Abstract
وغالبا ما تتم دراسة الخصائص الكهربية للخلايا في المختبر، بعد عدم الربط بينها وبين بيئاتها الأصلية. ومع ذلك، تتطلب دراسة نقل الطاقة الكهربائية بين الخلايا البعيدة في كائن حي في الجسم الحي، والتسجيلات خالية من القطع الأثرية من الخلايا جزءا لا يتجزأ من داخل بيئتهم المحلية. نقل الإشارات الكهربائية من الجرحى إلى المناطق المعافين في مصنع منذ زمن بعيد منزعج من مصلحة علماء النبات. اللحاء، وجزءا حيا من الأوعية الدموية النبات الذي ينتشر في جميع أنحاء المصنع، تم افتراضه بمثابة الأنسجة الرئيسية في نقل الطاقة الكهربائية في محطات. عدم وجود طرق الكهربية مناسبة يطرح العديد من التحديات لدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا اللحاء في الجسم الحي. هنا نقدم نهجا جديدا للالكهربية داخل الخلايا من العناصر غربال (SES) الذي يستخدم المن الحية أو غيرها من الحشرات hemipteran الرضاعة اللحاء ومتكامل في اختراق جرا الكهربائيةالرقم الهيدروجيني (EPG) الدائرة. جعلت براعة، متانة، ودقة هذه الطريقة من الممكن أن يسجل ويدرس في التفاصيل الإشارات الكهربائية الناجم عن جرح في المؤسسات الصغيرة الأوردة المركزية للمصنع نموذج نبات الأرابيدوبسيس thaliana 1. نحن هنا تبين أن EPG-الأقطاب يمكن تنفيذها بسهولة لالتسجيلات الكهربية داخل الخلايا من المؤسسات الصغيرة في الأوردة هامشية، وكذلك لدراسة قدرة المؤسسات الصغيرة على الاستجابة مع إشارات كهربائية لعدة مؤثرات الخارجية. النهج EPG تطبيقها على الخلايا الكهربية من المؤسسات الصغيرة يمكن تنفيذها لمجموعة واسعة من أنواع النباتات، في عدد كبير من مجموعات محطة / الحشرات، ويهدف العديد من البحوث.
Introduction
القدرة على إنتاج الإشارات الكهربائية لمسافات طويلة هي سمة مفيدة من الكائنات متعددة الخلايا التي تسمح للاستجابات فعالة للمؤثرات الخارجية. وقد تطورت هذه الصفة بشكل مستقل في النباتات والحيوانات، وبالتالي يمثل حالة تطور متقاربة. وبالنظر إلى أن الإشارات الكهربائية تقترن مع وظائف هامة في الحيوانات مثل انتقال العصبية وانقباض العضلات، والأساس الجزيئي، وآلية انتقال، وظيفة من الإشارات التي يسببها التحفيز الكهربائية في الحيوانات هي المواضيع من البحث المكثف. في المقابل، تلقت إشارات الكهربائية الناجم عن التحفيز في النباتات الاهتمام القليل من البحث. على الرغم من أن النباتات لديها أي الأعصاب أو العضلات، ويبدو أن هناك أدلة كافية لافتراض أن الإشارات الكهربائية الناجم عن التحفيز في النباتات تلعب دورا رئيسيا في ردودها على العوامل البيئية.
وقد افترض اللحاء، المكون يعيشون في الأوعية الدموية النبات، كبند فرعي رئيسيإستراتيجيات لنقل الإشارات الكهربائية الناجم عن التحفيز، من حفز / تلف إلى مناطق غير حفز / التالفة 2. الخلايا الرئيسية في اللحاء هي العناصر غربال (SES)، وخلايا بسيطة نسبيا، ممدود. ترتبط نهايات المؤسسات الصغيرة مع غيرها من المؤسسات الصغيرة، وتشكيل المستمرة، وانخفاض المقاومة، نظام أنبوب غربال التي تنتشر في جميع أنحاء المصنع. هناك، ومع ذلك، عدد قليل جدا من الدراسات على الخواص الكهربائية من هذه الخلايا المتخصصة للغاية. في هذه الدراسات السابقة، الوصول الباحثين المؤسسات الصغيرة إما الزجاج الصغيرة أقطاب-3 قلم دقيق أو مع أقطاب الزجاج التي كانت إلى جانب لزرع إدراجها من المن، بعد stylectomy (القطع) 4. مصنوعة الميكروية الزجاج من الزجاج الشعيرات الدموية التي يتم سحبها في نهاية واحدة مع الحرارة في تلميح على ما يرام أقل من 1 ميكرون في القطر، وشغل بعد ذلك بمحلول بوكل. ثم تم توصيل حج / أجكل أو البلاتين الأسلاك، وإدراجها في الزجاج الكهربائي بوكل شغل لمدخلات مكبر للصوت، والمرجعيتم إدراج الكهربائي في حمام المحيطة خلية من الاهتمام، واستكمال الدائرة. هذا الإعداد يسجل الفرق في الإمكانيات بين القطب خارج الخلية المرجع والقطب قياس الخلايا، أي إمكانية غشاء الخلية 5. مع هذا الأسلوب، أدلى Umrath أول تسجيل داخل الخلايا من الخلايا النباتية، وذلك باستخدام الطحالب Nitella 6،7. Nitella هو كائن بسيط نسبيا مع الخلايا الكبيرة، وبالتالي قابلة للتجارب الكهربية داخل الخلايا. في المقابل، فإن إدخال أقطاب الزجاج داخل الخلايا إلى خلايا صغيرة من النباتات البرية متعددة الخلايا، ثلاثية الأبعاد يتطلب تقنية عالية، يتطلب الباحث من ذوي المهارات العالية، فضلا عن التصور متطورة، المجهرية، ومعدات مضادة للاهتزاز. على الرغم من أقطاب الزجاج هي مناسبة لتسجيل من الخلايا السطحية في النباتات، مثل خلايا البشرة جذر 8، recordin داخل الخلاياع من الخلايا متأصلة في نسيج النبات، مثل المؤسسات الصغيرة، والسبب ردود الناجم عن الضرر المحتمل جدا، الخلط بين النتائج. في عام 1989، ذكرت فروم وEschrich استخدام طريقة بديلة، ودعا "طريقة أولا بأول"، والتي تقترن أقطاب الزجاج لقلم دقيق المن بعد stylectomy 4. طريقة المن هو الغازية الحد الأدنى، لأن قلم دقيق مرنة لا تسبب الأنسجة أو تلف الخلايا كما تفعل أقطاب الزجاج. قلم دقيق المن هي اختراع طبيعة العظيم لاختراق النبات، والمن هي إلى حد كبير أكثر مهارة من البشر في إيجاد المؤسسات الصغيرة. للأسف، هذا الأسلوب المن هو أيضا تطلبا للغاية من حيث الخبرة والمعدات التقنية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نجاح كل تجربة التي تطبق هذه التقنية تعتمد اعتمادا كليا على المن كونها في وضع التغذية - مع مرود إدراج مستقر إلى SE، في وقت stylectomy. التفكير في بأثر رجعي، يمكن للمرء أن يرى أن احتمالات نجاح هذه التقنية يمكن أن يكون طmproved عن طريق إضافة إلى الإعداد التجريبية أداة تسمح تحديد ما إذا كان أو لم يكن مرود المن هو في SE عند تطبيق stylectomy.
في عام 1964، وصفت ماكلين وكينزي على "نظام المراقبة الإلكترونية" لدراسة سلوك التغذية من المن في الوقت الحقيقي 9،10. في هذا النظام، تم دمج المن والنبات اخترقت مرود في الدائرة الكهربائية. في وقت لاحق، في عام 1978، وضعت Tjallingii نسخة معدلة من النظام، ودعا "الكهربائية الاختراق الرسم البياني" (EPG) نظام 11،12. في حين أن نظام المراقبة الإلكترونية الأصلي حساسية لإمكانات نشأت المقاومة فقط، مع نظام EPG، والقوة الدافعة الكهربائية (EMF) نشأت إمكانات، أي ولدت في المصنع أو في الحشرات، ويمكن أن تسجل بالإضافة إلى الإمكانيات الناشئة عن المقاومة (R) في الحشرات. وهذا يمثل تحسنا هاما، لأن كلا إشارة المكونات، EMF وR،توفير المعلومات البيولوجية ذات الصلة بشأن الأحداث أثناء الإيلاج المصنع من المن. ما يجعل EPG قبل مكبر للصوت حساسية لR-مكونات غير التي منخفضة نسبيا المقاومة مدخلات 1 GΩ، التي هي قريبة من متوسط مقاومة النبات / أولا بأول. A تعويض الجهد الصغيرة (الشكل 1، V) تقريبا +100 يطبق بالسيارات لهذا المصنع، الذي ثم يتم تقسيم عبر نبات وحشرات على جانب واحد، ومقاومة المدخلات من جهة أخرى. يتم قياس الفولتية والتغييرات الخاصة بهم عند نقطة (الشكل 1A، B) بين الحشرة والمقاوم الإدخال. ولذلك، فإن R-مكونات تمثل التحويرات مقاومة النبات أولا بأول من تعويض الجهد، في حين أن للمكونات المجالات الكهرومغناطيسية هي جزء معين من إمكانات المصنع في الطرف مرود والإمكانات تسبب في الحشرات. إمكانات المصنع - الأكثر صلة هنا - هي إمكانات غشاء أساسا من الخلايا النباتية من خلال ثقب قلم دقيق أولا بأول. تظهر إمكانات الحشرات لتكون أساساإمكانات تدفق الناشئة عن حركات السوائل داخل اثنين من القنوات مرود، أي الطعام والقنوات اللعابية. لم يسجل اي الأعصاب أو العضلات الإمكانيات الداخلية في EPG. في الممارسة العملية، وظائف مرود طرف باعتبارها طرف القطب. واتهم كل الخلايا النباتية سلبا داخل نسبة إلى خارج إيجابي للخلية. التيار الكهربائي (أي حركة الأيونات في المحلول المائي) التي تتدفق من الداخل إلى الخارج والعكس بالعكس محدودة جدا بسبب مقاومة عالية من غشاء الخلية. عادة يتم الاحتفاظ إمكانات يستريح المستمر. ومع ذلك، عندما تتحرك الأيونات السالبة خارج أو الأيونات الموجبة تتحرك في خلال غشاء الخلية، يتم تقليل غشاء المحتملة، أي انها depolarizes. يحدث الاستقطاب في حالة من الإثارة الخلية. أيونات ثم الانتقال داخل أو خارج عندما يتم فتح القنوات الأيونية محددة في الغشاء أو عند تلف الغشاء والأيونات تسرب داخل وخارج. جميع الخلايا لها قنوات ومضخات ايون في تيانه البلازما الغشاء الذي جعل غشاء المحتملة إلى مستوى الراحة من خلال إعادة تركيز الأصلي من مختلف الأيونات داخل الخلية. إمكانيات الراحة وتغيراته هي مكونات EMF، وبالتالي، فإن تقنية EPG مناسبة لقياس لهم.
الشكل 1. EPG-الأقطاب. وEPG القطب هو المن المعيشة دمجها في الاجهزة الكهربائية الاختراق الرسم البياني (EPG) الدائرة، التي يتم إدراجها في عنصر غربال (SE) في وضع مستقر التغذية مرود. إذا كان SE-مخوزق مرود هو في بقية (لوحة A)، والجهد في الدائرة، التي سجلتها EPG، مستقر وعلى مستوى المحتملين يستريح (لوحة C، الراحة). إذا كان SE هو متحمس، depolarizes لها غشاء (لوحة B)، التي تصور في EPG كما زيادة تدريجية في الجهد (لوحة C، الاستقطاب). كما التوازن الأيوني في SE يعود للراحة، أي أنها repolarizes، والجهد التي سجلها EPG يتناقص تدريجيا إلى مستوى محتمل بقية (لوحة C، عودة الاستقطاب). في لوحة C، "A" و "B" الرجوع إلى سيناريوهات معروضة في لوحات A و B، على التوالي. V = قابل للتعديل مصدر الجهد الإزاحة. ري = المقاوم الإدخال. بالتوازي مع المقاوم الخارجية 1 GΩ، مكبر للصوت لديه الداخلية (في OPAMP) ارتفاع 1.5 TΩ المقاوم (لوحات A و B، باللون الرمادي). عن طريق التحكم عن بعد للتبديل EPG قبل أمبير يمكن تغيير من الطبيعي أن المجالات الكهرومغناطيسية واسطة، والذي يسمح بالحصول على قيم الجهد دقيقة للغاية. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
في المقطع التالي، ونحن نقدم للقارئ بروتوكول الأساسي لإجراء التجارب EPG صالحة لكلتا الدراستين الحشرات التي تركز والتي تركز على النبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. المن تربية
ملاحظة: إن اختيار الأنواع النباتية والمن للتسجيلات EPG يعتمد على الهدف من البحث. للدراسات على نبات الأرابيدوبسيس thaliana، وbrassicae أولا بأول Brevicoryne المناسب.
- الخلفية B. المن brassicae في دفيئة على الكرنب OLERACEA. الحفاظ على النباتات المستخدمة في تربية المن في أقفاص، وذلك لتجنب تلويث النباتات الأخرى. الحفاظ على النباتات تربية المن والنباتات التجريبية (في حالتنا B. OLERACEA وA. thaliana) في غرف منفصلة، وذلك لتجنب التلوث من محطات تجريبية مع المن.
- نقل المن على نباتات جديدة حول كل 2 أسابيع، قبل مما تسبب في أضرار مصنع كبير، أو الوصول إلى الاكتظاظ السكاني. نقل 10-20 المن الكبار إلى محطة تربية جديدة لبدء مستعمرة جديدة.
- مراقبة تربية النباتات بانتظام للتلوث الأنواع غير المرغوب فيها أولا بأول، الحيوانات العاشبة الحشرات الأخرى، طفيليات المن، وفونغأنا التي قد تؤثر على صحة مستعمرة أولا بأول.
- جمع الكبار، والمن مجنح تصل إلى أسبوع واحد بعد تساقط النهائي لتسجيل EPG.
- بعد التجارب، والعودة النباتات التجريبية التي لم تستخدم في غرفة النمو، لأنها في كثير من الأحيان بعض ذرية التي تم إنتاجها خلال التسجيل، التي يمكن أن تلوث دون قصد غيرها من النباتات.
2. الحشرات الأسلاك للتسجيل EPG
- لجعل أقطاب الحشرات، والحصول على دبابيس موصل النحاس (المسامير، Ø 1.2 ملم)، الأسلاك النحاسية رقيقة (Ø 0.2 ملم)، وأسلاك الذهب رقيقة جدا (Ø كاليفورنيا 20 ميكرون)، المستندة إلى الماء الفضة الغراء، والترباس لحام صغير بسيط مع السوائل لحام ومحفور الراتنج سلك لحام، stereomicroscope مع التكبير 10x، مقص صغير أو مشرط، وهما ملقط غرامة، ورقة الستايروفوم أو مربع. ملاحظة: قد يكون خلاط دوامة مفيدة. ملاحظة: يشار إلى بروتوكول خطوة بخطوة لجعل أقطاب في الشكل 2.
- لالمنالمناولة وتطبيق الغراء، والحصول على: فرشاة الألوان المائية camelhair الصغيرة والناعمة (حجم 2 أو أصغر) ودبابيس الحشرات مثل تلك المستخدمة في مجموعات الحشرات، وعلى الرغم من إبرة الخياطة أو الغرامة، أو مسواك قد تعمل بشكل جيد. الخطوة 4 تظهر كيفية بدء تسجيل EPG.
- الخطوة 1.
ملاحظة: الخطوات 1 و 2 تظهر أدناه كيفية إعداد أقطاب الحشرات ناقص أولا بأول. خطوة 3 تبين كيفية توصيل أولا بأول إلى القطب. ويوصى فراغ التثبيت من المن خلال الأسلاك، ولكن ليس المطلوب دائما لبطء الأنواع المتحركة (على سبيل المثال، B. brassicae).- تشغيل الترباس لحام وتذوب بعض الأسلاك لحام في طرف (الشكل 2A) لها. بلل رأس دبوس موصل النحاس مع بعض السوائل لحام (الشكل 2B) وتراجع عليه في لحام المعادن المذابة (الشكل 2C).
- تطبيق غمد ذاب لحام المعادن على واحدة من نهاية 1-2 سم قطعة طويلة من الأسلاك النحاسية رقيقة (الشكل2D). ثم جعل دبوس والأسلاك النحاسية معا ضد الترباس الساخنة (الشكل 2E) ونقلها معا بعيدا لتبرد ويصلب (الشكل 2F).
- الخطوة 2.
- يهز جيدا (أو دوامة) القارورة مع الفضة الغراء لعدة دقائق حتى يظهر مستحلب ناعم. قطع (مقص أو مشرط) بضع قطع من أسلاك الذهب (حوالي 1.5 سم في الطول) على لوحة الهدف من stereomicroscope (الشكل 2G).
- اتخاذ دبوس النحاس الأصفر مع الأسلاك النحاسية ملحوم (صنع في القسم 2.3) وتراجع نهاية خالية من الأسلاك النحاسية في الفضة صغير الغراء خزان من شأنها أن تجمع في داخل غطاء القارورة بعد فتحه (الشكل 2H). ملاحظة: هناك حاجة فقط قطرات صغيرة.
- نقل نهاية انخفض الغراء من الأسلاك النحاسية إلى قطعة من سلك الذهب، في حين رفع أحد طرفي لتجنب تلطيخ الغراء على لوحة الكائن stereomicroscope. محاولة تتداخل coppeص وأسلاك الذهب لعدد قليل مم (الشكل 2I)، وتوزيع الغراء على طول تداخل السلكين.
- الانتظار حتى يتم تجفيفها الغراء ما يكفي للحفاظ على الأسلاك المتحدة. تحقق من الاتصال الغراء بعد التجفيف وإضافة بعض الغراء جديدة مع دبوس صغير أو قطعة أخرى من الأسلاك النحاسية إذا كان بعض أجزاء من الأسلاك انضم تظهر أجزاء خالية من الغراء.
- بعد القطب الحشرات جاهز، واحفظها، على سبيل المثال إدراجها في قطعة من الستايروفوم.
ملاحظة: إن طول السلك الذهب تحديد حرية حركة المن: إذا كان قصيرا جدا (أقل من 5 ملم)، والمن قد تشعر بأنها مقيدة ولن تتصرف بشكل طبيعي؛ إذا كان طويلا جدا (> 2 سم)، فإن المن التحرك بحرية. المن تميل إلى الانتقال إلى الجانب متجه نحو المحور من الأوراق، وإذا ما سمح ل. إذا سلك الذهب يلامس ورقة، فإن إشارة تكون ذات دائرة قصيرة.
- الخطوة 3.
- قد حافظت على المن في مكان عن طريق الشفط الخفيف، وذلك باستخدام فراغ. في هذه الحالة، قم بتثبيت رانه شفط الجهاز تحت stereomicroscope. ضع افتتاح شفط في وسط الميدان.
- يهز جيدا القارورة مع الغراء الفضة لعدة دقائق (أو دوامة) حتى يتشكل مستحلب ناعم. جمع الافد مع فرشاة صغيرة.
- التبديل على جهاز الشفط وجبل أولا بأول على افتتاح شفط (الشكل 2J)، مع الجزء الخلفي من البطن تحولت إلى المجرب. مع فرشاة دقيقة، وإزالة أي الشمع السطحية من البطن (وفرة في المن الملفوف).
- فتح قارورة الغراء والرطب دبوس مع قطرات صغيرة جدا من الفضة الغراء (الشكل 2K). تطبيق قطرة من الغراء الفضة على الجزء الخلفي من البطن والمن (صورة 2L-M). السماح لهذه القطيرات جافة تماما خلال عدة دقائق، هزة بقوة القارورة الغراء مرة أخرى وإضافة قطرات الثانية من الغراء الفضة على رأس أول. ملاحظة: على الرغم من الغراء الفضة هو موصل كهربائي، فإنه لا يسبب كبيرالأضرار التي لحقت إهاب الحشرة.
- بعد إغلاق قارورة الغراء، وإدراج نهاية خالية من أسلاك الذهب في قطرة الرطب والحفاظ على الأسلاك في حين لا يزال يسمح للالغراء لتجف تماما (الشكل 2N). تجنب تلطيخ الغراء على الساقين أو هوائيات وتجاهل الافد إذا حدث هذا.
- إيقاف تشغيل الجهاز شفط تثبيت ورفع بعناية الحشرة (الشكل 2O). إذا لزم الأمر، واستخدام فرشاة غرامة للمساعدة في رفع أولا بأول من جهاز الشفط.
ملاحظة: أسلاك B. brassicae لا تتطلب فراغ، لأنها يمكن أن تكون السلكية على قطعة من نسيج مختبر الدقة، وسطح خشن من الذي يوفر أولا بأول مع ما يكفي من قبضة بحيث لن يتم رفعه بعد تطبيق قطرة من الصمغ الرطب لبطنها. بعد الغراء التجفيف يمكن لأحد أن يرفع أولا بأول من الأنسجة بمساعدة فرشاة دقيقة. - إدراج دبوس النحاس مع الحشرات السلكية في الستايروفوم وإذا لزم الأمر، ومواصلةالأسلاك جميع الحشرات الأخرى لاستخدامها في تسجيل الدورة EPG.
ملاحظة: هذه البروتوكولات لالأسلاك المن تعمل بشكل جيد بالنسبة لنا. يجوز للمستخدم العثور له / طريقتها الخاصة للأسلاك المن.
- الخطوة 4.
- وضع النباتات في قفص فاراداي (الشكل 2P) على دعم غير موصل: استخدام أطباق بتري أو لوحة من الزجاج أو البلاستيك.
- إدراج القطب النبات في التربة من كل وعاء. إدراج دبوس النحاس الحشرة السلكية في الموصل مدخلات EPG قبل مكبر للصوت (الشكل 2Q). ملاحظة: القطب التربة لا تتوافق مع القطب الأرض المستخدمة في تقنيات الكهربية الأخرى. أنه يحتوي على تعويض الجهد اللازم لضبط والتعويض عن الفولتية القطب الاستقطاب.
- على واجهة البرنامج الحصول على مرود +، مع تردد العينة ثابت 100 هرتز، أدخل اسم الملف، تحديد وتسجيل الوقت، وكتابة النص لتحديد تفاصيل التجربة (معالجة، مصنع / INSE أنواع التصوير المقطعي، وما إلى ذلك) في خطوط تعليق 2 و 3.
- خفض الحشرات على منطقة الهبوط مناسبة للنبات والبدء في تسجيل الدورة من خلال النقر على زر ابدأ البرنامج الحصول على (مرود +) واجهة.
ملاحظة 1: بحد أقصى 8 قنوات يمكن استخدامها في وقت واحد في EPG اقامة. واحد EPG القطب أو عدة EPG-الأقطاب الكهربائية في محطة يمكن استخدامها.
ملاحظة 2: عندما يكون التركيز من هذه الدراسة هو سلوك أولا بأول، بدء التسجيل قبل الوصول نبات من المن لتجنب فقدان أول أنشطة الاختراق النبات. - لدراسة ردود الكهربية من المؤسسات الصغيرة للمنبهات، انتظر على الأقل 10 دقيقة بعد أن دخلت المن في المرحلة اللحاء، وذلك للتأكد من أن المن هو في مرحلة ابتلاع اللحاء مستمرة، وأن خط الأساس إشارة مستقرة. عندها فقط، بدء تشغيل أي تجربة تحفيز النبات.
tp_upload / 52826 / 52826fig2.jpg "/>
الرقم 2. جعل EPG-الأقطاب مع المن أو الحشرات hemipteran أخرى للالكهربائية الرسم البياني الاختراق (EPG) التسجيلات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
لوحات AI، الخطوات اللازمة لإعداد EPG-أقطاب ناقص أولا بأول. أولا، تذوب قطعة من المعدن لحام على طرف الترباس لحام (A). ثم، وتراجع رأس دبوس النحاس إلى قطرة من السائل حام (B)، والاتصال مع المعدن المنصهر في طرف لحام الترباس (C). مباشرة بعد هذه الخطوة، اتصل نهاية الأسلاك النحاسية إلى غيض من الترباس لحام، من أجل الغراء على رأس دبوس من النحاس الأصفر (EF). مع مشرط أو شفرة، وقطع قطعة من سلك الذهب (G). غطسنهاية خالية من الأسلاك النحاسية (انضمت في الطرف الآخر إلى دبوس النحاس) على الفضة الغراء (H)، وسرعان ما تنضم إلى سلك الذهب إليها (I) قبل الفضة يجف. سلك الذهب موصل ممتاز، ويمكن أن يكون مستقطبا. في الواقع، في معظم الحالات الاستقطاب صغير جدا ليتم الكشف عن، وإذا كان الأمر كذلك، فإنه يمكن تعويض لمع تعويض الجهد (V).
لوحات JO، الخطوات اللازمة لتوصيل المن (أو غيرها من الحشرات hemipteran) إلى القطب. أولا، رفع بعناية الافد مع فرشاة الألوان المائية الجميلة ووضعه على افتتاح جهاز الشفط (J). بدوره على مضخة الفراغ وتغطي فتحة صمام الهواء مع قطعة من الورق لتطبيق الشفط. تراجع غيض من دبوس الحشرات في الغراء الفضة (K)، ووضع قطرات الغراء صغيرة على أعلى البطن أولا بأول، وتحت stereomicroscope (LM). في حدودالمقبل ~ 20 ثانية، قبل الحبرية الفضة الغراء على أن يجف أولا بأول، إدراج نهاية سلك الذهب من القطب الحشرات في قطرة الرطب من الفضة الغراء، وابقائه في مكان لمدة 1-3 دقائق، حتى الغراء الفضة تماما (N) المجفف في الهواء. عند هذه النقطة، تعطيل شفط عن طريق إزالة قطعة من الورق الذي يغطي ثقب صمام الهواء للجهاز شفط وإزالة بعناية أولا بأول، من جهاز الشفط: رفع المن بعد الأسلاك وغالبا ما يتطلب بعض المساعدة من خلال فرشاة دقيقة (O).
معارض وحة P تعيين لمحة عامة عن EPG كامل حتى داخل قفص فاراداي، ويظهر لوحة Q لمحة عامة عن مزيج من النباتات أولا بأول لEPG. انظر القسم 2 أعلاه للحصول على شرح أكثر تفصيلا لهذه العملية.
الحروف الصغيرة هي العلامات التي تشير إلى العناصر التي يحتاج المرء لجعل EPG-الأقطاب: أ: لحام الترباس؛ ب: ذاب المعادن لحام؛ج: السوائل لحام؛ د: النحاس موصل دبوس (مسمار)؛ ه: الأسلاك النحاسية، و: Ø 18μm أسلاك الذهب؛ ز: جهاز الشفط، ح: المن؛ الأول: الغراء الفضة المستندة إلى الماء؛ ي: قفص فاراداي؛ ك: القطب النبات؛ ل: موصل الإدخال (BNC) من EPG قبل مكبر للصوت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في دراسة سابقة، نفذنا تقنية EPG القطب بغرض تحديد خصائص الإشارات الكهربائية التي تنتج في المؤسسات الصغيرة من خلال midvein كاتربيلر هجوم 1. وmidvein هو موقع الإدراج المفضل لأقطاب الزجاج التقليدية، فضلا عن أقطاب الزجاج مرود، لأنه SE-كثيفة، وقوية نسبيا، وبالتالي قابلة للتثبيت اللازمة لتنفيذ هذه التقنيات. هنا، نحن استغل براعة القطب EPG لغرض جمع المعلومات الكهربية من أصعب للوصول إلى المؤسسات الصغيرة، ولا سيما في عروق الحدية للأوراق الشكل 3 يظهر EPG نموذجي التسجيل من SE في الوريد هامشية من A. مصنع thaliana، الذي يحتوي على إشارة كهربائية الناجم عن جرح البعيدة. مختلفة من المؤسسات الصغيرة في الأوردة الرئيسية، المؤسسات الصغيرة في الأوردة هامشية وردت إلى الضرر بعيد مع واحدة، وبطء موجة الاستقطاب التي قد تتوافق معبطيئة موجة الاستقطاب في المؤسسات الصغيرة المركزية. في المتوسط، وكان هذا الاستقطاب البطيء الناجم عن بعد في المؤسسات الصغيرة من الهامش ورقة مدة متوسطها 61 ± 27 ثانية، ومتوسط سعة 37 ± 2 بالسيارات (ن = 3، يعني ± SEM). هذه البيانات، التي يمكن الحصول عليها بسهولة مع EPG-الأقطاب، تشير إلى أن الإشارات التي يسببها الجرح الكهربائية في أوراق المعافين لا تنتشر من الحزمة الوعائية الرئيسية للاللحاء في الأوردة الصغيرة.
هنا أيضا يمكننا استغلال قوة من الأقطاب الكهربائية EPG، للتحقيق في ما إذا كان SE يمكن أن تستجيب لمختلف المنبهات الضارة، وتسليمها في غضون فترة زمنية من أجل من دقيقة. عندما قطعت اثنين من يترك مع مقص عند تقاطع-سويقات الصفيحة، وهو EPG القطب وضعت في ورقة سليمة الكشف عن ردود مماثلة من نفس SE لهذه الجروح (الشكل 4A). في تجربة أخرى، تم استخدام كاتربيلر وكيلا جرح. كاتربيلر قطع أول ورقة غير جار، ثم بعد بضع دقائق، انتقلت رورقة الجار الزراعة العضوية وقطع عليه كذلك. في حين أن الجرح الأول في ورقة غير جار يسببها سوى الاستقطاب عابرة بطيئة، والجرح الثاني في ورقة الجار الناجم عن الإشارة الكهربائية الكاملة التي تحتوي على بطء والاستقطاب السريع، بما يتوافق مع التجارب السابقة 1. وتشير هذه البيانات إلى أن عنصر غربال يمكن الكشف عن الأحداث إصابة لحقت متعددة لأوراق أخرى، تسليمها في غضون دقائق من بعضهما البعض.
الرقم 3. تسجيلات داخل الخلايا الإشارات التي يسببها الجرح الكهربائية من العناصر غربال (SES) في الأوردة هامشية مع EPG-الأقطاب الكهربائية. الكهربائية الاختراق الرسم البياني (EPG) الجزء إشارة للمرحلة الرضاعة اللحاء للbrassicae أولا بأول Brevicoryne. والمن EPG المسجلة وتغذية من SE يقع في الوريد هامشية من ورقة # 8 (نبات الأرابيدوبسيس thaliana، النوع البري)، كما هو موضح في الرسم على اليسار. تظهر إشارة EPG موجة الاستقطاب بطيئة في SE هامشية بعد وقت قصير من قطع ورقة الجار الداني (ورقة رقم 3). تمثل، صغيرة، الهبوطية مكونات إشارة سريعة الإيقاعية إمكانات تدفق الناجمة عن صعود الإيقاعي من النسغ على طول القناة الغذائي للمرود خلال مرحلة الابتلاع (الموجي E2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. ردود كهربائية متعددة لإصابة المحفزات في عناصر غربال (SES) المكتسبة مع EPG-الأقطاب ومتانة أولا بأول نبات (Brevicoryne brassicae - نبات الأرابيدوبسيس thaliana). التفاعل واستقرار قلم دقيق المن SE-إدراجها هي الخصائص الهامة لل EPG-ايلىctrodes التي تسمح حيازة تسجيلات طويلة EPG (ساعة). نحن هنا استغل هذه الخصائص للتحقيق في ما إذا كان SE يمكن أن تستجيب لاثنين من المحفزات جرح النائية. لوحة ويظهر الردود من SE إلى حدثين جرح الاصطناعية (ورقة القطع التي مقص) على التوالي لحقت يترك اثنين من الجيران مختلفة. هناك فاصل زمني من ما يقرب من 17 دقيقة بين المحفزات اثنين. لوحة B يظهر استجابات لSE لمرتين متتاليتين أحداث جرح الطبيعية. تم استخدام الطور 4 عشر يرقة فراشة الكرنب (Pieris brassicae) في هذه التجربة. كاتربيلر قطع أول ورقة غير جار (في العلاقة مع ورقة تسجيل EPG)، الأمر الذي أدى إلى بطء، الاستقطاب عابر. ثم، وبعد حوالي 7 دقائق، قطعت كاتربيلر ورقة أخرى جارة، والتي تسببت في إشارة الاستقطاب مزدوجة (أي التي تحتوي على بطء واللاإستقطابات depolarizations سريعة عابرة) في SE-تسجيلها أولا بأول. السهام تشير إلى الوقت الذي كان فيه الجراحلحقت بها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتنص هذه المادة على بروتوكول مفصلة لصنع الكهربائية الاختراق الرسم البياني (EPG) التسجيلات. يتم تأسيس تقنية EPG بشكل جيد، مع 100-200 مستخدم نشط في جميع أنحاء العالم، وقد تم تنفيذه للعديد من الدراسات حول مواضيع مختلفة، على سبيل المثال: أ) مقاومة النبات المضيف إلى المن وغيرها من الحشرات الحاملة للمرود 13؛ آليات نقل ب) فيروس النبات والممرض 14؛ ج) وضع مبيد حشري للعمل، (سمية والسلوك التغييرات) 15؛ د) كانت EPGs حتى مفيدا لإثبات أن تحارب أولا بأول هي مفيدة للفائز كما انه يزيد من كفاءة المغذية لها (16).
تعلم سلك الحشرات لتسجيل EPG ليست صعبة ولكنها تتطلب الصبر والخبرة العملية لإتقان. من صنع أقطاب لحشرة السلكية النهائية، يوصى فترة ممارسة واحد أو أسبوعين. خلال هذا الوقت، فإن الباحث إطلاع نفسه / نفسها بالتعامل مع المختارأنواع الحشرات والمضي قدما من خلال جميع الخطوات بنجاح. الخطوات الحاسمة هي: لحام بشكل صحيح، والهز بدقة قارورة الفضة الغراء قبل اتخاذ قطرات الغراء من الحجم الصحيح - لا صغيرة جدا ولا كبيرة جدا - ضمان الربط الكهربائي والميكانيكي الصحيح، ووضع أسلاك الذهب داخل الحبرية الفضة على بطن الحشرة بطريقة ذلك لن يحد من تحركات الحشرات. والفشل في تنفيذ هذه الخطوات بشكل صحيح يؤدي إلى الربط الكهربائي الفقراء، الأمر الذي سيؤدي في بيانات ضعيفة أو غير مقبولة الجودة. عندما يعطي السلكية الحشرات الوصول إلى المحطة، فمن المهم رصد بصريا منهم خلال أول نصف ساعة من التسجيل. خلال هذه الفترة، والمن أصبح معتادا على السلك، ويمكن المشي بعيدا عن مكان التسجيل المطلوب، أو غلبه النعاس المصنع. وبالتالي، يمكن للمرء أن تحتاج إلى إعادة موقف المن خلال هذه الفترة. في حالة الأهداف السلوكية، وينبغي أن يتم أي إعادة تحديد المواقع بعد ساعة الأولىالف ساعة لمنع اختلافات كبيرة بين مكررات. وضع ضعيف أو يجب التخلص من الأفراد انخفض حالا.
بالإضافة إلى توفير بروتوكول للتسجيل EPG، وهذه المادة يلخص ملامح الدائرة EPG التي هي ذات الصلة لتطبيقه كمنهج في مصنع الكهربية داخل الخلايا (الشكل 1). الميزة الرئيسية لEPG-الأقطاب هي أنها أقطاب غاية خلية المحددة التي تسمح للتسجيلات داخل الخلايا دقيقة من المؤسسات الصغيرة. في مكبر للصوت EPG العادية، ومقاومة مدخلات منخفضة نسبيا، 1 GΩ (10 9 Ω). في الممارسة العملية، وهذا يعني أن التغييرات المقاومة أثناء تسجيل تؤثر على إمكانية قياسها. هذه ليست مشكلة في الخلايا الكهربية التقليدية مع أقطاب الزجاج، والتي تستخدم عادة ارتفاع مكبرات الصوت مقاومة المدخلات. يمكن للمرء أن تصحيح للتغييرات في المقاومة الناشئة عن غشاء البلازما ومن مصادر أخرى باستخدام calibrالبقول أوجه، كما هو الحال في سلفادور Recatalà وآخرون. 1. وثمة خيار آخر هو زيادة مقاومة إدخال EPG المضخم النظامي، من 1 GΩ إلى 1.5 TΩ (1.5 × 10 12 Ω)، أو حتى إلى 1 PΩ (10 15 Ω، اعتمادا على OPAMP مرحلة ما قبل أمبير)، والذي يتوافق مع المقاومة المدخلات في مكبرات الصوت العادية لتسجيل داخل الخلايا. يشار إلى مكبر للصوت EPG مع ارتفاع المقاومة المدخلات إلى هنا كنظام "EMF وضع EPG". في هذا مكبر للصوت، والتحول إلى تعطيل مكبر للصوت EPG العادي وضع (انظر الشكل 1). في المجالات الكهرومغناطيسية واسطة، ويسجل طريقة EPG القطب إمكانات الخلايا النباتية بأكبر قدر مكبرات الصوت العادية المستخدمة في الخلايا الكهربية. اضطراب الوحيد الذي بقي في EPG في المجالات الكهرومغناطيسية وضع ينشأ من عناصر القوة الدافعة الكهربية للحشرة خلال التغذية SE، ولكن هذه هي منخفضة نسبيا ولا شبهة دقة القياسات. إذا أراد الباحث أن سجل في وقت واحد فيرد فعل أولا بأول لعوامل الإجهاد البيئية (على سبيل المثال، والتغيرات في اللعاب والابتلاع) والمعلومات من إمكانات غشاء SE، ثم ينصح العادي الوضع في EPG. في هذه الحالة، وتطبيق نبض معايرة تقدم المقبولة والقيم التقريبية للغشاء المحتملة.
عدم وجود طرق ملائمة لاكتساب الاستجابات الكهربائية من الأوعية الدموية في الجسم الحي اللحاء يحد حاليا نوع وعدد من الأسئلة المتعلقة استجابات التوتر البيئية للمصانع. نفذت الباحثين أقطاب الزجاج 3 وأقطاب الزجاج مرود 4 لحيازة تسجيلات داخل الخلايا في المؤسسات الصغيرة في midvein. وعلى النقيض من هذين النوعين من الأقطاب الكهربائية، EPG-الأقطاب يمكن وضعه على أي جزء الجوي تقريبا من النبات (وحتى على الجذور، وذلك باستخدام المن الجذر). ولذلك، فإن EPG-أقطاب تسهيل دراسات أشمل في الكهربية النبات. Anotميزة لها من EPG-الأقطاب الكهربائية على الأقطاب التقليدية هي التي تسمح السابق لفترات التسجيل ممتدة، مما يجعل من الممكن تحقيق استجابات المؤسسات الصغيرة واحدة لمختلف المحفزات. هذه هي ميزة الفيزيائية الحيوية الهامة، ويمكن أن توفر معلومات مثيرة للاهتمام حول كيفية المؤسسات الصغيرة دمج المعلومات من المحفزات البيئية المختلفة. والواقع أن البيانات الواردة هنا يثبت أن المؤسسات الصغيرة لا تستجيب للمؤثرات المختلفة الضارة (الشكل 4)، الأمر الذي يبرر إجراء مزيد من البحوث حول هذه الميزة الطبيعية الحيوية الهامة في المؤسسات الصغيرة.
عدد من الدراسات الكهربية من المؤسسات الصغيرة صغير جدا لإجراء مقارنات بين البيانات التي حصل عليها مع EPG-الأقطاب والبيانات التي تم الحصول عليها مع أقطاب الزجاج التقليدية. في الواقع، على حد علمنا لا توجد بيانات في الأدب على الإشارات الكهربائية الناجم عن التحفيز في المؤسسات الصغيرة من نبات الأرابيدوبسيس، استحوذت مع الطريقة التقليدية، تكون أقطاب الزجاج أو أقطاب الزجاج مرود. باستخدام أقطاب الزجاج، ورودس والعثور على المتعاونين 3 أن الحرارة يستحث العمل مثل قدرة على المسامير في المؤسسات الصغيرة نباتات الطماطم. كان الاستقطاب السريع الذي أظهروا قوته عن 70 فولت، والتي تحدث على رأس صغير، أبطأ الاستقطاب. وهذا يتفق مع الإشارات الكهربائية لدينا التي حصل عليها EPG-الأقطاب 1، على الرغم من الرعاية التي ينبغي اتخاذها عند مقارنة الإشارات الكهربائية من اثنين من الأنواع النباتية المختلفة، والناجمة عن أنواع مختلفة من المحفزات.
القطب EPG هو أداة مرنة وأنيقة لدراسة ردود الكهربية للخلايا اللحاء لأنواع مختلفة من المحفزات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد VSR من قبل معهد التمويل الدولي ماري كوري جرانت (جرح في EARTH، اختصار ل: الجرح الناجم عن الإشارات الكهربائية في نبات الأرابيدوبسيس thaliana).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG Systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is 10X | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100 Hz (softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
- Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
- Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
- Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
- Brette, R., Destexhe, A.
- Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
- Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
- Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
- Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582 (1964).
- McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
- Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
- Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
- Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
- Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
- Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
- Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).
