaniska egenskaper används för att modellera glaskroppen vätskeflöde, som kan användas för att förbättra intravitreal drug delivery-teknologier ^10-12. De fysikaliska egenskaperna hos olika delar av glaskroppen är avgörande för att förstå vitreo-retinal syretransport ^13. Den föreslagna vitröst dissektion teknik kan användas för att studera olika egenskaper hos den intakta glaskroppen. Det gör att bänkbaserade experiment göras på hela, intakta glas organ med bättre visualisering.

Sammanfattningsvis nuvarande metoder för undersökning av glaskroppen är antingen inte tillräckligt beskriven, eller resultera i en ofullständig isolering glaskroppen kärnan och cortex. Därför finns det ett behov att utföra experiments på ett öppet öga modell med bibehållen anatomi av glaskroppen som finns i kadavret ögat.

Protocol

Alla enukleerade ögon erhölls från ett slakteri och alla experiment har utförts i enlighet med institutionella biosäkerhet lagar.

1. Säkra enukleerat öga ned på en yta. Gör detta genom att placera vävnads stift genom överskottet vävnad runt ögat och säkra den ner i en frigolit ombord.
2. Dissekera och lossa perilimbal bind från ögat.
   1. Använd fin pincett (0,3 tång) och microscissors (Westcott sax) att incisionsfilm bindhinnan vid limbus och rakt på sak dissekera bort sklera. Skär hinnan längs limbus som dissektion fortsätter att tillåta ytterligare dissektion.
   2. Avlägsna konjunktiva hela vägen runt ögat (360 grader) för att exponera så mycket sklera som möjligt.
      OBS: Det är bra att lämna en liten mängd bindhinnan för att underlätta fixering ögat med kirurgiska stift eller en pincett under resten av förfarandet.
3. Skapa en full tjocklek skleral flik längs ensida av ögat (skalpell blad 69).
   1. Gör en ~ 5 mm skleral snitt parallellt med limbus och 3 mm posteriort om limbus genom att försiktigt skära i sklera med en skalpell (skalpellblad 11) tills mörkt pigmenterad choroid är synlig. Var noga med att inte incisionsfilm åderhinnan själv.
   2. Försiktigt dissekera längs planet mellan senhinnan och åderhinnan, antingen med en sax (med hjälp av trubbig dissektion) eller med skalpell, tills det är möjligt att förstora det potentiella utrymmet mellan dessa vävnader genom att skjuta koroidea försiktigt inåt.
   3. Gör en annan sklerala snittet vinkelrätt mot den första sklerala snittet med skarpa microscissors, vilket skapar en T-formad inskärning.
   4. Fortsätt sedan att rakt på sak dissekera i en omkrets sätt att ta bort den sklerala vävnad från den underliggande åderhinnan och tryck försiktigt koroidea från sklera som nämnts ovan.
   5. Förstora den sklerala fliken vid behov.
      1. Försiktigt trubbigt dissekera koroidea bort från skleraunder hela processen.
      2. Större klaffen tills snitt vinkelrätt mot limbus når synnerven och ett snitt parallellt med limbus är åtminstone en tredjedel av ögat omkrets (45 °).
      3. Använd den sklerala fliken som en källa till hävstång för att manipulera ögat under trubbig dissektion. Den motdrag på klaffen gör det lättare för trubbig dissektion.
   6. Upprepa föregående steg på andra sklerala fliken.
4. Skär bort sklerala flikarna för att exponera ett stort område av åderhinna.
5. Fortsätt snittet görs i steg 3 runt ögats omkrets (360 grader).
6. Ta bort återstående åderhinnan-näthinnan vävnad.
   1. Inom det exponerade området, använd en bomullspinne för att försiktigt borsta bort åderhinnan-näthinnan vävnad kvar. Alternativt, ta försiktigt vävnaden med pincett och dra bort den underliggande glaskroppen.
   2. Om det är nödvändigt att göra ett snitt i åderhinnan stArting från synnerven. Sedan skalar bort åderhinnan försiktigt för att exponera näthinnan och glaskroppen cortex.
7. Fortsätt trubbig dissekera åderhinnan bort från sklera och sedan dra bort åderhinnan för att få det hela, intakta glaskroppen.
8. Använd sklerala kanten fäst på hornhinnan för att placera hela glaskroppen i önskad plats. Vid denna punkt, är glaskroppen fäst till den främre sklera och lins.
9. Blunt dissekera glaskroppen från insidan av sklera, runt linsen, ta bort alla sklera.
10. Använd ett trubbigt verktyg för att ösa objektivet bort från glaskroppen vid behov. Använd provet för olika vitreodynamic experiment.
    1. Placera provet i en glasbägare med känd yta som utsätts för luft. Placera syrekänsliga sonden vid kanten av provet. Använd en mikro-manipulator för att flytta sonden till ett känt avstånd (r) in i provet.
    2. Använd Ficks lag för att få den teoretiska diffusionsekvationen. Med data samlas i steg 10.1, får den experimentella diffusionskoefficienten / reaktion sikt etc.

Representative Results

Efter protokollet kommer att leda till en framgångsrik glasartad dissektion med kärnan och cortex (Figur 3) intakt. Detta framgår tydligt av de återstående bitar av näthinnan anslutit sig till glaskroppen cortex. Intakt hela glaskroppen kan användas på flera sätt för specifika vitreodynamic experiment. I vårt fall, diffusionshastigheten för syre i intakta glaskroppen och det är motsvarande tidskonstant studerades (Figur 2). Glaskroppen som dissekerades (kärna och kortex) med användning av vår metod placerades i en glasbägare med en känd exponerade ytarean. Detta var jämfört med glaskroppen som skördades med hjälp av en tidigare publicerad metod som bara isolerar glaskroppen kärnan ^6. Alla andra faktorer hölls konsekvent över de experimentella och kontrollgrupper. Den glasartade ytan exponerades för luften, vilket har en känd syrespänning (~ 160 mmHg). Syre spänningar inom glaskroppen var låg (<10 mmHg). Baserat på graden av VITRExportorienterade företag syreförbrukning bestäms av Shui et al. ¹⁴ för glaskroppen i geltillstånd, kan vi använda ekvation 1 dimensionell syretransport (i stabila eller instabila statsformer). Genom att mäta syrespänningen ett känt avstånd i glasytan, kan vi experimentellt validera diffusionskoefficienten. Syre spänning registrerades med en syresond, såsom Oxford och felgraden var ± 10%. Ett prov samlades in var 30 sekund. Närvaron av glaskroppen cortex påverkar diffusionshastigheten för syre in i mitten av glaskroppen. I närvaro av glaskroppen cortex, diffusionen av syre sker över en längre tidsintervall.

De fysikaliska egenskaperna hos glas kärnan och cortex har en inverkan på hälsa och sjukdom. Till exempel, lokal, kompletterande intraokulära syresättning har föreslagits som en behandling för retinal ischemi ^8. Förstå olika diffusionskoefficienter för syre genom glaskroppen cortexkärna gör det möjligt för forskare att förutsäga den verkliga graden av syretillförseln till näthinnan.

Figur 1:. Tvärsnittsvy av ögat som visar relevanta anatomiska strukturer (modifierad från National Eye Institute, National Institutes of Health) Hornhinnan är den transparenta vävnaden som bildar den främre mest del av ögat och ger en betydande del av ögats optiska ström. Limbus är korsningen av hornhinnan, bindhinnan och senhinnan. Sklera sträcker sig från limbus till den bakre mest aspekten av ögat där den möter synnerven. Bindhinnan är en tunn epitel som linjer mycket utanför ögat och utgör gränsen mellan den yttre miljön och sklera. De inre komponenterna i ögat består av den främre kammaren, lins, iris, ciliarkroppen, bakre kammare, bakre hålighet, näthinnan och åderhinnan. Den vitreous kärnan innefattar det centrala området av glaskroppen, inom den bakre håligheten hos ögat. Glaskroppen cortex ligger runt glaskroppen och är fäst på näthinnan vid flera punkter inklusive pars plana, retinala kärl, optisk skiva och makula. Den glasartade basen är en tredimensionell zon som sträcker sig från ~ 2 mm anteriort till ora serrata till 3 mm posteriort ora serrata. Koroidea är en vaskulär vävnad skikt som är beläget mellan sklera och retina och tillhandahåller blodtillförsel till den yttre näthinnan. Näthinnan är den neurosensoriska skiktet av ögat som subserves ljuset sändande kapacitet av ögat. Sklera är den vita opaka skiktet som ger huvuddelen av det strukturella stödet för ögat väggen.

Figur 2:. Rita av syrespänning av glasvätska mot tiden Tomt på syrespänning i glaskroppen kärna (grön linje) jämfört med intakt hel vitreous (blå linje). En syre avkänningssonden placerades i mitten av provet och provet utsattes för luft som har en syrespänning av 160 mm Hg.

Figur 3: Exempel på isolerade hela glaskropp. Övre bilden är ett exempel på hela intakta glaskroppen fortfarande fäst till den sklerala fälg. USA Bilden är ett exempel för hela intakta glaskroppen utan sklera men med några kvarvarande näthinnevävnad. Botten är ett exempel på hela, intakta glaskropp.

Discussion

Det finns två viktiga steg som måste noggrant utförts under glaskroppen dissekering. Steg 3, vilket skapar en full tjocklek sklerala fliken, är avgörande för hela dissekering. Försiktighet bör vidtas för att inte skära in i åderhinnan när man skapar hela tjockleken sklerala fliken. Den andra kritiska steget är dissekera bort sklera från åderhinnan. Detta steg måste noggrant göras för att förhindra att skapa flera hål i åderhinnan som glaskroppen kan spilla ut. Det finns ett sätt att ändra protokollet och fortfarande dissekera intakt hela glaskroppen. Steg 6 kan fördröjas till steg 8. åderhinnan kan tas bort i slutet efter det glasartade vävnaden är placerad i det önskade läget.

Begränsningen med detta förfarande är att under dissektion, det finns bara visuella ledtrådar som tyder på framgång och noggrannheten hos intakta glasartade dissektion. Eftersom glas kärnan och cortex är både öppet och undistinguishable för blotta ögat, dettakan vara en utmaning. Genom att märka vidhäftningen av näthinnan på glaskroppen är det möjligt att bestämma om det lyckas dissektion av glaskroppen cortex har inträffat. Annars, farmakologiska substanser, såsom Kenalog, kan användas för att förbättra visualisering ¹⁵ av glaskroppen, men kan inte enkelt tillåter en att skilja mellan glaskroppen cortex och glaskroppen kärnan. En annan begränsning hos denna teknik är att det är mest effektivt för dissektion av gelén glaskroppen. Human glaskroppen gel är en icke-regenerativ vävnad som genomgår kondense med åldern. Denna kondensering hindrar oss från att helt dissekera hela, intakta glaskroppen från ögat. Således sträcker sig vår teknik bara för att glaskroppen av djur, såsom kor, grisar eller kaniner, eller ögon unga människor som inte har betydande mängder av kondensering. Glaskroppen i dessa djur tenderar att vara helt i ett geltillstånd.

Men för närvarande finns ingen etablerad metod, som har varit fallanderibed i detalj, för att dissekera hela intakt glaskroppen från kadaver ögon. För närvarande är de enda vitrösa dissektion tekniker som har väl detaljerade involverar dissektion av unika men separata områden av glaskroppen ⁷ eller dissektion av bara den glasartade kärnan ^6.

Ansökningarna från dissekerade intakta glaskroppen är under uppskattade och underutnyttjade. Kirurgisk erfarenhet av glaskroppen samt kliniska, histopatologiska och biokemiska studier tyder på att de kemiska och strukturella egenskaper hos glaskroppen kan variera kraftigt ^16,17. Därför är det nödvändigt att bevara strukturen av hela glaskroppen för att studera funktionen av glaskroppen i okulär fysiologi och anatomi. Intakt glaskroppen kan explanteras till en transparent världen för bättre visualisering under experiment. De kan sedan användas för en mängd olika mekaniska / kemiska tester för att förbättra mätningarna av fysikaliska / biomekanisk propskaper av glaskroppen. Till exempel föreslår vi att dissekeras hela intakta glaskroppen kan användas i stället för saltlösning, viskösa substitut, eller glaskroppen kärnan i de citerade reologi försöken ^6,18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 forceps	Storz Opthalmics	E1793
Westcott Tenotomy Scissors Curved Right	Storz Opthalmics	E3320 R
Scalpel Handle No. 3	VWR	25607-947
Scalpel Blade, #11, for #3 Handle	VWR	470174-844