Abstract
Under postnatal udvikling, umodne granulerede celler (excitatoriske interneuroner) udviser tangential migration i den eksterne granulære lag og derefter radial migration i den molekylære lag og purkinjecelle lag for at nå det indre granulære lag af cerebellum cortex. Standard i vandrende processer inducerer enten celledød eller fejlplacering af neuroner, hvilket fører til underskud i diverse cerebellare funktioner. Centripetal granula celle migration involverer flere mekanismer, såsom kemotaksi og ekstracellulære matrix nedbrydning, til at vejlede cellerne til deres endelige position, men de faktorer, der regulerer celle migration i hvert kortikale lag kun delvist kendt. I vores fremgangsmåde, er akutte cerebellare skiver fremstillet ud fra P10 rotter, er granulerede celler mærket med et fluorescerende cytoplasmatisk markør og væv dyrkes på membran inserts mellem 4 og 10 timer før start realtidsovervågning af cellemigration ved konfokal makroskopi ved 37 ° C itilstedeværelse af CO2. Under deres vandring i de forskellige kortikale lag af cerebellum, kan granulerede celler udsættes for neuropeptid agonister eller antagonister, proteaseinhibitorer, blokkere af intracellulære effektorer eller endog giftige stoffer, såsom alkohol eller methylkviksølv at undersøge deres mulige rolle i reguleringen af neuronal migration .
Introduction
I det udviklende cerebellum, er otte forskellige typer af neuroner fremstillet sekventielt mellem den anden embryonale uge og den anden postnatale uge i gnavere 1. Oprindelse indledningsvis fra et primært germinale zone, umodne granuleceller (GC) er de sidste neuroner, der skal produceres fra den eksterne granulære lag (EGL), en sekundær germinale zone 2. I de første tre postnatale uger, den cerebellare cortex er en folieret struktur organiseret i fire lag, herunder EGL, den molekylære lag (ML), den purkinjecelle lag (PCL) og den interne granulære lag (IGL) (figur 1). Gennem centripetal migration, umodne GC'er, glutamaterge interneuroner, nå IGL indenfor ca. 2 dage. Med det tredje postnatal uge, EGL forsvinder, og IGL udgør, hvad der kaldes det granulære lag (GR) i den voksne cerebellum. I GL, GC'er modtage stimulerende synaptiske input fra Mossy fibre og unipolære børste celler, oghæmmende synaptiske input fra Golgi celle axoner. I ML, GC axoner gøre excitatoriske synapser med GABAerge neuroner herunder Purkinje celler, kurv celler, stjerneformige celler og Golgi-celler 2.
Real-time observation af celle bevægelse i akutte cerebellare skiver opnået fra tidlige postnatale gnavere viser, at GC'er ændre deres form samtidig med ændringer i modalitet og hastigheden af migration under deres rute i cerebellare cortex 3. Under de første to uger postnatal, GC forstadier formere aktivt i toppen af EGL. I den midterste del af EGL, postmitotiske GC'er migrere tangentialt i retning af deres større proces. Hos EGL-ML grænsen, GC'er langsom deres bevægelse, begynder cellerne at indtaste en kort lodret nedadgående proces i ML. I ML, GC'er har et vertikalt langstrakt celle krop, en tynd afsluttende proces og en mere voluminøs førende proces, og migrere radialt langs Bergmann gliafibrer. IPCL, GC'er stoppe deres bevægelse, men efter en længere stationær fase (2 timer), de krydser PCL-IGL grænse. I IGL, GC'er migrere mod bunden af laget i fravær af glial fiber support. Når spidsen af den førende proces nærmer IGL-hvide substans (WM) grænse, GC'er langsomt og stoppe deres bevægelse. Tværsnit af lillehjernen foretrækkes til migration undersøgelser tangential i EGL, mens sagittale skiver er dedikeret til radiale migration i ML, PCL og IGL. Nogle regulatoriske faktorer af GC bevægelser, herunder neuropeptider (f.eks somatostatin, PACAP) er blevet identificeret hidtil, men de fuldstændige mekanismer involveret i spatio-temporale kontrol af GC migration i hvert kortikale lag er stadig stort set ukendt 1,4,5,6.
GC migration er blevet undersøgt i løbet af de sidste 20 år gennem video- og konfokal mikroskopi ved hjælp af enten transmitteret lys belysning til isolerede dyrkede celler eller fluorescensdetektion til acute cerebellare skiver. I første omgang lipofile Dii, og senest "Cell Tracker" farvestoffer og celle-udtrykte fluorescerende proteiner blev anvendt til konfokal eller to-foton mikroskopi 7,8. Succesfulde forsøg afhænger af en række specifikke procedurer, der gør protokollen enkel, men ikke let. Navnlig akutte skiver skal stabiliseres under observationer generelt med en hjemmelavet nylon mesh netværk 9. Intensiteten af lys belysning skal være så lav som muligt for at undgå fototoksicitet og fotoblegning som foreslået af multipunkt konfokalt tilgang. Desuden, temperatur og CO 2 er centrale miljøparametre siden ustabilitet kan påvirke neuronal migration. For at lette og forbedre de eksperimentelle procedurer, har vi udviklet et konfokalt makroskopi protokol, der begrænser slice bevægelser, sikrer konstant miljøparametre, reducerer fotoblegning, øger synsfelt (i størrelsesordenen millimeter) og consequladende antallet af celler (snesevis), der kan spores gennem billedanalyse. Således 180 um tykke skiver dyrkes på membran skær, og 6-brønds plader overføres direkte under en 2X motoriseret mål for en kommerciel konfokal makroskop udstyret med en stor inkubation kammer, temperatur og CO 2 controllere og en vibration kontrolsystem. Time-bortfalder og z-stakke udføres derefter over flere timer og farmakologiske værktøjer eller bioaktive molekyler kan tilføjes eller leveres i inkubationsmediet. Denne metode kunne også tilpasses til at studere migrationen af de andre typer af neuroner i cerebellum eller cerebrum på forskellige udviklingsstadier.
Protocol
Dyr (mandlige eller kvindelige Wistar rotter) er født og opdrættet i et akkrediteret dyr facilitet (godkendelse B.76-451-04), ifølge den franske guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Eksperimenter blev udført under tilsyn af autoriserede efterforskere (MB, DV og LG) i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskab Rådets direktiv (2010/63 / UE af 22 September, 2010), og det franske landbrugsministerium.
1. Udarbejdelse af Medier og værktøj
- I et biologisk sikkerhedsskab, forberede 1x Hanks BSS (HBSS) i sterilt vand fra 10x stamopløsning indeholdende CaCl2 (1,85 g / l) / MgSO4 (0,9767 g / l) uden MgCl2. Tilføj NaHCO3 (350 ug / ml) til 1x opløsning af HBSS.
- I et biologisk sikkerhedsskab, tilføje N2 supplement (fra en 100x stamopløsning) og penicillin (100 enheder / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) opløsning til Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) næringsstof mixklatur F-12 (1: 1).
- Under sterile forhold, forberede en portion (25 pl, 2 mM), i den cytoplasmiske fluorescerende farvestof kaldet Cell Tracker Green i DMSO (1,075 ml til 1 mg). Fortynd en alikvot i 5 ml DMEM i en 15 ml konisk rør.
- Forbered fyldte is-spand til at holde mediet ved 4 ° C.
- Dekontaminér laboratorium bænk toppe og værktøjer med 70% ethanol.
2. Dissektion af lillehjernen fra P10 Rats
- Hurtigt halshugge rotteunger (P10) med krumme drifts- saks bag ørerne for at få begyndelsen af rygmarven.
- På bagsiden af afhugget hovedet, gør midtlinie incision af huden fra halsen til næsen med fine iris saks og adskille huden fra kraniet med fine iris saks og Dumont # 3 pincet.
- Anvendes der fine iris saks til fint gøre to laterale indsnit fra basen til rostrale region af kraniet. Fjern det dissekerede kraniet med to # 3 pincet. Tag bhlangs enhver adhærens med kraniet anvendelse af de samme pincet.
- Overfør hjernen med skeen enden af en spatel til petriskål (Ø 35 mm) indeholdende 2 ml iskold HBSS medium.
- Sæt petriskålen indeholder hjernen i en større petriskål (Ø 100 mm) fyldt med is og overførsel til den fase af stereomikroskop.
- Under et stereomikroskop, isolere lillehjernen fra hjernen ved dilaceration hjælp af to # 3 pincet. Tilsvarende fjernes den resterende rygmarv og pial-membran.
- Overfør cerebellum i en ny HBSS fyldt petriskål (Ø 35 mm, 2 ml) med skeen enden af en spatel og holde på is.
3. Forberedelse af akut cerebellare Skiver
- Under stereomikroskop, skæres lillehjernen mellem vermis og højre hjernehalvdel som angivet ved de to hoveder pil i figur 2A med en standard skalpel håndtag # 3 fast og en # 15 kirurgisk kniv.
- Put en dråbe cyanoacrylate lim på vibratome prøven disken og vente 15-25 sek at fjerne giftige dampe.
- Opsamler det afskårne cerebellum med skeen enden af en spatel og fjerne overskydende HBSS med rene papirhåndklæder.
- Bringe lillehjernen tæt på objektpladen. Fastgør den afskårne kant til modellen disken og vente 10 sek.
- Indsæt objektpladen i bufferen magasinet med manipulatoren, og drej den så den tværgående akse cerebellum er vinkelret på knivholderen. Fastgør prøven disken med en unbrakonøgle og fylde forsigtigt buffer bakke med HBSS medium, indtil lillehjernen er dækket.
- Belastning knust is i kølebadet.
- Rens bladet tre gange med 70% ethanol for at fjerne olie.
- Sæt klingen i knivholder og sikkert med låseskrue.
- Placer bladet kant højre bag den bageste kant (fra brugerens synspunkt) af prøven og definere den som et udgangspunkt. Brug frem kommando til at definere than slutpunkt efter den forreste kant af prøven.
- Vælg sektionering hastighed på 2,5 og sektionering frekvens 8. Vælg trimning tykkelse på 180 um. Start væv sektionering.
- Pick up hver sektion hjælp af en bred-boring glas afkortet Pasteur pipette og overførsel til HBSS-holdige petriskål (Ø 35 mm) holdes på is.
- Ved hjælp af to # 5 pincet, fjern meninges grundigt lillehjernen når at blande sig med bladet. Saml højst 5 skiver pr cerebellum (figur 2B, C).
- Fjern meninges fra cerebellare skiver forsigtigt med to # 5 pincet under stereomikroskop og adskille lobuli forsigtigt i bedre sonde lastning.
4. Fluorescent Farvning af Leve- interneuroner
- Overfør cerebellare skiver med en stor indvendig diameter glas trunkeret Pasteur-pipette til en 6-brønds plade (max 3 skiver / per brønd). Aspirere HBSS medium.
- Inkuber skiver (3 max) i 5 ml loading opløsning af det fluorescerende farvestof (10 uM).
- At beskytte mod lys, dække mikropladen med alufolie. Sæt det på en gyro-bevægende bord ved 35 rpm i 10 min ved stuetemperatur for at lette cellemærkning.
- Overfør skiver på membranen af en Transwell indsætte (3,0 um porestørrelse; figur 2D) med vid boring glas trunkeret Pasteur-pipette. Aspirer loading medium med pipette.
- Fjern indsatsen og fylde godt med 1,9 ml DMEM. Isætning og tilsæt 100 pi DMEM oven på udsnittet at dække vævet.
- Pladen indeholder kultur indsætter i inkubatoren kammer (37 ° C, 5% CO2) i 2 timer, hvilket er tilstrækkeligt til at observere GC'er i ML. Lie væv flad for at tillade fastgørelse på indsatsen membran (Figur 2E). Sørg for, at skiverne ikke er tørring.
5. Ex vivo billeddannelse gennem Konfokal makroskopi
- Overføre pladen udenplastlåg i en inkubator fastgjort til stativet af et konfokalt makroskop. Placer et glas dækning på pladen insert af makroskop. Holde temperaturen af kammeret ved 37,0 ° C ± 0,5 ° C, og leverer skiverne med konstant gasstrøm (95% O2, 5% CO2) gennem pladen indsatsen for at holde pH konstant. Vent til 2 ekstra timer før time-lapse eksperiment.
- At visualisere GC migration i vævssnit, belyse forberedelse med en 488 nm bølgelængde lys ved hjælp af en laser diode gennem en konfokal laser scanning makroskop udstyret med en X2 tør målsætning (arbejder afstand: 39 mm, diameter: 58 mm, NA = 0,234), og detektere fluorescensemission 500-530 nm.
- Til fint løse bevægelse GC'er erhverve billeder med en ekstra optisk zoom faktor på 1,5 til 2,0. Indsamle billeder af GNs i et enkelt brændplanet eller op til 10 forskellige fokale planer langs z-aksen hver 30 min i op til 12 timer.
6. Cell Tracking
- For hver gang af filmen, udføre z-stak projektion gennem Ecart-typen mode i ImageJ. Modulere kontrast og lysstyrke niveauer af de successive billeder for at lette identifikationen og sporingen af mærkede GC'er. Kort manuelt hver position på henvisningen snapshot (ved t = 0).
- Brug "Manuel sporing" plugin i Analyse Particle Menu og bestemme ved at klikke på tyngdekraften punkt i hver celle kroppen under time-lapse. Eksportere de rå sporingsdata i et regneark.
- Reorganisere de eksporterede rå sporing data fra ImageJ med en smart hjemmelavet program (http://primacen.fr, skrevet i PHP-kode), der identificerer hver celle og tilhørende positioner. Ved hjælp af programmet, calculate den samlede tilbagelagte afstand og den gennemsnitlige hastighed på migration for hver celle. Klassificere og sammenligne karakteristika for celle migration i kontrol- og behandlingsgruppen betingelser passende filtre ved hjælp af samme program.
Representative Results
I begyndelsen af postnatal lillehjernen, GC'er udviser væsentlige ændringer i deres tilstand og hastighed migration som de krydser forskellige kortikale lag 1 (figur 1). Dette afsnit viser eksempler på resultater, der kan opnås ved at studere GC migration i deres naturlige cellulære miljø. P10 rotte cerebellar vævssnit mærket med et grønt fluorescerende farvestof undersøges under et konfokalt makroskop (figur 3A) og vi vise, at GC'ers migrere radialt i ML med en gennemsnitshastighed på 18 um / time (figur 3B, C). Til dato, rolle interaktioner / kommunikation mellem neuronale og gliale celler, herunder de regulerende faktorer og molekylære mekanismer, der er involveret i kontrollen af cellemigrering i hvert kortikale lag er stort set ukendte. Derfor det vigtigste spørgsmål er at identificere neuropeptider, neurotransmittere, neurotrophiner og ekstracellulære matrix komponenter, der kunne spille en rolle i disse kortikale lag-speciFIC ændringer af hastigheden under deres migration proces. Hypofyse adenylatcyklase-aktiverende polypeptid (PACAP) detekteres hovedsageligt i PCL, men også i ML og IGL løbet af de første to uger i postnatale gnavere 7,10,11. Anvendelse af PACAP38 (10 -6 M) til dyrkningsmediet resulterede i en speed formindskelse af GC i ML 79%. For eksempel migration hastighed GC'er i ML faldt fra 11,9 um / time hos kontrolbetingelser til 2,5 um / time efter administration af PACAP38 (figur 4A). Vævstype-plasminogenaktivator (tPA) er et medlem af den proteolytiske kaskade, der fører til nedbrydning af den ekstracellulære matrix (EM) komponenter såsom celleadhæsionsmolekyler eller laminin 12,13. tPA og plasminogen, et substrat af tPA, detekteres i kortikale lag under udviklingen af postnatal cerebellum 14,15,16. Indgivelse af PAI-1 (10 -7 M), en inhibitor af endogent tPA, nedsat med 78% GCmigration i ML. F.eks GC'er reducerede migration hastighed i ML fra 19,2 um / time hos kontrolbetingelser til 4,2 um / time efter tilsætning af PAI-1 (figur 4B). Disse resultater indikerer, at PACAP udøver en direkte inhiberende virkning på GC-bevægelser, og at serinprotease tPA letter migreringen af GC'er i ML af udviklingen i rottecerebellum.
Figur 1: 3D repræsentation af GC migration i postnatal cerebellare cortex. 1-4, Udvidelse af GC processer og tangential migration i EGL. 5, Radial migration i ML langs Bergmann glial fibre. 6, Forbigående stationær fase i PCL. 7, Glial-uafhængig radial migration i IGL. 8, Afslutning GC migration i IGL GC, granulat celle, med rødt;. EGLEkstern kornet lag; B, Bergmann glia, i mørk lilla, G, Golgi celle, i gul, cf, klatring fibre, i blå, g, postmigratory granula celler, i lysegrøn, IGL, intern kornet lag; MFT, mossy fiber terminal, i mørkegrøn, ML, molekylær lag; P, purkinjecelle, i lys lilla, PCL, purkinjecelle lag. Dette tal er blevet ændret fra 5.
Figur 2: Ex vivo-kultur af P10 cerebellare udsnit (A) dissekerede cerebellum fra P10 rotte.. Scale bar = 6 mm. (B) Micrograph leve 180 um tyk cerebellar skive gennem stereomikroskopi. Scale bar = 3 mm. (C) Veden højere forstørrelse, de fire kortikale lag (EGL, ML, PCL, IGL) i cerebellum er allerede skelnes. Målestok = 1 mm. (D) Efter fluorescerende mærkning, er vævssnit anbringes på kultur skær (24 mm diameter) i en 6-brønds plade. (E) Skematisk fremstilling af en kultur indsats med vævskulturbehandlet polyester membran. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dynamisk migration af GC'er i kortikale lag af rotte P10 cerebellum (A) Macroconfocal visning (xyz, 2D projektion) af en P10 rotte cerebellar skive hvor GC'er er mærket med en grøn cytoplasmatisk fluorescerende farvestof.. Scale bar = 75 um. (B) Time-lapse imaging viser GCbevægelser i ml ved konfokal makroskopi i 4 timer i kontrol- forhold. Stjerne (*) symbol markerer GC soma. Forløbet tid (i min) er angivet på bunden af hver mikrofotografi. Scale bar = 10 um. (C) Sekventielle ændringer i den afstand, som GC soma.
Figur 4:. Virkning af neuropeptid og protease inhibitor af GC migration (A) GC blev sporet i ML ved konfokal makroskopi i 2 timer i kontrolbetingelser og derefter i 2 timer i nærvær af hypofyse-adenylatcyklase-aktiverende polypeptid (PACAP). (B) GC blev sporet i ML ved konfokal makroskopi i 2 timer i kontrolbetingelser og derefter i 2 timer i nærværelse af plasminogen aktivator inhibitor-1 (PAI-1).
Discussion
Denne protokol beskriver kultur af akutte P10 rotte cerebellare udsnit i Transwell-systemet og den fluorescerende mærkning af GC med et grønt fluorescerende farvestof for at studere cellemigrering under postnatal udvikling gennem konfokal makroskopi. Denne protokol giver observationer af celle migration i en periode på op til 12 timer og afprøvning af de mulige roller regulering faktorer i migration, herunder agonister eller antagonister af neuropeptider, enzymhæmmere, celle signalering modulatorer eller giftige stoffer i løbet af forsøget. Er nødvendigt med en lille hul i membranen indsatsen med en pipettespids for at lette administrationen af forbindelser i inkubationsmediet. En hjemmelavet buet spids pipette kan bruges til at lette leveringen af løsningen.
Et spørgsmål af cellemigration undersøgelser af levende vævssnit er, at bevægelserne af det væv selv kan gøre celle sporing vanskelig. Mens tidligere tilgange har foreslået til forsigtigt at stabilisere SLIces med et nylonnet eller et tyndt lag af rottehalecollagen 7,17, en stor fordel ved denne teknologi er den enkle og direkte overførsel af en 6-brønds dyrkningsplade, der indeholder cerebellare skiver på membran inserter fra CO2-inkubator under målet af et konfokalt makroskop. Integreret temperatur og CO 2 controllere giver også passende og konstante miljøparametre essentielle for celle migration 9. Derfor er dyrkningsbetingelser holdes under observationer og væv bevægelser er minimeret, da skiver er godt fastgjort til membranen indsatsen. Stabilisering af vævet verificeres ved at følge positionen af slice kanter eller Purkinjeceller, at der fastsættes referencer under købet. Derudover kan cerebellare skiver (mellem 12 og 18), der fordeles i de 6 brønde på pladen hurtigt observeret i detaljer med en motoriseret trin og en optisk zoom. På grund af den store arbejdsafstand (X2, 39 mm) af den tørre objektive, epi-observation er fri for nedsænkning og administration af forbindelser i dyrkningsmediet er meget lettere. Derfor makroskopi miljøparametre og kultur support ligheder i CO2-inkubator og konfokal føre til maksimal bevarelse af den biologiske prøve.
En anden fordel ved protokollen er den store synsfelt og dermed stort antal celler, som kan observeres samtidigt. For eksempel har vi tidligere bestemt, at tætheden af fluorescerende GCS med radial migration i ML var 1124 ± 138 celler / mm 2 18. Konfokal makroskopi (X2, NA = 0,234) har en lavere lateral opløsning sammenlignet med konfokal mikroskopi (40X, NA = 1,25), men celle organer GC'er let kan spores og den gennemsnitlige hastighed på migration er sammenlignelig mellem de to teknologiske tilgange 7,18 .
Udover tekniske forbedringer for tilkøb billede, kvaliteten af vævssnit og the kvaliteten af mærkningen er nøglepunkter for vellykkede eksperimenter. Hold altid medier og væv på is under dissektion processer, fjerne olie på vibratome knivene og ikke udnytter skiver af væv i kontakt med lim. Sagittal og tværgående sektioner er indrettet til radiale og tangentiale migration hhv. Brug forskellige længder af inkubation i passende detektion i de forskellige kortikale lag af cerebellum. Lange inkubationstider (op til 8 timer) er nødvendige for at detektere migration af talrige GC'er i PCL og IGL. Da GC migration er en fysiologisk proces, specifikke spatio-temporale vinduer, den positive kontrol er, at cellerne har til at migrere ordentligt. Især mange spindel GC i ML er en af de vigtigste sundhed indikator for sagittale cerebellare skiver. Til start eksperimenter, er observation af GC bevægelser i ML foreslået. Faktisk bør formen af GC med lodret langstrakt celle krop betragtes som et referencepunkt for at starte actagelsen med successiv kontrol (2 timer) og behandling (2 timer) perioder, der let kan udføres i ML.
Fluorescerende farvestoffer såsom Cell Tracker familie eller fluorescerende proteiner udtrykt gennem genetiske konstruktioner kan anvendes som sporstoffer til undersøgelser celle migration. På grund af de langsomme kinetik for GC migration (1 stack hver 30 min), kan flerfarvet eksperimenter også udføres i sekventielle siden 4 lasere bjælker (405, 488, 532 og 633 nm) er tilgængelig på systemet. I betragtning af centripetal og centrifugal radial migration, sporing af andre interneuroner kan også realiseres 18. Navnlig kan mindre talrige celletyper lettere lokaliseret med et stort synsfelt. Endelig kan denne protokol bruges til at studere celle migration på andre stadier af cerebellar udvikling, men også andre områder i hjernen.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Institut for Forskning og Innovation i biomedicin (IRIB), Cell Imaging Platform af Normandiet (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, University of Rouen, Den Europæiske Fond for Regional Udvikling (EFRU - PeReNE, Interreg 4A), Den LARC-Neurovidenskaber Netværk og Région Haute-Normandie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| Hank's balanced salt solution 10x | Sigma-Aldrich | H1641 | |
| PACAP38 | INRS, Canada | Bourgault et al., 200919 | |
| PAI-1 | Calbiochem | 528208 | |
| N-2 supplement | Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen | O973 | |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | ||
| Cell Tracker Green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Polyester Transwell-Clear inserts | Corning | 3452 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| 6-well cell culture cluster | Corning | 3516 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Tissue culture dish 35 mm diameter | BD Falcon | 353004 | |
| Tissue culture dish 100 mm diameter | Thermo SCIENTIFIC | 130182 | |
| Polypropylen tube (15 ml) | BD Falcon | 352096 | |
| Ethanol 70% | Fisher Chemical | E/0800DF/21 | |
| Biological safety cabinet fume hood | Thermo Scientific | MSC9 Class II A2 | |
| Adjustable-volume pipette (0.5-10 µL) | Eppendorf | 4910 000.018 | |
| Gyro-rocker, SSL3 | Stuart | ||
| CO2 incubator, Hera Cell 150 | Thermo Scientific | ||
| Vibrating blade microtome, VT1000S | Leica Microsystems | ||
| Confocal macroscope, TCS LSI | Leica Microsystems | ||
| Temperature controller | PeCon | ||
| CO2-controller | PeCon | ||
| Stereomicroscope, M205 C | Leica Microsystems | ||
| Operating scissors, curved, blunt/blunt | Medicon | 03.03.17 | |
| Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp | FST | 149090-11 | |
| Dumont #3 and #5 forceps | FST | 11293-00 and 11252-20 | |
| Vibratome injector blades/single edge | Leica Microsystems | 39053250 | |
| Standard scalpel handle #3 solid | FST | 10003-12 | |
| Surgical blade #15 | Swann-Morton | 205 |
References
- Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H.
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton, FL. (1997).
- Komuro, H., Rakic, P. Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex. Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).
- Komuro, H., Yacubova, E. Recent advances in cerebellar granule cell migration. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).
- Fahrion, J. K., et al. Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).
- Raoult, E., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).
- Cameron, D. B., et al. Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).
- Renaud, J., et al. Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells. Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).
- Komuro, H., Rakic, P. Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations. Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).
- Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex. Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).
- Hannibal, J. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).
- Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones. Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).
- Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration. Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).
- Friedman, G. C., Seeds, N. W. Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum. Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).
- Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding. Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).
- Basham, M. E., Seeds, N. W. Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain. Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).
- Bourgault, S., et al. Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor. Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).
