Abstract
Hayvan, bitki ve tek hücre hücreler dışarıdan sitoplazma ayıran hücre zarı olarak adlandırılan bir bariyer ile kapatılmıştır. Örneğin epitelde gibi hücre tabakaları da dış ya da çok hücreli organizmaların farklı kompartmanların iç ayıran bir bariyer oluşturur. Bu engellerin önemli bir özelliği, hücre membranları veya hücre tabakaları iyonların ayırıcı dağılımıdır. İki özellikleri bu dağılımı sağlar: 1) membranlar ve epitel belirli iyonların seçici geçirgenliğini gösterir; 2) iyonları hücre zarları ve hücre katmanları arasında pompa aracılığıyla taşınmaktadır. Bu özellikler, doku fizyolojisini korunmasında önemli rol oynarlar ve tamir sırasında, hasar sonrası ipuçlarını sinyal olarak hareket ya da patolojik koşullarda. iyon seçici kendi kendine referans mikroelektrot bu tip bir tekli hücre ve doku seviyelerinde kalsiyum, potasyum veya sodyum gibi iyonların özel tozlar ölçümleri sağlar. mikroelektrot bir iyonofor kokteyl içerirBelirli bir iyon seçici olarak geçiren. İç dolgu çözüm ilgi iyon bir dizi konsantrasyonunu içerir. mikroelektrot elektrik potansiyeli iyonunun dışında konsantrasyonu ile belirlenir. Iyon konsantrasyonu değişir, mikroelektrot potansiyeli iyon aktivitesinin günlüğünün bir fonksiyonu olarak değişir. (Nedeniyle iyon akı bir konsantrasyon gradyanı yani) ileri ve geri iyonu kaynağı veya lavabonun yanında taşındığında mikroelektrod potansiyeli iyon akışı / degrade orantılı bir genlikte dalgalanır. amplifikatör mikroelektrot sinyalini güçlendirir ve çıkış bilgisayarda kaydedilir. iyon akışı daha sonra spesifik iyon hareketliliği olarak elektrot potansiyel dalgalanma, mikroelektrot gezi ve diğer parametreleri kullanarak difüzyon Fick'in yasayla hesaplanabilir. Bu yazıda iyon seçici self-referencing mikroelektrod An kullanarak dışı iyon akıları ölçmek için metodoloji detaylı tarifbazı temsilcisi sonuçlarını sunmak d.
Introduction
Tüm hayvan hücreleri dış çevreden sitoplazma ayıran bir lipid iki katmanlı zar ile çevrelenmiştir. Hücre iyonlarının 1 aktif taşıma ile, içinde bir elektrik membran potansiyelini negatif tutar. membran potansiyeli hücre zarında 2 çeşitli moleküler cihazları çalıştırmak için kullanabileceği bir depolanmış enerji kaynağıdır. Nöronlar ve diğer heyecanlı hücrelerin büyük zar potansiyelleri var. Sodyum kanallarının hızlı açılış membran potansiyeli (depolarizasyon) çöker ve nöron 2 uzunluğu boyunca taşınır aksiyon potansiyeli oluşturur. Bunların yanı sıra hızlı elektrikli değişikliklerden birçok doku ve organları oluşturmak ve uzun vadede önemli elektrik potansiyellerini korumak. Örneğin, deri ve kornea epitel oluşturmak ve iyonların yönlü pompalama (özellikle, sodyum ve klorid) 3 trans-epitel potansiyelleri ve hücre dışı elektrik akımı muhafaza.
endojen hücre dışı elektrik akımı ölçümleri titreşimli prob 4-6 ve hücre zarlarının ve epitel hücre katmanlarının elektrik parametrelerinin ölçümünü sağlayan mikroelektrod sistemini 7-10 kullanarak membran veya trans-epitel potansiyellerin ölçümleri kullanırken çadır ">, onlar vermek katılan iyon türlerinin göstergesi.Seçici iyonofor ile Mikroelektronlar çözelti içinde spesifik iyon konsantrasyonunu ölçebilirsiniz. İyon gradyanları ya da akışkan farklı konumlarda iki veya daha fazla elektrot ile ölçülebilir. Ancak, her sonda içsel gerilim sürüklenme, farklı olabilir yanlış ölçüm ya da mevcut olmayan bir degrade bile tespit sebep olacaktır. İki nokta arasındaki düşük frekansta hareket sayede "self-referans" modunda kullanılan tek bir elektrot bu sorunu çözer. Şimdi iyon akışı nispeten yavaş ve istikrarlı sinyal sürüklenme arka planı görülebilir (Şekil 3B). iyona duyarlı bir ölçüm sistemi doku veya tek hücre yakın iyonlarının küçük bir hücre-dışı akıları tespit etmek için iyon seçici kendinden referans Mikroelektronlar kullanır. Sistem mikroelektrot hareketini kontrol etmek mikroelektrot ve mikro step motor ve sürücü sinyali işleyen bir amplifikatör oluşur. devresini kapatmak iyon seçici mikroelektrot ve ayrıca referans elektrotu bir headstage pre-amplifikatör (Şekil 1A) ile amplifikatöre bağlanır. Bilgisayar yazılımı Mikroelektrot hareketi (frekans, mesafe) parametrelerini belirler ve ayrıca amplifikatör çıkışını kaydeder. adım motoru, üç boyutlu bir micropositioner ile mikroelektrot hareketini kontrol eder. Iyon seçici mikroelektrot titreşimli düşük frekanslı ilk belirli kalsiyum akı 11 ölçmek için 1990 yılında geliştirilmiştir. Yanı sıra kalsiyum gibi, ticari erişilebilir iyonofor kokteyller şimdi MICR yapmak için kullanılabiliroelectrodes sodyum, klorür, potasyum, hidrojen, magnezyum, nitrat, amonyum, florür, lityum ya da cıva duyarlı.
Temel olarak, kendi kendine referans iyon seçici mikroelektrot tekniği, bir voltmetre ile ölçülebilir bir elektrik potansiyel bir çözelti içinde çözündürüldü, belirli bir iyon aktivitesini dönüştürür. iyonofor kokteyli karışmayan sıvı iyon-değişim özelliklerine sahip (organik, lipofilik) aşamasıdır. iyonofor seçici (bağlar) belirli bir iyonlar, tersine çevrilebilir şekilde ve mikroelektrot (elektrolit) içerdiği, sulu çözeltisi ve mikroelektrot daldırılmış olduğu bir sulu çözelti (Şekil 1D) arasındaki aktarma çalışmalarının kompleksleri. Bu, iyon aktarımı, bir elektro-kimyasal denge yol açar ve mikroelektrot ve referans elektrot arasında elektrik potansiyeli değişimi voltmetre ile ölçülür. Gerilim Nernst e göre özel iyonu aktivitesinin logaritması ile orantılı olduğuiyon konsantrasyonu (Şekil 2A ve B) hesaplanmasını sağlayan quation.
Şu anda, birkaç sistemler benzer bir kavram ya da ilke kullanarak iyon akışının ölçümü sağlar. Örneğin, Newman ve Shabala 14-16 tarafından geliştirilen tarama İyon seçici elektrot Tekniği (SIET) 12,13 veya Mikroelektrod Ion Akı Tahmini (MIFE) tekniği piyasada mevcut ve yaygın belirli iyonu belirlemek amacıyla araştırma topluluğu tarafından kullanılmaktadır hayvan, bitki ve tek canlı hücre modelleri çeşitli genelinde hücre zarı ve doku meydana gelen akıları. İyon seçici Mikroelektronlar serebral arter farede 18 ve polen tüpleri 19, paten retina hücreleri 20 hidrojen akı, fare kemik 21, çeşitli iyon kalsiyum akışının hidrojen, potasyum ve kalsiyum akısını bitki köklerine 17 arasında, klorür akının ölçülmesi için kullanılmıştır mantar hif 22 ve r akılarıTek hücreli yara sırasında kornea 23 ve son olarak kalsiyum akı ile 12,24 şifa. Ayrıca iyon seçici kendinden referanslı Mikroelektronlar 25 hakkında detaylı bilgi için aşağıdaki gözden bakın.
aşağıdaki makale hazırlamak ve tek hücre düzeyinde iyon seçici self-referencing mikroelektrod tekniği kullanılarak endojen hücre dışı iyon akıları ölçümünü nasıl gerçekleştirileceği detaylı olarak anlatılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Hazırlık
- Iyon seçici mikroelektrot hazırlanması
- Isı, bir mikroelektrot çektirmenin kullanarak filamanın (1.5 mm dış çaplı, 1.12 mm iç çap) olmadan, ince duvarlı borosilikat kılcal çekin.
Not: Bu, ipuçları çapı 3-4 mikron verir. Daha küçük ipuçları elektronik gürültüye Mikroelektronlar daha duyarlı hale getirir ve aynı zamanda iyon konsantrasyonunda bir değişikliğe daha yavaş bir tepki ile ilişkili yüksek dirence sahiptir. Faydalı bilgiler Smith ve ark., 26 tarafından yayınlanan yazıda bulunabilir. - Lipofilik iyonofor kokteyl tutulmasını yardımcı olmak için iç yüzeyini hidrofobik hale getirmek için elektrotlar Silanize. Bunları kurutmak için> 100 ° C 'de, bir fırın içinde bir metal raf ve ısı O / N mikroelektrot yerleştirin. raf 2 mm çapında delikleri olan bir metal plaka ile yol parçası delinir. Ml gr delik elektrotlar 250 ile yukarı ucu yerleştirinbunların üzerine kız beher.
- Sabah, fırın kapatın ve yalıtımlı eldiven giyerek, dikkatle yerine elektrotlar ve beher metal raf çıkarın. Isıyı korumak için fırın kapağını kapatın.
- Lateks veya nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takın. Plastik Pasteur pipeti ile, her elektrodun dibinde silanizasyon çözeltisinin ben bir damla koyun (yerinde beher tutmak, pipet erişimi için dökme dudak kullanın). silanizasyon çözüm sıcak plaka ile buharlaşmış ve elektrotların içini silanizes edilir. Bu aşamada bir kimyasal çıkarıcı davlumbaz kullanın. Birkaç saat kalan silanizasyon çözümü buharlaşmasına izin sıcak fırında raf / beher / elektrotların geri yerleştirin.
Not: Güvenlik nedeniyle, tekrar fırını açmayın. Zararlı ve yanıcı buhar içerebilir gibi açık olmamalıdır gösteren fırın bir etiket yerleştirin. - Soğutulduktan sonra, bir mikroelektrot kavanozlar insi mikroelektrot depolamakkurutucu 400 g cam bir desikatörde de. Mikroelektronlar haftalarca bu şekilde saklanabilir.
Not: alternatif bir silanizasyon yöntemi Smith ve diğerleri tarafından tarif edilmektedir: 26. - Ölçülecek olan iyon, 100 mM ihtiva eden bir çözelti 50-100 ul (yaklaşık 1 cm uzunluğu) (bakınız Tablo 1 ve Şekil 1B) mikroelektrot geri-dolgu. Ince bir filamanın bir Bunsen beki çekti atılabilir plastik Pasteur pipeti ısı kullanın. Tıkanmayı önlemek için daha sonra DH 2 O pipet durulayın.
Not: Alternatif olarak, dış solüsyon 27 iyon konsantrasyonunu maç dolgu çözeltisinin iyon konsantrasyonunu ayarlayın. - Hava kabarcıkları olmaması sağlamak için bir tahlil mikroskobu altında mikroelektrot dikkate alınmalıdır.
- Dikey elektrot tutarken kabarcıklar tırnağınızla hafifçe mikroelektrot mevcut musluk varsa (aşağı ucu) ve / veya kabarcık itinİğneyi yerine bir silikon tüp ile modifiye bir şırınga kullanarak geri basınç uygulayarak ucu dışarı s.
- Iyon spesifik iyonofor kokteyl 15 ila 20 nl (30-50 mikron uzunluğunda) ile mikroelektrot ucu doldurmak (bakınız Tablo 1). Bir mikroskop lamı kısa kenarında iyonofor kokteyl küçük bir damlacık yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında mikroelektrot ucu gözlemleyin ve mikroelektrod ucu sadece yaklaşık yarım saniye iyonofor kokteyl temas edene kadar mikroskop lamı doğru hareket ettirin. Kılcal basınç ile mikroelektrot içine iyonofor kokteyl çizin.
Not: Bu elektronik parazit (gürültü) ile bu duyarlı yapabilirsiniz sondanın elektrik direncini artırır ve aynı zamanda yanıt süresini yavaşlatır olarak iyonofor kokteyl uzun bir sütun kaçının. - Altın, 1 mm erkek konektör ve AgCİ (Ag +), tel (Şekil 1B) düz bir mikroelektrot tutucu mikroelektrot monte edin. </ Li>
- Üç boyutlu bilgisayar kontrollü elektronik micropositioner (Şekil 1A) üzerine monte kafa aşamasına mikroelektrot yuvasını takın.
- Örnek ölçülebilir için çözelti, uygun ölçme bölgesi mikroelektrot ucu yerleştirin (fizyolojik tuzlu su, kültür ortamı, vs.) mikroelektrot bir saat ya da iki ya da gece boyunca stabilize etmek için izin vermek.
- Isı, bir mikroelektrot çektirmenin kullanarak filamanın (1.5 mm dış çaplı, 1.12 mm iç çap) olmadan, ince duvarlı borosilikat kılcal çekin.
- Referans elektrotunun hazırlanması
- Referans elektrot (Şekil 1C), yukarıdaki ile aynı kılcal bulunmaktadır. 5 cm uzunluklarda bir elmas kalemle kılcal kesin ve Bunsen alev 1-2 saniye boyunca her iki ucunda yangın cilalı.
- NaCI, 3 M çözelti, ~ 200 ul, bu elektrotlar dolgu,% 2 agaroz ile CH3 CO2 K (potasyum asetat) ya da KCI. Iyon bağlı olarak çözelti, ölçülecek seç (referans elektrotu ölçülecek iyon içermemelidir; bakınız Tablo 1). Karıştırmakagaroz ve neredeyse bir mikrodalga kaynar çözümü ve ısı. Agaroz çözmek için karıştırın (çözelti berrak gider).
- Bir plastik Pasteur pipeti referans elektrodu takın ve kılcal içine sıcak çözüm çizin.
- Kullanmadan önce mühürlü tüplerde bu 3 M çözelti soğuk 3 M NaCI, CH 3 CO 2 K veya KCl çözeltisi ve mağaza içine elektrod bırakın. Hava kabarcıkları ile herhangi bir referans elektrotlar atın.
- Düz bir mikroelektrot tutucu bir referans elektrot içindeki (önceden doldurulmuş 3 M çözelti) ile bir AgCI (Ag +) ile pelet ve altın 2 mm erkek konektör (Şekil 1C) monte edin ve bir manuel mikro konumlayıcı üzerine elektrotu ve tutucuyu manyetik bir stand üzerine monte edilmiş.
2. İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Kalibrasyon
- Referans çözelti olarak ilgi iyonu içeren kalibre çözümleri hazırlanması; Tablo 1 bakınız (örneğin kültür ortamı, serum fizyolojik) olan konsantrasyonu ayraç. Yani, bir kalibrasyon çözeltisi ölçüm çözeltisi içinde daha iyonunun daha düşük bir konsantrasyonda içerir ve daha yüksek bir zorunluluktur.
- Örneğin, K + 1 mM içeren tuzlu su kullanın. Bu konsantrasyon braketine, seri seyreltiler halinde 10, 1 ve 0.1 mM bir konsantrasyona kadar iyonu giderilmiş su içinde KCI toz çözülür. Bu kalibrasyon çözümlerini kullanın. Seçenek olarak ise, bu çözümlerin en az iki kullanın.
- Iyon seçici mikroelektrot ve her kalibrasyon çözeltisi içinde referans elektrot daldırın ve voltaj değeri özel bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kaydetmeden önce 1 dk 3 için stabilize izin (Tablo 1).
- Yazılım bir txt dosyası olarak veri (amplifikatör çıkışı) olarak kaydeder, bir elektronik tablo dosyasına veri kopyalama. Logaritması karşı Mikroelektrot çıkışı (mV) Plotmol iyon konsantrasyonu (Şekil 2A).
- Doğrusal regresyon uygulayın ve Nernst eğim, kesişme ve R2 değerini hesaplamak. Nernst eğim tek değerli iyonlar için 58 ± 11 mV / on ve iki değerlikli iyonlar için 29 ± 11 mV / on ise mikroelektrot Kabul (katyonlar için, Nernst eğim anyonlar için negatiftir, pozitiftir). Ayrıca, iyi Mikroelektronlar güçlü bir doğrusal ilişki (Şekil 2B R 2> 0.9) olması gerekir.
Not: Burada kullanılan amplifikatörün mV çıkış mV on kat kazanç okuma verir. Değerler on kat bölünmesi gerekir. - Gerçek iyon konsantrasyonu (Şekil 2B) içine mikroelektrot ham mV çıkış dönüştürmek için lineer regresyon formülü kullanın.
İyon seçici Mikroelektrod Tekniği 3. Doğrulama
- Yapay kaynak hazırlanması
- Yapay kaynak kılcal aynı kılcal damarlar gibidirYukarıda. Isı adım 1.1.1 deki gibi bir mikroelektrot çektirmenin kullanarak kılcal çekin.
- NaCI, KCI, 1 M çözelti, 200 ul, CaCI2 2H 2, O ya da pH 4 tamponu, bu kılcal Dolgu. Seçin iyon bağlı yapay kaynak çözüm (Tablo 1) ölçülecek.
Not: Alternatif olarak, büyük uç çapı (~ 20 mm) ile elektrotlar çekin aynı çözümleri ile ucu doldurun ama% 0.5-1 agaroz içeren (agaroz çözüm herhangi bir toplu akışını önleyecektir). - Bir mikromanipülatör yapay kaynaklı kapiler monte edin ve örneklerde iyon akışını ölçmek için kullanılan çözelti içinde bırakın. Gradyan stabilizasyonunu sağlamak için 1 saat kadar 30 dakika boyunca çözelti içinde yapay kaynak bırakın.
- Iyon seçici mikroelektrot Doğrulama
- İki ölçme işlemi için kullanılan çözeltide yapay kaynaklı kılcal ila yaklaşık bir santimetre uzaklıkta iyon seçici mikroelektrot daldırınörnekler üzerinde iyon akı yeniden ve daha önce olduğu gibi referans elektrodu ile devreyi kapatın. Gerilim değeri 1 ila 2 dakika süreyle özel bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kaydetmeden önce 1 dk 3 için stabilize edelim. Bu değer, (aynı zamanda bir referans, arka plan veya boş değer olarak ifade literatürde) tamponu değerine karşılık gelir.
- Yapay kaynaktan yaklaşık 5 um iyon seçici mikroelektrot getirin ve 1-2 dakika için bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kayıt işleminden önce voltaj değeri 1 dakika ila 3 için stabilize sağlar.
- Yapay kaynak kılcal uzak 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ve 1280 mikron de iyon seçici mikroelektrot koyarak yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
- Bir txt dosyası olarak verileri ayıklayın ve bir elektronik tablo dosyasına değerleri kopyalayın.
- Kalibrasyon değerleri için olduğu gibi aynı şekilde mV değerlerine karşılık gelen iyon konsantrasyonu hesaplanır. Değeri çizilir.
Hayırte: bir iyon akışı varsa, mikroelektrot iki konum (Şekil 3B) arasındaki iyon konsantrasyonu bir fark tespit eder. Yapay kaynaklı çözeltisi daha ölçülen türlerin daha fazla iyon içeriyorsa, konsantrasyon doğru (bu durumda, bir iyon akışının yönünü tespit etmek için iyon seçici mikroelektrot yeteneğini doğrulamak uzakta, daha kaynağına daha yakın olmalıdır akış; yapay lavabo için, orta ölçme daha düşük spesifik iyon konsantrasyonu ile bu) akını olması gerekir.- Difüzyon Fick yasasını kullanarak iyon akışını hesaplayın: J = c μ c çözeltide iyon konsantrasyonunu (mol cm -3) ise, μ iyon hareketlilik olduğunu (DC / dx) (mol cm N -1 sn -1) ve DC mesafesi dx (cm) (Şekil 2C) üzerine konsantrasyonu farktır. İyon akı veriler genellikle pmol cm -2 s sunulmuştur-1 Veya nmol cm -2 sn -1.
Not:.. Smith ve arkadaşları 26 tarafından tarif edilen iyon akışı hesaplama için alternatif bir yöntem de kullanılabilir. Ana farklılıklar difüzyon katsayısı kullanımı yerine iyon hareketlilik ve numune olmadan tuzlu su çözeltisi içinde iyon akışının ölçümü hesaplanan arka plan iyon akı (ayrıca sürüklenme veya düzeltme faktörü voltaj) çıkarma sayılabilir. - Kaynak (Şekil 2D) uzaklaştıkça karşı her bir aşama, iyon tozlar ortalamasını çizilir. Kaynağından uzaklaşan, iyon akı farklı büyüklüğünü algılamak için iyon seçici mikroelektrot yeteneğini doğrulama akı değeri üstel azalma gözlemlemek.
- Büyük bir sinyal-n onun doğru yönü ve büyüklüğü ölçümleri doğrulamak için kaydedilen amaçlanan her bir spesifik iyon kez yapay kaynak doğrulama yapınOise oranı.
Not: numune olmadan tampon iyon akışı ölçümü arka plan düzeyi veya gürültü gösterir. Tipik olarak, tampon ölçümü değişken yön gösterir çok küçük akı giden iyon konsantrasyonunun net dalgalanma gösterir.
- Difüzyon Fick yasasını kullanarak iyon akışını hesaplayın: J = c μ c çözeltide iyon konsantrasyonunu (mol cm -3) ise, μ iyon hareketlilik olduğunu (DC / dx) (mol cm N -1 sn -1) ve DC mesafesi dx (cm) (Şekil 2C) üzerine konsantrasyonu farktır. İyon akı veriler genellikle pmol cm -2 s sunulmuştur-1 Veya nmol cm -2 sn -1.
Odası'nı Ölçme 4. hazırlanması
Not: deneyler öncesinde, örnek ölçülecek düşünün ve örnek nasıl monte edilir ve mikroelektrot ölçümleri için hareketsiz hale getirilecek.
- Xenopus oosit ölçümleri 800 um naylon örgü (Nitex örgü) içindeki bir 1 cm'lik bir karenin kesilmiş ve plastik Petri kabı (Şekil 1E) içine tutkal laevis için.
5. iyon akışı ölçüm
- Kalibrasyon çözeltisi ile aynı şekilde örnek ölçümler yapmak için kullanılan tampon içinde mevcut iyon konsantrasyonu ölçümü. X. laevis oositleri Mark'ın Modifiye Zil (MMR) gerektirir. D100 NaCl, 2 KCI, 2 CaCl, 1 MgCl ve 5 HEPES: issolve NaCI, KCI, CaC, MgCİ ve deiyonize su içine HEPES (mM) bir son konsantrasyon elde etmek. NaOH kullanılarak 7.5'e tampon pH ayarlayın.
- Ölçüm odasına örnek yerleştirin ve mikroelektrot (Şekil 3A) yakın konumunu tanımlamak için micropositioner kullanarak (yaklaşık 10 mikron uzaklıkta) numune yakın iyon seçici mikroelektrot getir.
- Özel yazılımı kullanarak yakın pozisyonda ve uzak (uzak) örnek bir pozisyon arasında mikroelektrot düşük frekanslı (0.3 Hz) gezi (100 mikron) başlatın. Mikroelektrot hareketi örneğinin yüzeyine dik olduğundan emin olun.
Not: mikroelektrot gezi yazılımına ayarlanabilir. Büyük gezi ölçüm süre boyunca küçük tozlar daha kolay bir algılama sağlayan okuma degrade örnekleme aralığı uzatır ve zamansal çözünürlüğe azalır artar. Görmek- Yazılımını kullanarak kayıt başlatın. mikroelektrot her pozisyonda duraklar ve mV elektrik potansiyeli bilgisayarda kaydedilir. Sinyal stabilizasyon sağlayan, en az 2 dakika süreyle ölçümleri elde edilir. Kısa zaman atlamalı deneyler, bütün zaman elbette ilgi pozisyonunda rekor potansiyel varyasyonlar için.
- Bir txt dosyası olarak verileri ayıklayın ve bir elektronik tablo dosyasına değerleri kopyalayın.
- Kalibrasyon değerleri için olduğu gibi aynı şekilde mV değerlerine karşılık gelen iyon konsantrasyonu hesaplanır. Değeri çizilir.
Not: Bir iyon akışı varsa, mikroelektrot iki konum (Şekil 3B) arasındaki iyon konsantrasyonu bir fark tespit eder.- (Adım 3.3.1) daha önce olduğu gibi difüzyon Fick'in yasasını kullanarak iyon akı hesaplayın.
- Yeni bir örnek ölçümünden önce tampon ölçümü tekrarlayın ve her yeni için akı ölçüm ve hesaplama prosedürü tekrarlayınörneği.
6. İstatistiksel Analiz ve Veri Sunumu
- Ve / veya karışık etkileri 28 ile ANCOVA modelini kullanarak kontrol koşulu altında iyon akıları zaman konumunun bağımsız etkilerini test edin.
Not: kovaryans analizi (ANCOVA) kategorik ve sürekli hem tedbirlerin bağımsız değişkenler olarak kullanılmasına izin düzenli ANOVA ve regresyon karıştırır genel lineer model. Buna ek olarak, bireysel ve nihai iç içe etkilerine göre tekrarlanan tedbirlerle uyarılan ilişkili hataların varlığında, karma etki modelleri hem sabit hem de rastgele etkilerin doğru tahminler modellemek için kullanılır. - Çoklu test 28 için Bonferroni düzeltmesi ile grup düzeyleri arasında Student t-testi kullanılarak ikili karşılaştırmalar hesaplayın.
- Kutudiyagramlar pozisyonu ve zamana göre iyon akı ölçümlerini özetlemek oluşturun. Açıklanan ikili Öğrenci t p değerleri içerir(Şekil 3D), yukarıda ve aşağıda p değerleri anlamlılık düzeyini göstermektedir: *: p <0.05; **: P <0.01; ***: P <0.001 29
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz daha önce kalsiyum akını tek hücre 24 yaralama sonra görünür olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, diğer iyon akıları tek hücre yaralama üzerine ortaya olup olmadığını sordu. Biz X'i kullanılan oosit, tek bir hücre yara iyileşmesi 30-34 ve elektrofizyolojik kayıt 24,35-39 için köklü bir model laevis. İlginçtir, potasyum iyonları X içinde daha konsantre olan laevis oosit (yaklaşık 110 mM) (MMR 1x: 1 mM) kullanılan hücre dışı çözelti içinde 40 yaralama üzerine potasyum bir akışını göstermektedir. Hipotezini teyit etmek amacıyla, X boyunca potasyum akışı ölçülür iyon seçici self-referencing mikroelektrot kullanarak oosit hücre zarı şifa laevis.
Oositi yara için, öncelikle büyük bir ipucu boyutu (~ 50 mikron) ile bir kılcal elektrot çekin. Düz bir elektrot tutucu elektrot takın ve manuel mikro-pozisyoner üzerine monte edin. Oocy YaraElektrot ucu 24, membran dokunarak te. Yakında yaralama sonra (; - D Şekil 3B 250 nmol cm -2 sn -1 kadar) potasyum büyük bir çıkışını algıladı. (; - D Şekil 3B yaralama sonra 16 dakika kadar) membran yara iyileşmiş gibi, bu akı sağlam zarında görülen Yaralanmamış akı değerleri (~ 5 nmol cm -2 sn -1) yara iyileşmiş dönen, azaldı. ANCOVA potasyum akı ölçümleri (p <0.001) yaralama sonra zaman önemli bir etkisi saptandı. Hoc Mesaj anlamlı 1-2 dakika (p <0.001) potasyum akışını artmış ve 5-6 dk (p <0.05), ancak ortaya çıkarmıştır analizleri olmayan sağlam hücre zarı durumda (Şekil 3D) ile karşılaştırıldığında yaralama sonra 15-16 dk. Biz tek bir hücre yaralama üzerine, potasyum bir akış du azaltmak yara seviyesinde görünür sonucuna varmıştırşifa seyrini halka.
| Iyon | Ionofor kokteyl | Elektrolit çözeltisi (100 mM) | Referans çözeltisi (3 M) | Yapay kaynak çözüm (1 M) |
| Ca 2+ | Kalsiyum iyonofor I Kokteyl A (cat # 21048) | CaCI2 2H 2 O | KCI | CaCI2 2H 2 O |
| Na + | Sodyum iyonofor II Kokteyl A (cat # 71178) | NaCl | KCI | NaCl |
| CI - | Klorür iyonofor I Kokteyl A (cat # 24902) | NaCl | CH 2 CO 2 K (Potasyum Asetat) | NaCl |
| K + | Potasyum iyonofor I Kokteyl A (cat # 60031) KCI | NaCl | KCI | |
| H + | Hidrojen iyonofor I Kokteyl A (cat # 95291) | pH 7.0 | KCI | pH 4.0 |
Tablo 1:. Yaygın olarak kullanılan ionofor kokteyller örnekleri de gösterilen uygun çözümler yapay kaynağı, Mikroelektronlar yerleştirmek ve kalibrasyon işlemlerini gerçekleştirmek için vardır. Katalog numarası Sigma-Aldrich vardır.
Şekil 1:. Iyon seçici kendini referans mikroelektrod sistemi İyon seçici Mikroelektronlar (A) şematik gösterimi. (B) İyon seçici mikroelektrot. (C) Referans elektrot. (D) Dış çözüm ve microel arasında iyon değişimiiyonofor yoluyla ectrode. Ölçme bölmesinin (E) Şema X için kullanılan oosit laevis.
Şekil 2: İyon seçici Mikroelektronlar kalibrasyon, yapay kaynak ve akı hesaplama (A) Kalibrasyon eğrisi.. Iyon konsantrasyonu kalibrasyon eğrisi ve hesaplama (B) Denklem. Iyon akışının (C) hesaplanması. Suni kaynak (1 M KCl) belirli mesafelerde ölçülen (D) İyon akı.
Şekil 3: X potasyum akı Evrimi iyileşme sırasında oosit yarayı laevis. (A) Fotoğraf ve gezi illüstrasyonX de iyon konsantrasyonunun ölçülmesi iyon seçici mikroelektrot oosit yara laevis; '' a '' ve '' v 'ile kesikli çizgi hayvan-bitki ekseni temsil eder. X potasyum iyonu konsantrasyonunun varyasyon (B) Çizim iyileşme sırasında oosit yara laevis. (C) Dağılım (xy) ortalama ve X. sırasında farklı zamanlarda yara düzeyinde potasyum akı standart ölçme hatası gösteren arsa oosit yara iyileşmesini laevis. (D) X Boxplot sırasında farklı zaman yara seviyesinde potasyum akı ölçümü gösteren oosit yara iyileşmesi laevis (n = 16; aşağıdaki gibi gösterilir p,: *: p <0.05; ***: p <0.001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
in vivo olarak, hücre dışı, iyon akıları başarılı ölçümü için en kritik adımlar şunlardır: gürültüsünün azaltılması, iyon seçici Mikroelektronlar ve referans elektrotunun doğru imalatı, ve örnek ve her iki elektrot arasında konumlandırılması.
Gürültüyü en aza indirmek için, kayıt sistemi, tercihen de topraklı bir metal tepesinde (titreşim izolasyon) tablosu ile topraklı (topraklı) Faraday kafesi olmalıdır. Buna ek olarak, mikroskop şasi de topraklanmalıdır. Elektrik gürültü kaynakları ışık kaynağı bulunmaktadır. Bir fiber optik 'fansız' ışık kaynağı minimum elektrik gürültü neden olur. Son olarak, sahipleri de Tekrar klorid mikroelektrot gümüş tel ve pelet tutmak (sodyum hipoklorit çamaşır suyu dalış ve dH 2 O durulayın) gürültü en aza indiren iyon seçici mikroelektrot veya ölçüm neden olacaktır referans elektrot hava kabarcıklarının .The varlığı olarak başarısızlıkmikroelektrot iletkenliği sıfır veya tehlikeye olacaktır. Bu nedenle, sahipleri onları takmadan önce mikroskop altında elektrotları doğrulamak için çok önemlidir. Hava kabarcıklarını çıkarmak için ayrıntılı prosedür için protokol bakın. örnek ve mikroelektrot hem de doğru konumlandırılması, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. iyon akışının ölçülmesi mikroelektrot gezi ve örnek olarak bir pozisyonda bağlıdır. Bu tam numune üzerinde ölçülür ilgi alanlarını belirlemek ve örnek dik bir hareket olması mikroelektrot konumlandırmak için önemlidir. Değişmiş iyonu neden olur numune dik olmayan bir şekilde Mikroelektronlar Herhangi gezi ölçümleri ve örnekler arasında artan değişkenliği akılarında.
Belirli iyonları ölçmek için özel iyonofor kokteyl, örneğin potasyum için de, sodyum gibi diğer iyonların varlığını algılayabilir.Ölçüm solüsyonu iyonofor kokteyl için rekabet iyonu yüksek bir miktarda ihtiva etmesi durumunda, bu yapay kaynak deneyi kullanılarak iyonofor kokteyl seçiciliğini belirlemek için önemlidir. Burada çözelti, X kültürlemek için kullanılan laevis oosit (MMR) sodyum yüksek bir konsantrasyon içerir. Bu nedenle, aynı zamanda, kullanılan potasyum iyonofor kokteyli sodyum algılar olup olmadığını değerlendirmek için önemlidir. (1 M NaCl; Tablo 1) potasyum iyonofor kokteyli dolu mikroelektrot kullanarak, yüksek sodyum konsantrasyonu içeren yapay kaynağı kullanarak bir sodyum akı ölçmek için deneyebilirsiniz aynı ölçüm çözümü tutmak. Kimyasal degrade sodyum akışını yanadır, ama ideal hiçbir sodyum, potasyum akı özgü iyonofor kokteyl ile tespit edilmelidir. Önemli bir akı ölçülürse, deney koşulu optimize edilmelidir. Örneğin, rakip iyonu konsantrasyonu noktasına m aşağı indirdi olabilirBu potasyum akı ölçümleri sırasında olası müdahale lider, plazma zarından sodyum akı etkileyebilir iken icroelectrode, artık algılamaz. İdeal olarak, yapay kaynak deneyi hesaplanan bir düzeltme faktörü verilerine tatbik edilebilir, ya da başka bir iyonofor kokteyli test edilebilir. İyon iyon seçici kendinden referanslı mikroelektrot kullanarak ölçümler iyon akıları ölçümü sulu çözeltide hücre ve doku meydana gelen izin akı. Bir hava ortamı ile temas halinde normal olarak hücre veya dokularda iyon akıları ölçümleri çevreleri doğal olarak mevcut değildir ve bu normal koşullar altında meydana iyon akımına ve değişim değiştirebilir bir çözelti varlığını gerektirir. Özel dikkat Bu çözeltinin içeriğini tanımlar ve orijinal, fizyolojik bir ortam sapmayı en aza indirmek için yapılmalıdır. iyon seçici kendinden referans microele ölçülebilir iyonların tayfıctrode tekniği ilgi iyon seçici özgü iyonofor kokteyller kullanılabilirliği ve varlığına bağlıdır.
Iyon seçici kendi kendine referans mikroelektrot ile yapılan iyon akışı ölçümleri hücre dışı, iyon flux invazif olmayan ölçümü sağlayan, genellikle, hücre veya dokularda yüzeyine yakın bir çözelti yapılmaktadır. Bu yöntem, hücre ve hücre içi alan arasında, doku iç kısmındaki iyon akılarının ölçülmesine izin vermez. iyon seçici kendini referans mikroelektrod in vivo iyon akıları ölçülmesine izin veren tek yöntem değildir. Alternatif yeni bir yöntem floresan Biyoelektrik gazetecilere Mikroelektronlar kullanarak mümkün değildir iyon akıları ölçümünü sağlayan 41 kullanır. Bu boyalar doku ve hücrelerin içindeki iyonlar akı ölçümlerini izin ve hücre içi lokalizasyonu elde edebilirsiniz. Bu teknik doku ve hücrelerin ancak iyon değil eski iç iyon akışının uzamsal bilgiyi edinebilirlerdoku ve hücre dışı uzay arasında değişir. Ayrıca, floresan Biyoelektrik gazetecilere genellikle yarı-kantitatif veriler üretir. iyon akıları ölçmek için mikroelektrot tabanlı teknoloji kullanımı hala geçerli ve gereklidir ve onları tamamlayıcı hale ziyade teknikleri rakip, floresan Biyoelektrik gazetecilere kullanımına ek bilgi getirir. Buna ek olarak, ilginç son gelişmeler, oksijen, nitrik oksit ve nörotransmitter dopamin ve glutamat 42,43 ve amperometrik kendinden referanslı detektörleri bulunmaktadır. Amperometrik algılama sensörü ucunda bir kimyasal reaksiyon dayanmaktadır. Yeni fiber optik Mikroelektronlar ("optrodes") non-invazif metabolik oksijen akı 34,35 ve yüksek seçicilik ve duyarlılık 45,46 ile pH 44 ölçmek için geliştirilmiştir. 47 glukoz duyarlı bir enzim bazlı nanopartikül kaplı prob artık bulunmaktadır.
Biz th olduğunu gördükE iyon seçici kendini referans mikroelektrod in vivo hücre dışı iyon akıları ölçümleri sağlar. İyonlar sadece canlı organizmalar içinde hücreler ve dokular arasındaki hücre / doku ve hücre dışı alana değil, aynı zamanda arasında değiş tokuş edilmez. Bu yüzeyi yakınındaki iyonu akısının gerçek ölçümlere ek olarak doku iç kısmındaki iyon tozlar uzaysal çözünürlüğü takdir etmek için flüoresan Biyoelektrik muhabir olarak başkalarıyla Bu teknik birleştirmek için önemlidir. Buna ek olarak, iyon akıları hücre zarı potansiyelinin, trans-epitel potansiyeli veya hücre dışı elektrik akımları ile birlikte hücre ve dokuları tanımlayan biyoelektrik devletinin önemli bir bölümünü temsil etmektedir. Bu kombinasyon, hücre zarı ve trans-epitel potansiyelin yanı sıra, hücre dışı elektrik akımlarının 24 ölçmek için, iyon tozlar ölçümü ek olarak önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M.
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D.
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C.
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
