Abstract
I løpet av postnatal utvikling, granule umodne celler (eksitatoriske interneuroner) oppviser tangentiell migrasjon i det ytre granulære lag, og deretter radial vandring i molekyllaget og Purkinje cellelaget for å nå det indre granulære lag av lillehjernen cortex. Standard i trekk prosesser induserer enten celledød eller misplacement av nervecellene, noe som fører til underskudd i ulike lillehjernen fungerer. Sentripetal granule cellemigrering involverer flere mekanismer, slik som kjemotaxis og ekstracellulær matriks nedbrytning, for å lede cellene mot sin endelige posisjon, men de faktorer som regulerer cellemigrering i hvert kortikalt lag bare er delvis kjent. I foreliggende fremgangsmåte, blir akutte cerebellare skiver fremstilt fra P10-rotter blir granule celler merket med et fluorescent cytoplasmatisk markør og vev er dyrket på membraninnsatser fra 4 til 10 timer før sanntidsovervåking av cellemigrering ved konfokal macroscopy ved 37 ° C iTilstedeværelsen av CO 2. Under sin vandring i de forskjellige kortikale lag av lillehjernen, kan granule celler utsettes for neuropeptid-agonister eller antagonister, proteasehemmere, blokkering av intracellulær effektorer eller til og med toksiske stoffer som alkohol eller metylkvikksølv for å undersøke deres mulige rolle i regulering av nevronal migrasjon .
Introduction
I utviklings cerebellum, er åtte forskjellige typer av nerveceller produsert sekvensielt mellom den andre embryonale uken og den andre uken etter fødselen hos gnagere 1. Som stammer opprinnelig fra en primær germinal sone, umodne granule celler (GC) er de siste neuronene som skal produseres fra det ytre granulære lag (EGL), en sekundær germinal sone to. I løpet av de første tre ukene etter fødselen, er cerebellar cortex et foliert struktur organisert i fire lag, inkludert EGL, den molekylære lag (ML), en Purkinje cellelaget (PCL) og det indre granulære lag (IGL) (figur 1). Gjennom sentripetal migrasjon, umoden GCer, glutamaterge interneuroner, nå IGL innen ca. 2 dager. Ved den tredje uke etter fødselen, forsvinner EGL og IGL utgjør det som kalles den granulære lag (GL) i voksen cerebellum. I GL, GCer motta eksitatoriske synaptiske innspill fra mosegrodde fiber og unipolare pensel celler, oghemmende synaptiske innspill fra Golgi celle aksoner. I ML, GC aksoner gjøre eksitatoriske synapser med gabaergic nevroner inkludert Purkinje celler, kurv celler, stel celler og Golgi celler to.
Real-time observasjon av celle bevegelse i akutte lillehjernen skiver innhentet fra tidlig postnatal gnagere viser at GCer endre sin form samtidig med endringer i modalitet og hastigheten på migrering i løpet av oppholdet rute i lillehjernen cortex tre. I løpet av de to første postnatal uker, GC forløpere sprer aktivt på toppen av EGL. I den midtre delen av EGL, postmitotic GCer migrere tangentialt i retning av deres større prosess. På grensen EGL-ML, GCer bremse deres bevegelse, cellene begynner å legge inn en kort vertikal synkende prosessen inn i ML. I ML, gcs har en vertikalt langstrakt cellekroppen, en tynn etterfølgende prosess, og en mer voluminøs ledende prosess, og migrere radielt langs Bergmann glial fibrene. IPCL, GCer stoppe deres bevegelse, men etter en lengre stasjonær fase (2 timer), krysser de grensen PCL-IGL. I IGL, gcs migrerer mot bunnen av laget i fravær av glial fiberunderstøttelse. Når tips av de ledende prosessen nærmer IGL-hvit substans (WM) grensen, GCer sakte og stoppe deres bevegelse. Tverrgående deler av lillehjernen er foretrukket for tangensiale migrasjon studier i EGL mens sagittal skiver er dedikert til radial migrasjon i ML, PCL og IGL. Noen regulatoriske faktorer av GC bevegelser inkludert nevropeptider (f.eks somatostatin, PACAP) har blitt identifisert så langt, men de komplette mekanismene som er involvert i rom-tid-kontroll av GC migrasjon i hvert kortikale lag er fortsatt i stor grad ukjent 1,4,5,6.
GC migrasjon har blitt undersøkt i løpet av de siste 20 årene gjennom video- og konfokalmikroskopi hjelp av enten overført lys belysning for isolerte dyrkede celler eller fluorescensdeteksjon for acute lillehjernen skiver. Utgangspunktet lipofile DII, og mer nylig "Cell Tracker" fargestoffer og celle uttrykt fluorescerende proteiner ble brukt for confocal eller to-foton mikros 7,8. Vellykkede forsøk avhengig av en rekke spesifikke prosedyrer som gjør protokollen enkel, men ikke lett. Spesielt akutte skiver må være stabilisert under observasjonene vanligvis med en hjemmelaget nylon mesh nettverk 9. Intensiteten av lys belysning må være så lav som mulig for å unngå fototoksisitet og fotobleking som foreslått av flerpunkts scanning konfokalmikroskop tilnærming. I tillegg, temperatur og CO 2 er viktige miljøparametre siden ustabilitet kan påvirke neuronal migrasjon. For å lette og forbedre de eksperimentelle prosedyrer, har vi utviklet en konfokal macroscopy protokoll som begrenser slice bevegelser, sikrer konstant miljøparametere, reduserer fotobleking, øker synsfeltet (i størrelsesorden millimeter) og consequently antall celler (flere titalls) som kan spores ved bildeanalyse. Således 180 um tykke skiver er dyrket på membraninnsatser, og 6-brønns plater er direkte overført under en 2X motorisert formål med en kommersiell konfokalt macroscope utstyrt med et stort inkubering kammer, temperatur og CO 2 kontrollere og en vibrasjonskontroll-system. Time-blundere og z-stabler blir deretter utført over flere timer og farmakologiske verktøy eller bioaktive molekyler kan legges til eller leveres i inkubasjonsmediet. Denne metoden kan også bli tilpasset for å studere migrering av de andre typer av nevroner i lillehjernen eller cerebrum på forskjellige utviklingsstadier.
Protocol
Dyr (mannlig eller kvinnelig Wistarrotter) ble født og oppvokst i et akkreditert Dyreavdelingen (godkjenning B.76-451-04), ifølge den franske guiden for omsorg og bruk av forsøksdyr. Forsøkene ble utført under oppsyn av autorisert etterforskere (MB, DV og LG) i henhold til EU direktiv (2010/63 / UE av 22 september 2010) og den franske Landbruksdepartementet.
1. Utarbeidelse av Media og verktøy
- I et biologisk trygghetskabinett, forberede 1x Hanks BSS (HBSS) i sterilt vann fra 10X lagerløsning inneholdende CaCl2 (1,85 g / l) / MgSO4 (0,9767 g / l) uten MgCl2. Legg NaHCO3 (350 ug / ml) til 1 x oppløsning av HBSS.
- I et biologisk trygghetskabinett, tilsett N2 supplement (fra en 100X stamløsning) og penicillin (100 enheter / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) løsning for å Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) næringsstoff blandingture F-12 (1: 1).
- I sterile betingelser, fremstille en delmengde (25 pl, 2 mM) av det cytoplasmatiske fluorescerende fargestoff kalt Cell Tracker Grønn i DMSO (1,075 ml til 1 mg). Fortynn en aliquot i 5 ml DMEM i en 15 ml konisk rør.
- Forbered fylt is-bøtte for å holde media ved 4 ° C.
- Decontaminate laboratorie benk topper og verktøy med 70% etanol.
2. Disseksjon av lillehjernen fra P10 Rats
- Raskt halshogge rotteunger (P10) med buede drifts saks bak ørene for å få i begynnelsen av ryggmargen.
- På baksiden-siden av avkappet hode, gjør midtlinjesnitt av huden fra halsen til nesen med fine iris saks og skille huden fra skallen med fine iris saks og Dumont # 3 tang.
- Bruk tynne iris saks til delikat lage to laterale snitt fra basen til rostralt regionen i skallen. Fjern dissekert skallen med to # 3 tang. Løsne BHinn fra en hvilken som helst tilslutning til kraniet ved hjelp av de samme tang.
- Overfør skjeen hjernen med enden av en spatel for å petriskål (diameter 35 mm) inneholdende 2 ml iskald HBSS medium.
- Sett petriskål inneholder hjernen i en større petriskål (Ø 100 mm) full av is og overføring til det stadiet av stereomikroskopet.
- Under en stereomikroskop, isolere lillehjernen fra hjernen ved dilaceration bruke to # 3 tang. Tilsvarende fjerne restryggmargen og pial-membran.
- Overfør lillehjernen i en ny HBSS fylt petriskål (diameter 35 mm, 2 ml) sammen med skjeen enden av en spatel og hold på is.
3. Utarbeidelse av akutt lillehjernen Slices
- Under stereomikroskop, kuttet cerebellum mellom vermis og høyre hemisfære som indikert ved de to hoder pil i figur 2A med en standard skalpell håndtak # 3 # faststoff og en 15 kirurgisk kniv.
- Sett en dråpe cyanoacrylate lim på vibratome prøveplaten og vente 15-25 sek for å eliminere giftige damp.
- Samle kuttet lillehjernen med skjeen slutten av en slikkepott og fjerne overflødig HBSS med rene papirhåndklær.
- Ta med lillehjernen nær prøveplaten. Fest klippekanten til prøveplaten og vent 10 sek.
- Sett inn prøveplaten inn i bufferbrettet med manipulator, og roter det slik at tverrakse av lillehjernen er vinkelrett på knivholderen. Fest prøveplaten med en umbrakonøkkel og fyll forsiktig bufferbrettet med HBSS medium til lillehjernen er dekket.
- Last knust is i kjølebadet.
- Rengjør kniv tre ganger med 70% etanol for å eliminere eventuelle olje.
- Sett bladet inn i knivholderen og fest med klemskruen.
- Plasser bladkanten rett bak den bakre kant (fra brukerens syn) av prøven, og definere det som utgangspunkt. Bruk frem kommandoen til å definere tHan sluttpunkt etter den fremre kanten av prøven.
- Velg seksjonering hastighet på 2,5 og seksjonering frekvens på 8. Velg trimmetykkelse på 180 mikrometer. Begynn vev seksjonering.
- Plukk opp hver del ved hjelp av en vid boring glass avkortet Pasteur pipette og overfør til HBSS holdig petriskål (Ø 35 mm) holdt på is.
- Ved hjelp av to # 5 tang, fjerne hjernehinnene nøye fra lillehjernen når forstyrrer bladet. Samle maksimalt 5 skiver per cerebellum (figur 2B, C).
- Fjern hjernehinnene fra lillehjernen skiver nøye med to # 5 tang under stereomikroskop og skille lobules forsiktig for bedre sonde lasting.
4. Fluorescent Farging av levende interneuroner
- Overfør lillehjernen skiver med et bredt-boring glass avkortet Pasteur pipette til en 6-brønns plate (maks 3 skiver / per brønn). Aspirer HBSS medium.
- Inkuber skiver (3 max) i 5 ml loading løsning av det fluorescerende fargestoff (10 uM).
- For å beskytte mot lys, dekke mikro med aluminiumsfolie. Sette den på et bord gyro-bevegelse ved 35 rpm i 10 minutter ved romtemperatur for å lette cellemerking.
- Overfør stykker på membranen av en Transwell innsats (3,0 um porestørrelse, figur 2D) med en vid boring glass avkortet Pasteur pipette. Aspirer lasting medium med pipette.
- Ta ut innsatsen og fylle brønnen med 1,9 ml DMEM. Innsetting og tilsett 100 mL av DMEM på toppen av stykket for å dekke vev.
- Sett platen som inneholder dyrkningsinnsatser i inkubatoren kammer (37 ° C, 5% CO2) i 2 timer som er tilstrekkelig til å observere GCer i ML. Ligg vev flate å tillate vedlegg på innsatsen membran (Figur 2E). Pass på at skivene ikke er tørking.
5. Ex vivo Imaging Gjennom Confocal Macroscopy
- Overfører platene utenplastlokk til en kuvøse festet til stativet av en konfokal macroscope. Plasser et glassdeksel på plate vedlegget til macroscope. Holde temperaturen i kammeret ved 37,0 ° C ± 0,5 ° C, og forsyne skivene med konstant gasstrøm (95% O 2, 5% CO2) gjennom platen innsatsen for å holde pH konstant. Vent til to ekstra timer før time-lapse eksperiment.
- For å visualisere GC migrasjon i vevssnitt, belyse fremstillingen med en 488 nm bølgelengde lys ved hjelp av en laserdiode ved en konfokal laser scanning macroscope utstyrt med en X2 tørr objektiv (arbeidsavstand: 39 mm, diameter: 58 mm, NA = 0.234) og påvise fluorescensemisjon 500-530 nm.
- Til fint løse bevegelsen av GCer, hente bilder med en ekstra optisk zoom faktor på 1,5 til 2,0. Samle bilder av GNS i et enkelt fokusplanet eller opp til 10 forskjellige fokalplanene langs z-aksen hvert 30 min i opp til 12 timer.
6. Cell Tracking
- For hver gang av filmen, utføre z-stack projeksjon gjennom ECART-type modus i ImageJ. Modulere kontrasten og lysstyrken i de påfølgende bildene for å lette identifikasjon og sporing av merket GCer. Kart manuelt hver posisjon på referanse snapshot (ved t = 0).
- Bruk "Manuell tracking" plugin i Analyse Particle Meny og avgjøre ved å klikke på tyngdepunktet i hver celle kroppen under time-lapse. Eksportere rå sporingsdata i et regneark.
- Reorganisere de eksporterte rå sporingsdata fra ImageJ med en smart hjemmelaget program (http://primacen.fr skrevet i PHP-kode) som identifiserer hver celle og tilhørende stillinger. Ved hjelp av programmet, calculate total distanse og gjennomsnittlig hastighet på migrasjon for hver celle. Klassifisere og sammenligne kjennetegn ved cellemigrasjon i kontroll- og behandlingsforhold under egnede filtre som bruker det samme programmet.
Representative Results
I den tidlige postnatal cerebellum, gcs oppvise vesentlige endringer i sin modus og hastigheten på migrasjonen som de krysser andre kortikale lag 1 (figur 1). Denne seksjonen viser eksempler på resultater som kan oppnås ved å studere GC migrasjon i sitt naturlige cellemiljøet. P10 rotte cerebellar vevssnitt merket med en grønn fluorescerende fargestoff blir undersøkt under en konfokal macroscope (figur 3A), og vi vise at GCer vandrer radialt i ml med en gjennomsnittlig hastighet på 18 um / time (figur 3B, C). Til dags dato, rollen av interaksjoner / kommunikasjon mellom neuronale og gliale celler, inkludert de regulatoriske faktorer og molekylære mekanismer som er involvert i kontrollen av cellemigrering i hvert kortikalt lag er stort sett ukjent. Derfor er den viktigste saken for å identifisere nevropeptider, nevrotransmittere, neurotrofiner og ekstracellulære matrise komponenter som kan spille en rolle i disse kortikalsjiktet spesifikkeFIC endringer av hastigheten i løpet av oppholdet migrasjonsprosessen. Hypofyse adenylat cyclase-aktiverende polypeptid (PACAP) blir detektert hovedsakelig i PCL, men også i den ML og IGL løpet av de to første ukene etter fødselen hos gnagere 7,10,11. Anvendelse av PACAP38 (10 -6 M) til kulturmediet resulterte i en 79% reduksjon av den hastighet GC i den ML. For eksempel, den migreringshastighet av GCer i ML falt fra 11,9 um / time i kontroll forhold til 2,5 um / time etter administrering av PACAP38 (figur 4A). Vevstype-plasminogen-aktivator (tPA) er et medlem av den proteolytiske kaskade som fører til degradering av den ekstracellulære matriks (EM) komponenter som celleadhesjonsmolekyler eller laminin 12,13. tPA og plasminogen, et substrat av tPA, blir detektert i kortikale lag under utviklingen av postnatal cerebellum 14,15,16. Administrasjon av PAI-1 (10 -7 M), en hemmer av endogen tPA, redusert med 78% GCmigrasjon i ML. For eksempel reduseres GCer migrering hastigheten i ML fra 19,2 um / time i kontroll forhold til 4,2 um / time etter tilsetning av PAI-1 (figur 4B). Disse resultatene indikerer at PACAP utøver en direkte inhibitorisk virkning på GC-bevegelser, og at serinprotease tPA letter migreringen av GCer i ml av utviklings rotte cerebellum.
Figur 1: 3D-representasjon av GC migrasjon i barsellillehjernen cortex. 1-4, Utvidelse av GC prosesser og tangential migrasjon i EGL. 5, Radial migrasjon i ML sammen Bergmann gliale fibre. 6, Transient stasjonær fase i PCL. 7, Glial uavhengig radial migrasjon i IGL. 8, Ferdigstillelse av GC migrasjon i IGL GC, granule celle, i rødt;. EGL, Ekstern kornete lag, B, Bergmann gliaceller, i mørk lilla, G, Golgi celle, i gult, jf, klatring fiber, i blått, g, postmigratory granule celler, i lys grønn, IGL, intern granulære lag, MFT, mosegrodd fiber terminal, i mørk grønn, ML, molekylær lag; P, Purkinje celle, i lys lilla, PCL, Purkinje celle laget. Dette tallet har blitt forandret fra 5.
Figur 2: Ex vivo kultur P10 lillehjernen skiver (A) dissekert cerebellum fra P10 rotte.. Scale bar = 6 mm. (B) Micrograph leve 180 mikrometer tykt cerebellar skive gjennom stereomikros. Scale bar = 3 mm. (C) Påen høyere forstørrelse, de fire kortikale lag (EGL, ML, PCL, IGL) av lillehjernen er allerede synlig. Scale bar = 1 mm. (D) Etter fluorescerende merking, blir vevssnitt plassert på dyrkningsinnsatser (24 mm diameter) inn i en 6-brønns plate. (E) Skjematisk fremstilling av en kultur innsats med vev kultur behandlet polyester membran. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Dynamisk migrasjon av GCer i kortikale lag av rotte P10 lillehjernen (A) Macroconfocal view (xyz, 2D-projeksjon) av en P10 rotte lillehjernen skive der GCer er merket med en grønn cytoplasmic fluorescerende fargestoff.. Scale bar = 75 mikrometer. (B) Time-lapse avbildning viser GCbevegelser i ML av konfokal macroscopy for fire timer i kontroll forhold. Stjerne (*) symbol markerer GC soma. Medgått tid (i minutter) er angitt på bunnen av hver fotomikrografi. Scale bar = 10 mikrometer. (C) sekvensiell endringer i avstanden som GC soma.
Fig. 4: Virkning av neuropeptid og protease inhibitor av GC migrasjon (A) GC ble sporet i den ML ved konfokal macroscopy i 2 timer i kontrollbetingelser, og deretter i 2 timer i nærvær av hypofyse adenylat cyclase-aktiverende polypeptid (PACAP). (B) GC ble sporet i den ML ved konfokal macroscopy i 2 timer i kontrollbetingelser, og deretter i 2 timer i nærvær av plasminogen aktivator inhibitor-1 (PAI-1).
Discussion
Denne protokollen beskriver kulturen i akutte P10 rotte lillehjernen skiver i Transwell systemet og fluorescerende merking av GC med en grønn fluorescerende fargestoff for å studere celle migrasjon under postnatal utvikling gjennom konfokal macroscopy. Denne protokollen tillater observasjon av cellemigrering i en periode opp til 12 timer og testing av de mulige roller regulerende faktorer i migrasjons inkludert agonister eller antagonister av neuropeptider, enzyminhibitorer, cellesignalisering modulatorer eller giftige stoffer under forsøket. Et lite hull i membranen innsatsen med en pipettespiss er nødvendig for å lette administrasjonen av forbindelsene i inkubasjonsmediet. En hjemmelaget buet spiss pipette kan brukes til å legge til rette for levering av løsningen.
Ett problem av cellemigrering studier på levende vev skiver er at bevegelsene av vevet selv kan gjøre cellen sporing vanskelig. Mens tidligere tilnærminger har foreslått å forsiktig stabil SLIces med en nylon-nett eller et tynt lag av rottehalecollagen 7,17, en viktig fordel med denne teknologien er den enkle og direkte overføring av en 6-brønners plate inneholdende kultur cerebellare stykker på membran innsatser fra CO2-inkubator under målet av en confocal macroscope. Integrert temperatur og CO 2 kontrollere også gi riktige og konstant miljøparametre viktige for cellemigrasjon 9. Derfor er dyrkningsbetingelsene holdes under observasjoner og vev bevegelser er minimalisert siden skiver er godt festet til membranen innsatsen. Stabilisering av vevet er bekreftet ved å følge posisjonen til skive kanter eller Purkinje celler som bør faste referanser under oppkjøpet. I tillegg kan cerebellare skiver (mellom 12 og 18) fordelt i seks brønner i platen raskt kan observeres i detalj med en motorisert trinn og en optisk zoom. På grunn av den store rekkevidde (X2, 39 mm) av den tørre objektiv, epi-observation er fri for nedsenking og administrering av forbindelser i dyrkningsmediet er mye enklere. Derfor macroscopy miljøparametre og støtte kultur likheter i CO 2 inkubator og confocal føre til maksimal bevaring av biologisk prøve.
En annen fordel med protokollen er stort synsfelt og dermed det store antall celler som kan observeres samtidig. For eksempel har vi tidligere bestemt at tettheten av fluorescerende GCer med radial migrasjon i ML var 1124 ± 138 celle / mm 2 18. Confocal macroscopy (X2, NA = 0,234) har en lavere lateral oppløsning sammenlignet med konfokalmikroskopi (40X, NA = 1,25), men celle organer GCer lett kan spores og den gjennomsnittlige hastigheten på overføringen er sammenlignbare mellom de to teknologiske tilnærminger 7,18 .
Foruten tekniske forbedringer for bilde oppkjøp, kvaliteten på vevssnitt og the kvaliteten på merking er viktige punkter for vellykket forsøk. Hold alltid media og vev på is under disseksjon prosesser, eliminere olje på vibratome blader og ikke bruke skiver av vev i kontakt med lim. Sagittal og tverrgående partier er tilpasset for radial og tangential migrasjon hhv. Bruk forskjellige lengder av inkubasjon for aktuelle påvisning i de ulike kortikale lag av lillehjernen. Lange inkubasjonstider (opp til 8 timer) er nødvendig for å avdekke migrasjon av tallrike GCer i PCL og IGL. Siden GC migrasjon er en fysiologisk prosess under bestemte rom-tid-vinduer, er den positive kontrollen som cellene har til å migrere på riktig måte. Spesielt tallrike spindelen GC i den ML er en av de viktigste helseindikatoren for sagittale cerebellare skiver. For å starte eksperimenter, er observasjon av GC bevegelser i ML foreslått. Faktisk bør form av GC med vertikalt langstrakt cellelegemet betraktes som et referansepunkt for å begynne acovertakelsen med suksessiv styring (2 timer) og behandling (2 timer) perioder som enkelt kan utføres i ML.
Fluorescerende fargestoffer som Cell Tracker familie eller fluorescerende proteiner uttrykt gjennom genetiske konstruksjoner kan benyttes som markører for celle migrasjon studier. På grunn av den langsomme kinetikk av GC migrasjon (1 stabelen hvert 30 min), kan flerfarget eksperimenter også utføres i sekvensiell modus siden 4 lasere bjelker (405, 488, 532 og 633 nm) er tilgjengelig på systemet. Vurderer sentripetal og sentrifugal radial migrasjon, sporing av andre interneuroner kan også realiseres 18. Spesielt kan mindre tallrike celletyper vil lettere kunne lokaliseres med et stort synsfelt. Endelig kan denne protokollen brukes til å studere cellemigrering på andre stadier av cerebellar utvikling, men også andre hjerneområder.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Institutt for forskning og nyskaping i biomedisin (IRIB), Cell Imaging Platform of Normandie (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, Universitetet i Rouen, European Regional Development Fund (ERDF - PeReNE, Interreg 4A), den LARC-Neurosciences Network og regionen Haute-Normandie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| Hank's balanced salt solution 10x | Sigma-Aldrich | H1641 | |
| PACAP38 | INRS, Canada | Bourgault et al., 200919 | |
| PAI-1 | Calbiochem | 528208 | |
| N-2 supplement | Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen | O973 | |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | ||
| Cell Tracker Green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Polyester Transwell-Clear inserts | Corning | 3452 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| 6-well cell culture cluster | Corning | 3516 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Tissue culture dish 35 mm diameter | BD Falcon | 353004 | |
| Tissue culture dish 100 mm diameter | Thermo SCIENTIFIC | 130182 | |
| Polypropylen tube (15 ml) | BD Falcon | 352096 | |
| Ethanol 70% | Fisher Chemical | E/0800DF/21 | |
| Biological safety cabinet fume hood | Thermo Scientific | MSC9 Class II A2 | |
| Adjustable-volume pipette (0.5-10 µL) | Eppendorf | 4910 000.018 | |
| Gyro-rocker, SSL3 | Stuart | ||
| CO2 incubator, Hera Cell 150 | Thermo Scientific | ||
| Vibrating blade microtome, VT1000S | Leica Microsystems | ||
| Confocal macroscope, TCS LSI | Leica Microsystems | ||
| Temperature controller | PeCon | ||
| CO2-controller | PeCon | ||
| Stereomicroscope, M205 C | Leica Microsystems | ||
| Operating scissors, curved, blunt/blunt | Medicon | 03.03.17 | |
| Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp | FST | 149090-11 | |
| Dumont #3 and #5 forceps | FST | 11293-00 and 11252-20 | |
| Vibratome injector blades/single edge | Leica Microsystems | 39053250 | |
| Standard scalpel handle #3 solid | FST | 10003-12 | |
| Surgical blade #15 | Swann-Morton | 205 |
References
- Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H.
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton, FL. (1997).
- Komuro, H., Rakic, P. Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex. Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).
- Komuro, H., Yacubova, E. Recent advances in cerebellar granule cell migration. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).
- Fahrion, J. K., et al. Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).
- Raoult, E., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).
- Cameron, D. B., et al. Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).
- Renaud, J., et al. Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells. Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).
- Komuro, H., Rakic, P. Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations. Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).
- Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex. Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).
- Hannibal, J. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).
- Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones. Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).
- Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration. Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).
- Friedman, G. C., Seeds, N. W. Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum. Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).
- Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding. Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).
- Basham, M. E., Seeds, N. W. Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain. Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).
- Bourgault, S., et al. Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor. Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).
