Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Invasion der Tumorzellen in lebenden normalen Gewebefragmente in drei Dimensionen zu studieren. Diese Organkulturtechnik wird hauptsächlich angewendet, um potentiell antiinvasive drugs in vitro zu testen.
Abstract
Das Ziel des Kükens Herz Assay ist, einen relevanten Organkulturverfahren zur Tumorinvasion in drei Dimensionen zu studieren bieten. Der Assay kann zwischen invasiver und nicht-invasiver Zellen zu unterscheiden, und ermöglicht Untersuchung der Wirkungen der Testverbindungen auf das Tumorinvasion. Krebszellen - entweder als Aggregate oder einzelne Zellen - sind mit Fragmenten von embryonalen Hühnerherz konfrontiert. Nach Organkultur in Suspension für einige Tage oder Wochen die gegenüberliegenden Kulturen fixiert und in Paraffin eingebettete histologische Analyse. Die dreidimensionale Wechselwirkung zwischen den Krebszellen und normalen Gewebe wird dann von Serienschnitte mit Hämatoxylin-Eosin oder nach immunhistochemischer Färbung für Epitope in das Herzgewebe oder die Krebszellen gegen gefärbten rekonstruiert. Der Test wird in Übereinstimmung mit der bisherigen Konzept, dass Krebsinvasion ist das Ergebnis der molekularen Wechselwirkungen zwischen den Krebszellen und deren Nachbar stromale Wirtselemente (Myofibroblasten endothElial Zellen, extrazelluläre Matrixkomponenten, etc.). Hier wird diese stromalen Umgebung an die Krebszellen, wie einem lebenden Gewebe Fragment angeboten. Stütz Aspekte der Relevanz des Assays sind mehrfach. Invasion in den Test ist in Übereinstimmung mit den Kriterien der Krebsinvasion: progressive Besatzung und Ersatz in Zeit und Raum des Wirtsgewebes und Invasivität und nicht-invasiven in vivo der gegenüberliegenden Zellen korreliert im allgemeinen mit den Ergebnissen des Assays. Ferner die Invasion Muster von Zellen in vivo, wie durch Pathologen definiert wird in den histologischen Bildern im Assay wider. Quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehung (QSAR) Analyse der mit zahlreichen potentiell anti-invasive organischen Kongeners Verbindungen erhaltenen Ergebnisse erlaubt die Untersuchung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen für Flavonoide und Chalkone und bekannte anti-metastatischen Medikamente in der Klinik verwendet wird (zB Mikrotubuli-Inhibitoren ) hemmen Invasion im Test als gut. However, der Test nicht berücksichtigt immunologischen Beiträge zur Krebsinvasion zu nehmen.
Introduction
Invasion ist das Markenzeichen von bösartigen Tumoren. Diese Aktivität führt nicht nur zur Zerstörung der umliegenden Gewebe, aber auch bei der Metastasenbildung beteiligt. Da Krebspatienten sterben an der Invasion und Metastasierung, und effiziente anti-invasive Behandlungen sind immer noch knapp, Labortests, die die Invasion der Tumorzellen entwickelt, zu imitieren. Das Ziel des Kükens Herz Assay ist, einen relevanten Organkulturverfahren zur Tumorinvasion in drei Dimensionen zu studieren bieten. Der Assay kann zwischen invasiver und nicht-invasiver Zellen zu unterscheiden, und ermöglicht es, die Wirkungen der Testverbindungen auf das Tumorinvasion zu studieren.
Das Grundprinzip hinter der Verwendung des Assays ist die eigentliche Konzept dass Tumoren Ökosysteme denen die neoplastischen Zellen kontinuierlich mit ihren Stroma (Wirtszellen und extrazelluläre Matrix) zusammenwirken, und dass durch diese molekularen Wechselwirkungen Invasion fein abgestimmt 1. So, im Test-Tumorzellen werden mit livi konfrontiertng embryonalen Hühnerherz Fragmente 2, die nicht nur als Träger für die Invasion von Tumorzellen, sondern auch als eine Quelle von verschiedenen Arten von Stromazellen und Matrixelemente zu dienen. Das Küken Herz enthält Muskelzellen, Fibroblasten und Endothelzellen, und die extrazelluläre Matrix aus Laminin, Fibronectin und verschiedene Arten von Kollagen. Auf diese Weise deckt der Organkultur-Technik dreidimensionale vielen zellulären und molekularen Wechselwirkungen in Invasion Patiententumoren beteiligt ist.
Der Hauptvorteil des Kükens Herz Assay ist die Implementierung von Stromazellen Wirkungen. Dieser Aspekt ist vollständiger als in anderen Invasion in vitro-Assays, die auf Tumorzellinvasion in nicht-lebenden Gele der Basalmembran 3 oder Zwischenraummatrix 4 Molekülen basieren. Das Konzept der Konfrontation zwischen Tumorzellen und normalen Lebenswirtsgewebe als in Organkultur Experimenten gefunden wurde von mehreren eingeführtAutoren wie Wolff und Schneider in Frankreich 5, Easty und Easty im Vereinigten Königreich 6 und Schleich in Deutschland 7. Zwei technischen Vorteile der Küken Herz Invasionstest in den genannten Verfahren ist, dass das Volumen der Fragmente können leicht standardisiert werden, und dass sie Kontraktions, die funktionelle Integrität Überwachung während der Organkultur erlaubt bleiben. Weiterhin sind Vogelembryonen bevorzugt, weil sie leicht aus dem sterilen Inhalt des Eis seziert. Der Assay weist konzeptionell Ähnlichkeit mit dem Küken Chorioallantoismembran-Assay 8, indem sie eine komplexe stromal umgibt, um die Tumorzellen.
Der Test ist erfolgreich angewandt worden, wie beispielsweise in der MCF-7 (Mamma) 9 und HCT-8 (Kolon) 10 Zelllinie Familien zwischen invasiver und nicht-invasiver Zellvarianten aus den gleichen menschlichen Tumoren zu unterscheiden. Das Verfahren ist nützlich, um potentiell antiinvasive Verbindungen sowie zu testen
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Protocol
Abbildung 1. Schematische Übersicht über die verschiedenen Testschritte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
1. Herstellung der Vorkultur Herz Fragmente (PHFs)
- Inkubieren Sie ein befruchtetes Hühnerei bei 37 ° C für 9 Tage. Füllen Sie dieses Inkubation von einem Datum, das anschließende Herstellung PHFs ermöglicht während der 4 Tage (beispielsweise an einem Donnerstag) und letzte Konfrontation mit Tumorzellaggregate (zB auf dem Nest Montag).
- Desinfizieren Sie die Shell mit 70% (v / v) Ethanol in Wasser. Führen Sie alle weiteren Manipulationen in einem Gewebekulturschrank mit sterilen Lösungen und Materialien. Öffnen Sie die Schale an der embryonalen Pol mit stumpfen Pinzette.
- Ziehen Sie den Embryo durch holding der Hals mit einer Enukleation Löffel (Abbildung 2). Platzieren des Embryos in eine Glaspetrischale mit einem Durchmesser von 5 cm mit 5 ml Ringer-Salzlösung.
- Öffnen Sie das ventrale Thoraxhaut durch Aufreißen der Haut mit einem scharfen Zange in beiden Händen, entfernen Sie das Brustbein durch die gleiche Art von Manipulation und sezieren die Herzen mit Mikrodissektion Iridektomie Schere, um ihre großen Blutgefäßen zu trennen. Führen Sie alle weiteren Manipulationen unter einem Makroskop mit einem kalibrierten Augengitter.
Abbildung 2. Die Aufhebung der Embryo aus dem Ei mit einem Löffel Enukleation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Übertragen Sie die Herzen in eine Glaspetrischale miteinen Durchmesser von 5 cm, die 5 ml MEM-Rega 3 Kulturmediums mit 5% fötalem Rinderserum. Entfernen Sie die Vorhöfe und die damit verbundenen Gefäße durch Resektion des oberen Schädel Drittel des Herzens mit Mikrodissektion Iridektomie Schere. Präparieren Sie die Herzbeutel von den Ventrikeln mit einem Paar von scharfen Pinzette.
- Machen Sie eine sagittal Hemisektion in den Ventrikeln mit Mikrodissektion Iridektomie Schere, und entfernen Sie das Blut durch leichtes Schütteln mit einem scharfen Zange.
- Übertragen der Ventrikel in einen anderen Glaspetrischale mit einem Durchmesser von 5 cm mit 5 ml frischem MEM-Rega 3 Kulturmediums mit 5% fötalem Rinderserum. Schneiden die Ventrikel in Stücke von etwa 0,4 mm im Durchmesser durch Verwendung Mikrodissektion Iridektomie Schere. Ein Herz kann etwa 100 Fragmente ergeben.
Hinweis: Ein Herz kann etwa 100 Fragmente ergeben - Drehen Sie die Petrischale vorsichtig, um alle ventrikulären Fragmente in Richtung der Mitte der Schale zu fahren. Entfernen Sie alle Corpora aliena mit einer Nadel aus Edelstahl von Septemberarating sie von den ventrikulären Fragmente und treibt sie in Richtung des Umfangs der Petrischale.
- Übertragung der Herz Fragmente mit einer Pasteur-Glaspipette in ein 50 ml-Erlenmeyerkolben mit 2 bis 3 ml Kulturmedium (MEM-Rega 3 plus 10% v / v fötalem Rinderserum).
Hinweis: Der genaue Mittelvolumen hängt von den variablen unteren Ausbuchtungen der einzelnen Kolben: das Zentrum ihrer Boden sollte durch einen dünnen Film von nur Flüssigkeit bedeckt sein. - Gas den Kolben (e) mit einem Gemisch aus 5% CO 2 in Luft durch die Anschläge und der Kolben (s) auf einem gyrotory Schüttler bei 37 ° C bei 70 Umdrehungen / min (rpm) für 24 Std. Die Begründung für diese Suspensionskultur Schritt ist sphäroidischen Herzgewebefragmente für eine nachfolgende Konfrontation mit Tumorzellaggregate erhalten.
- Übertragen Sie die Herz-Fragmente und deren Kulturmedium in eine Petrischale. Entsorgen Corpora aliena, nekrotischen (dunkel) Fragmente und Konglomerate von Herz Fragmente mit einer Nadel.
- Inkubiere die verbleibenden Herz Fragmente in einen anderen 50 ml-Erlenmeyerkolben, enthaltend 6 ml Kulturmedium, wie in Schritt 1.9 für weitere 60 h beschrieben.
Hinweis: Während dieser Inkubationszeit werden die Fragmente sphärischen geworden. Sie bestehen aus einem Kern aus Myoblasten und einer dünnen Schicht aus Fibroblasten an der Peripherie. - Wählen sphäroidischen Fragmente die eine dünne, homogene Schicht aus Fibroblasten (Bildung einer durchscheinenden Kapsel) und einen Durchmesser von 0,4 mm mittels einer Makroskops und Nadeln. Ein Küken Herz wird etwa 20 geeignet PHFs ergeben. Transfer dieser PHFs, von denen viele rhythmisch bei 37 ° C zusammenziehen, um eine weitere Petrischale mit frischem Kulturmedium. Diese PHFs sind bereit für Konfrontation mit Testzellen.
2. Vorbereitung und Konfrontation von Kugel Test-Zellaggregate
- Vorbereitung halbfesten Agarmedium: 100 mg Agar in 15 ml Ringers Salzlösung durch Kochen dreimal. Cooldie Suspension auf 40 ° C abgekühlt und 7,5 ml Ringer-Salzlösung / Eiweiß (1: 1) und 7,5 ml fötalem Rinderserum.
- Vorzubereiten 6 ml einer Suspension, die 1 × 10 5 Testzellen / ml in ihren geeigneten Kulturmedium in einem 50 ml Erlenmeyerkolben. Tun Sie dies, 3 Tage vor dem Beginn der gegenüberstehenden Kultur ist geplant. Der Kolben wird auf einem gyrotory Schüttler bei 37 ° C bei 70 UpM für 3 Tage. Gas den Kolben mit einem Gemisch aus 5% oder 10% (v / v) CO 2 in Luft, je nach der Art des Kulturmediums verwendet.
- Sehen Sie sich die Aggregate unter einem Makroskop mit einem kalibrierten Augengitter ausgestattet. Wählen (mit Nadel) sphäroidische Zellaggregate mit einem Durchmesser von 0,2 mm.
- Verwenden eine Pasteurpipette zu acht gewählt PHFs (Durchmesser = 0,4 mm) in einer minimalen Menge von Kulturmedium in eine embryo Uhrglas enthaltende halbfeste Agar Medium 13 übertragen. Verschieben Sie die einzelnen PHFs mit einer Nadel, um einen Kreis zu bilden. Saugen Sie die überschüssige Mediummit einem kleinen Stück Filterpapier (siehe Abbildung 3).
Abbildung 3. Aspiration von überschüssiger Flüssigkeit um PHFs. Acht PHFs werden auf halbfesten Agar in einer embryologischen Uhrglas gelegt und Flüssigkeitsüberschuß wird mit einem kleinen dreieckigen Stück op Filterpapier entfernt. Pfeile zeigen die 8 einzelnen PHFs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Bringen zehn ausgewählten sphäroidischen Zellaggregate (Durchmesser = 0,2 mm) in den Kreis mit einer Pasteurpipette. Saugen Sie die überschüssige Medium. Bewegen um ein Aggregat zu jedem der PHF mit der Nadel, bis sie miteinander in Kontakt zu machen. Saugen Sie die überschüssige Medium mit einem kleinen Stück Filterpapier.
- Verschließen Sie den Deckel des Uhrglas mit Paraffin und incuBeize bei 37 ° C für 4 bis 24 h, abhängig von den Klebeeigenschaften der Testzellen an die PHFs.
- Tauche den gegenüberliegenden Paaren mit vorgewärmter (37ºC) Kulturmedium und Übertragen jedes einzelne Paar mit einer Pasteur-Pipette in ein 5-ml-Erlenmeyerkolben mit 1,5 ml Kulturmedium.
- Die Kolben werden auf einem inkubieren gyrotory Schüttler bei 37 ° C auf 120 UpM eingestellt. Gas den Kolben mit 5% oder 10% (v / v) CO 2 in Luft, je nach der Art des Kulturmediums für die Testzellen (siehe Abbildung 4) verwendet.
- Konzentration der Medien zu vermeiden, befeuchten die Gase, indem sie durch zwei Zusatz 5 ml-Erlenmeyerkolben mit 2 ml Ringer-Salzlösung gefüllt. Aktualisieren Sie das Kulturmedium alle 8 Tage.
Abbildung 4. Kleine Erlenmeyerkolben auf einem gyrotory shak. er die Kolben mit 1,5 ml Kulturmedium werden mit Silikon verschlossen und mit einem Gas in ausgerüstet abgedichtet - und Auslauf Nadel und bewegt bei 120 UpM bei 37 ° C. Das Gas wird durch eine Einlassleitung (1) an den Erlenmeyerkolben (2) mit steriler Ringer-Salzlösung gefüllt geführt und weiter verteilt (3 und 4) zu kleineren Kolben, die Kulturmedium mit individuellen gegenüberliegenden Paaren (5 und 6). Schließlich wird verbrauchtes Gas in großer Kolben, der mit einem sterilen Wasserfalle (7) gesammelt, von wo es in die Luft entweichen. (8) Die Abbildung zeigt zwei Sätze von Kultur-Batterien auf einem hausgemachten Plattform Platte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. Histologie der gegenüberliegenden Kulturen
- Bereiten Sie die Bouin-Hollande Fixierungslösung.
- Man löst 2,5 g Kupferacetat (neutral) in 100 ml einzelsträngiger destilliertem Wasser undlangsam 4,0 g Pikrinsäure.
- Die Lösung wird über ein Papierfilter. 10 ml Formalin und 1 ml Essigsäure. Mischungs 9 Teile dieser Lösung mit 1 Teil eines gesättigten Quecksilberchlorid-Lösung in Einzel destilliertes Wasser.
ACHTUNG: Diese Lösung enthält mehrere toxischen Substanzen. Formalin ist giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Essigsäure ist ätzend für Mund und Darm-Trakt nach der Einnahme. Pikrinsäure ist allergen und explosiv, wenn schnell erhitzt oder Percussion. Quecksilberchlorid ist stark ätzend auf die Schleimhäute und nefrotoxic. Schutzkleidung und Schutzhandschuhe tragen zur Herstellung von Bouin-Hollande-Lösung und damit umgehen in einem gut belüfteten Bereich entfernt von Feuer. Eine alternative Befestigungsverfahren wird in 4% Formaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung bezogen.
- Fixieren die einzelnen Kulturen nach mehreren Tagen oder Wochen der Inkubation wie folgt. Erstens, übertragen Sie die Kulturen auf Ringer-SalzLösung für einige Sekunden an Serumproteine zu entfernen. Als nächstes tauchen in Petrischalen mit einem Durchmesser von 3 cm mit 3 ml von Bouin-Hollande Fixierungslösung für ca. 2 h.
- Dreimal in 3 ml entmineralisiertes Wasser vor Inkubation in Wasser für 2 h, so viel Fixierungslösung wie möglich entfernen, spülen Sie die Kulturen. Schließlich übertragen zu 3 ml 70% (v / v) Ethanol in Wasser. Halten die Kulturen bei dieser Lösung O / N, aber dies kann für eine Anzahl von Tagen verlängert.
- Dehydratisieren durch Übertragung sequentiell durch Gläser, die 100 ml 96% (v / v) Ethanol in Wasser, 100% Ethanol oder 100% iges Isopropanol und 100% Xylol, jeweils 2 Stunden.
- Übertragen Sie jede Kultur auf ein separates Deckglas (mit einer minimalen Menge von Xylol), legen Sie das Deckglas auf dem Boden eines Weinflaschenkapsel zur Paraffineinbettung, und decken die festen Material mit flüssigem Paraffin bei 56 ° C. Inkubieren bei 56 ° C für 24 h und dann Abkühlen des eingebetteten Materials auf RT.
ACHTUNG: Wenn ein Benzolderivat Xylol kann nach Inhalation toxisch sein und sollten in gut gelüfteten Bereichen nur behandelt werden.
- Übertragen Sie jede Kultur auf ein separates Deckglas (mit einer minimalen Menge von Xylol), legen Sie das Deckglas auf dem Boden eines Weinflaschenkapsel zur Paraffineinbettung, und decken die festen Material mit flüssigem Paraffin bei 56 ° C. Inkubieren bei 56 ° C für 24 h und dann Abkühlen des eingebetteten Materials auf RT.
- Entfernen Sie die Weinflasche Kapsel und das Deckglas, und schneiden Sie die Paraffinblock, der die feste Kultur enthält.
- Stellen Sie 8 um dicke Paraffinschnitte der gesamten gegenüberliegenden Paar mit einem Mikrotom 14, und sammeln Sie alle Abschnitte über drei Wechselmikroskopglasobjektträger, die mit Gewebeklebstofflösung als Haftmittel vorbehandelt wurden. Vermeiden Eiweiß als Haftmittel, denn es kann mit Immunfärbung stören.
Hinweis: Die Vorbehandlung der Mikroskopglasobjektträger wird durch die Bereitstellung von 1 kleinen Tropfen Gewebeklebstofflösung und 3 kleine Tropfen entmineralisiertem Wasser mit einer Pasteur-Pipette, und Mischen, um die Schiebeabdeckung gemacht. - Entfernen Sie das Paraffin von der ersten Folie durch zweimaliges Eintauchen in ein Glas mit 100 ml 100% Xylol 10 min.
- Rehydrieren Sie die Folien durch Eintauchen für 10 s inGläser, die 100 ml der folgenden Lösungen: Xylol / Ethanol (1: 1) 100% Ethanol, 96% (v / v) Ethanol in Wasser, 70% (v / v) Ethanol in Wasser und schließlich vollentsalztes Wasser.
- Aufzulösen Quecksilberchlorid-Kristalle durch Eintauchen in ein Gefäß, das 100 ml von 0,5% (w / v) Jod in 96% (v / v) Ethanol in Wasser für 2 min.
- Löschen der Abschnitte in einem Gefäß mit 100 ml von 5% (w / v) Natriumthiosulfat in Wasser für 10 Sekunden. Dann waschen Sie die Objektträger gründlich in destilliertem Wasser.
- Inkubieren Sie die Objektträger in einem Glas mit 100 ml Harris Hämatoxylin für 2 min, kurz eintauchen in 0,1 M HCl und dann in fließendem Leitungswasser 10 Minuten lang waschen.
- Inkubieren in einem Gefäß mit 100 ml Eosin 0,1% (w / v) in Wasser für 1 min.
- Dehydratisieren via kurzen Eintauchen in Gläser, die 100 ml der folgenden Reihe von Lösungen: entmineralisiertes Wasser, 70% (v / v) Ethanol, 96% (v / v) Ethanol, 100% igem Ethanol zweimal, Xylol-Ethanol (1: 1) und schließlich in 100% Xylol.
- Montieren Sie dieObjektträger mit Eindeckmedium durch die Bereitstellung von 2 separate Tropfen des Mediums auf den Folien, lassen Sie diese erweitern indem Sie ein Deckglas auf sie, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 24 Stunden aushärten.
4. Immunhistochemie
- Vorbereitung Tris-gepufferter Salzlösung (TBS). Man löst 6,0 g Tris- (hydroxymethyl) -aminomethan (Tris-Base) und 45,0 g NaCl in 4,5 l entmineralisiertem Wasser. Bringen Sie auf pH 7,6 mit 1 M HCl (etwa 42 ml). In destilliertem Wasser auf 5 L. machen
- Vorbereitung Tris-HCl-Puffer. Man löst 60 g Tris-Base in 800 ml entmineralisiertem Wasser. Bringen Sie auf pH 7,6 mit 6 M HCl (etwa 65 ml). In destilliertem Wasser auf 1 L. verdünnen 10x mit destilliertem Wasser vor der Verwendung machen.
- Bereiten Tris-BSA-Puffer 0,1%. Man löst 12,1 g Tris-Base und 45,0 g NaCl in 4,5 l entmineralisiertem Wasser. Bringen auf pH 8,2 mit 1 M HCl (ca. 42 ml). Hinzuzufügen 5,0 g Rinderserumalbumin (BSA) und 6,5 g NaN 3. In demineralisiertem Wasser bis 5 L. machen
ACHTUNG: NaN3 ist ein hochtoxisches Produkt. Berührung mit Säure sehr giftige Gase. Handschuhe und vermeiden Einnahme mit allen Mitteln. NaN3 Formen hochempfindliche explosionsgefährliche Verbindungen mit Kupfer, Blei und anderen Metallen. Flush Waschbecken mit viel Wasser. Eine alternative Konservierungsmittel 0,01% Thiomersal. - Folgen Sie Produkte von 3,2 bis 3,10.
- Tauchen Sie die Objektträger in TBS oder Tris-0,1% BSA-Puffer, und wischen Sie überschüssige Flüssigkeit rund um die Abschnitte mit einem Papiertuch.
- Gelten 150 ul normales Ziegenserum 1:20 verdünnt in TBS oder in 5% (w / v) BSA in Tris-0,1% (w / v) BSA-Puffer für 30 min in einem Hochfeuchtigkeitsraum (einen geschlossenen Kasten für die Co -incubation der Objektträger mit einem offenen Wasserbehälter eine hohe Luftfeuchtigkeit im Inneren). Dann entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Papiertuch.
- Gelten 150 ul primäre Antiserum in Tris-0,1% (w / v) BSA mit 1% (v / v) normales Ziegenserum für mindestens 2 Stunden in einem Hochfeuchtigkeitskammer. Bestimmen Sie die optimale Verdünnung des primären Antiserum empiritisch.
Anmerkung: Immunhistochemie verwendet werden, um Antigene zu detektieren chick Herzen werden, aber unter Verwendung von spezifischen Antikörpern können die für Küken Herzgene beschriebene Technik auf andere Antigene (beispielsweise grün fluoreszierendes Protein), 15 angewendet werden. - Zweimaliges Waschen der Objektträger in Tris-0,1% w / v BSA auf einem Schüttler für 5-10 min.
- Entfernen überschüssiger Flüssigkeit mit einem Papiertuch und gelten 150 ul Ziegen-Anti-Kaninchen-Antiserum in Überschuß (z. B. 1:20 in TBS) für mindestens 1 Stunde in einem Hochfeuchtigkeitskammer.
- Zweimal waschen mit TBS auf einem Schwingtisch für 5-10 min.
- Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Papiertuch. Es gelten die Peroxidase-anti-Peroxidase-Komplex 1: 250 verdünnt in TBS, ergänzt mit 1% (v / v) normales Ziegenserum für mindestens 1 Stunde in einem Hochfeuchtigkeitskammer. Die Verdünnung des Komplexes hängt von der Charge.
- Waschen Sie die Objektträger mit TBS und Transfer in Tris-HCl-Puffer pH 7,6.
- Die Objektträger in eine Tris-HCl-Puffer, enthaltend 0,25 g / L Diaminobenzidin und 0,01% (v / v) H 2 O 2 für ein paar Minuten. Stoppen Sie die Inkubationszeit, wenn die Küken Herz gefärbt. Prüfen Sie regelmäßig, unter dem Mikroskop.
- Die Objektträger in Tris-HCl für 10 Minuten und dann in destilliertem Wasser.
- Folgen Sie Artikel 3.13 und 3.14.
Hinweis: Für die Antigene, die leicht während der Fixierung zerstört sind, kann Kryoschneiden der Kulturen eine Alternative für die immunhistochemische Analyse bieten. Dies wird in dem folgenden Protokoll Schritten beschrieben: - Die lebenden Kulturen Waschen mit 3 ml Ringer-Salzlösung an Serumproteine zu entfernen.
- Einen Tropfen Einbettungsmedium in die vorgekühlte (-16 ° C) Probenhalter eines Kryomikrotom. Übertragen des kultivierten Gewebes von der Kante einer Deckglas auf den Anfang der Tropfen, bevor es vollständig gefroren ist.
- Kühlen Sie die Kultur zu -16 ° C, schneiden Sie 6 um dicken Gefrierschnitten, und sammeln sie auf Gelatine-beschichtetenGlasobjektträger.
- Fixieren der Objektträger in Aceton bei 4 ° C für 10 min vor der Lagerung bei 4 ° C.
- Folgen Sie Produkte von 4,5 bis 4,15.
5. Bewertung der Untersuchungsergebnisse
Hinweis: Bei dem vorliegenden Test wird Invasion wie die fortschreitende Besetzung der PHF durch die Konfrontation mit Testzellen definiert. Mikroskopische Analyse aller konsekutiven Abschnitte von einem gegenüberstehenden Kultur erlaubt die Rekonstruktion der Wechselwirkung zwischen der Testzellaggregaten und PHFs in drei Dimensionen.
- Beachten Sie die unterschiedlichen Interaktionsmuster und Grad nach der folgenden Skala (siehe Abbildung 5).
Grad 0: Nur PHF beobachtet. Keine gegen Zellen beobachtet werden kann.
Grad I: Die gegenüberliegenden Testzellen dem PHF angebracht ist, aber nicht das Herzgewebe, auch nicht die äußersten fibroblastische Zellschichten zu besetzen.
Grade IIa: Beruf der PHF ist auf der Außen Fibroblasten-ähnliche und Myoblasten cell Schichten.
Grade IIb: Die PHF hat die Zellaggregate umgeben, aber es gibt keine Anzeichen für eine Besatzung.
Grad III: Die gegenüberliegenden Zellen das PHF besetzt, aber mehr als die Hälfte der ursprünglichen Menge des Herzgewebes intakt.
Grad IV: Die gegenüberliegenden Zellen mehr als die Hälfte des ursprünglichen Volumens des PHF besetzt.
Anmerkung: Klasse I und II werden mit nicht-invasiven Zellpopulationen beobachtet, während Klassen III und IV, die typisch für Invasion sind. Bis zum Fortschreiten in verschiedenen Zeitrahmen zu bewerten, sollte die histologische Analyse zu konfrontieren nach unterschiedlichen Inkubationszeiten fixierten Kulturen angewendet werden.
Abbildung 5. Beispiele für Interaktionen zwischen gegenüberliegenden Krebszellen und PHFs. Histologischen Schnitten zu konfrontieren Kulturen entweder gefärbt mit Hämatoxylin-Eosin (links Platten) oder immunohistochemically mit einem Antikörper gegen chick Herz (rechte Bilder). Interaction Typen werden in der Protokolltext definiert. (H: Herzgewebe, T: Tumorzellen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
6. Toxizität Beurteilung nach Drug Behandlungen
- Übertragen der zugewandten Kulturen in einem minimalen Volumen bis 24-Well-Gewebekulturmultiplatten mit einer Pasteur-Pipette.
- Die Kulturen durch Zugabe von 500 & mgr; l der drogenfreien Kulturmedium zu waschen und zu aktualisieren, nachdem 6 Stunden.
- Überprüfen Sie alle Brunnen täglich für Zell Auswuchs aus den Explantaten mit einem inversen Mikroskop (Objektiv 40X). Teilen die Anzahl der entwachsen Kulturen durch die Gesamtzahl von explantierten Kulturen, um einen Index des Überlebens der gegenüberliegenden Kulturen erhalten. Vergleichen Sie die Ergebnisse der mit Arzneimittel behandelten Kulturen mit Lösungsmittel behandelten diejenigen.
Hinweis: Die Verwendung von Ki67 Immunhistochemie (für die Zell prolifmenarbeit) und der TUNEL-Assay (Apoptose) als komplementäre Techniken, um dem Explantat-Test zur Beurteilung Toxizität vorgeschlagen.
7. Growth Bewertung der Konfrontation Kulturen
- Machen Sie Schwarz-Weiß-Fotografien der Kulturen kurz vor der Fixierung mit einem Mikroskop mit einem digitalen Fotoapparat ausgestattet (Objektiv 50X)
- Messung in mm der größeren (a) und kleineren (b) Durchmesser der Kultur unter Berücksichtigung der Vergrößerung.
- Berechnen des ungefähren Volumens (V) in mm 3 über die Formel 16
- V = 0,4 xaxb 2
- Berechnung der Wachstum der Kultur durch Vergleich dieser Endvolumen mit den kombinierten Volumina von PHF und Zellaggregat zu Beginn der Konfrontation.
Anmerkung: Da einsame PHFs neigen, ihr Volumen während der Kultur zu verringern, ist das Wachstum der sich gegenüberliegenden Paare abhängig von den Tumorzellen.
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Representative Results
Die histologischen Schnitte wie in Figur 5 dargestellten Ergebnisse zeigen das Endergebnis einer Anzahl erfolgreicher Assays. Die Schall Histologie der Kulturen zeigt lebensfähige Zellen und ermöglicht, die Interaktion zwischen Tumorzellen und normalen Gewebe zu interpretieren. Es kann ausserdem nicht Immunreaktion vom normalen Gewebe beobachtet werden, was die korrekte Alter der Hühnerembryonen verwendet zB bestätigt, bevor die Immunabwehr System entwickelt. Es sind keine Bakterien sichtbar, die Abwesenheit von (brutto) Kontamination während der Kulturperiode angibt. Schließlich wird die abgerundeten Umfang der Abschnitte bestätigt Kultur in Suspension ohne Anzeichen einer (temporären) Festhalten an der Erlenmeyerkolben Wand.
Viele Verbindungen wurden in dem Assay getestet. Arzneimittel werden in der Regel in das Kulturmedium abgegeben in dem Moment, die gegenüberliegenden PHF / Tumoraggregatpaare mit kleinen Erlenmeyerkolben (Schritt 2.7) überführt. Einige wurden als Werkzeuge eingesetzt (in bekanntInhibitoren und Aktivatoren), um Wege und Effektormoleküle in den Prozess der Tumorinvasion beteiligt zu entwirren. Andere Verbindungen, die strukturell verwandt sind, wurde eine quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehung (QSAR) auf Basis der Ergebnisse des Hühnerherzinvasionstest etabliert. Also, für ähnliche polyphenolics mehrere Rechen Deskriptoren wurden verwendet, um die Vorhersage ihrer anti-invasive Aktivität in dem Test zu ermöglichen. Über einen Zeitraum von 15 Jahren 139 verschiedene Analoga wurden auf ihre mögliche antiinvasiven Wirkung in dem Test getestet, und ihre Aktivitäten wurden in 4 Gruppen eingeteilt. Eine Ausbildung und ein Validierungssatz, bestehend aus 93 und 46 dieser Polyphenole bzw. wurden zufällig ausgewählt. Mittels eines QSAR künstliches neuronales Netz die Ergebnisse der Validierungssatz zeigten eine deutliche Korrelation zwischen den vorhergesagten und experimentellen anti-invasive Tätigkeiten 17 (siehe Abbildung 6).
Die Daten zeigen die Robustheit the chick Herzen Invasionstest, da die Korrelation zwischen vorhergesagten und experimentellen Ergebnissen war über 15 Jahre gültig ist und vor kurzem in einem (unveröffentlicht) Vorhersage Studie mit verschiedenen Polyphenolen bestätigt. Die Verwirrung Matrix in Abbildung 6 präsentiert einen Überblick über die Schwäche und die Stärke des Tests grafisch: es gibt einen groben Ausdruck der Genauigkeit und die Reproduzierbarkeit. Die Interpretation dieses Diagramm sollte Berücksichtigung der biologischen Variabilität lebender Organkulturen und die semi-quantitative Punktzahl der Invasion Ergebnisse zu nehmen.
Abbildung 6. Externe Validierung eines prädiktiven QSAR-Modell (künstliches neuronales Netz) für die Aktivität von kleinen Molekülen in der Küken Herz Invasionstest. Die Ausgabe dieses Modells ist die anti-invasive Aktivität Klasse von Verbindungen. Vier solcher Klassen definiert wurden, representing die niedrigste Konzentration, bei der ein Molekül anti-invasive Tätigkeit ausübt (dh Invasion Grad I oder II) in der CHI-Assay: Klasse 4 (aktiv bis zu 1 & mgr; M), Klasse 3 (10 & mgr; M), Klasse 2 (100 & mgr; M) und Klasse 1 (keine Anti invasive Aktivität bei Konzentrationen bis zu 100 uM). Die dargestellte Konfusionsmatrix vergleicht vorhergesagt und experimentell bestimmt anti-invasive Aktivität Klassen für die Verbindungen der Validierungssatz. Die Validierung Set enthält 46 Verbindungen, die Ausbildung gesetzt 93. Modellvorhersagen basieren ausschließlich auf Deskriptoren aus Molekülstruktur berechnet auf der Basis, und können damit zur hypothetischen Verbindungen erhalten werden. Auf diese Weise können synthetische Anstrengungen auf viel versprechende Moleküle mit in silico Tätigkeit fokussiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Während der Herstellung der PHFs können die Fragmente nicht in Suspension bleiben, aber sich an der Gefäßwand; Dies kann durch Erhöhung des Volumens des Kulturmediums überwunden werden. Wenn die Anzahl der PHFs zu niedrig ist und ihre Größe zu groß ist, verringern das Volumen des Kulturmediums. Versagen der Testzellen zu aggregieren können aufgrund von Schwankungen in der Temperatur oder einer mikrobiellen Infektion. Alternativ kann eine Unfähigkeit zu aggregieren ein charakteristisches Merkmal der Zellen sein. Während der Befestigung der Aggregate, um PHF kann eine schlechte Haftung durch Verlängerung der Inkubationszeit auf die Oberseite der halbfesten Agarmedium oder durch Entfernen flüssiger Kulturmedium um die Kulturen mittels absorbierende Filterpapier überwunden werden. Prüfen Sie auch auf mikrobielle Kontamination in diesem Fall. Schwierigkeiten beim Schneiden kann durch Zerfall der Paraffinblöcke werden: Dies geschieht, wenn die Lagerzeit der Blöcke ist zu lang (zu schmelzen das Paraffin wieder einmal). Beim Schneiden Kunstifacts auftreten, die Integrität der Mikrotom-Messer und die Abwesenheit der Corpora aliena in den fixierten Kulturen überprüft werden. Nekrosen in den Kulturen sind Zeichen der schlechten Kulturbedingungen. Wenn diese Flächen an der Mitte der Kulturen beschränkt ist, sollte man das Volumen der Konfrontation zu groß zu vermuten. Die richtige Auswahl der Mengen der PHF und Zellaggregate ist zwar ein kritischer Faktor. Jedoch mehr in Richtung unangemessen pH-Kontrolle, eine mikrobielle Kontamination oder Fixierung Artefakte generali Nekrose Punkten. Schließlich, wenn die Abschnitte zu dunkel erscheinen, die Eintauchzeit in Hämatoxylin kann zu lang sein, oder die Abschnitte zu dick sein (> 8 um).
Viele Variationen der Küken Herz-Assay wurden erfolgreich in Invasionsstudien angewendet. Diese Variationen betreffen die Herkunft des Wirtsgewebes, der Darstellung von den gegenüberliegenden Testzellen und den Inkubationsbedingungen. Herzfragmenten aus Speziesandere als Küken 18 und aus Geweben wie Leber 19, Lunge 20 und dem Gehirn 21, wurden untersucht. Anstelle von Aggregaten wurden Proben Biopsie 22 Mono Fragmente 23 und Zellsuspensionen wurden eingesetzt, um mit PHF in Organkultur zu konfrontieren. Suspensionskulturen werden manchmal von statischen Kulturen auf einem halbfesten Substrat 24 ersetzt und serumfreien Auseinandersetzungen wurde gezeigt, machbar mit bestimmten Arten von Zellen 25 sein. Im Allgemeinen wird die Interaktion in Übereinstimmung mit einer semiquantitativen Skala 26 jedoch beschrieben, wurden computergestützte automatisierte Bildanalysesysteme auch entwickelt 27,28. Letztere Ziel, quantitative Informationen über das Ausmaß der Tumorzellinvasion ist.
Wie das Küken Herz-Assay umfasst einen Wohnwirtsgewebe, versucht das Setup, um die Situation in vivo zu rekapitulieren, und klar ist von einiger Bedeutung im Vergleich zu other Systeme in vitro (siehe Einleitung Abschnitt). Es sollte jedoch erkannt werden, dass der Test fehlschlägt, alle Elemente der in natürlichen Tumoren, Umgebungen, in denen zum Beispiel immunologische Faktoren können das invasive Verhalten von Krebszellen beeinflussen vorliegenden microecosystem umfassen. In mindestens einer Studie wurde die Abwesenheit solcher Faktoren im Assay zu widersprüchlichen Ergebnissen zwischen den Ergebnissen der Küken Herz Assay 29 und diejenigen von einem Tiermodell 30 geführt.
Eine zukünftige Anwendung wird die Untersuchung der Herzmuskelvorläuferzellen in dem Test sein. Diese Zellen können therapeutisch in Infarkt Zonen Herzpatienten injiziert werden, aber sie sollten in der Lage, in das Myokard zu integrieren. Im Herzen chick Assay die Vorläuferzellen werden mit Küken Herz Fragmenten konfrontiert zu werden, und ihre Migration und Differenzierung untersucht.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
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