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Biology

उसके पास homologs, Nor1 और Nur77 के खिलाफ पार जेट की Nurr -1 विशिष्ट पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी मुफ्त का उत्पादन

Published: August 17, 2015 doi: 10.3791/52963
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Molecular Neurobiology Laboratory, Psychiatry, McLean Hospital, 2Department of Biochemistry, College of Medicine, Konyang University

Introduction

प्रतिलेखन कारक Nurr1 और उसके homologs (Nur77 और Nor1) परमाणु रिसेप्टर उपपरिवार -4 ए (NR4A) 1 के हैं। उनके अंतर्जात ligands की पहचान अभी तक नहीं कर रहे हैं, क्योंकि वे भी अनाथ रिसेप्टर्स हैं। Nurr1 पहले 1992 में क्लोन किया गया था और नाम से जाना जाता है, हालांकि मस्तिष्क 2 में व्यक्त किया जा करने के लिए, विकास और मध्यमस्तिष्क डोपामिन न्यूरॉन्स के रखरखाव के लिए अपने आवश्यक भूमिका पीटकर माउस पढ़ाई 3 से पता चला था। इसके अलावा, मध्यमस्तिष्क डोपामिन न्यूरॉन्स के रखरखाव के लिए अपनी महत्वपूर्ण भूमिका हाल ही में एक सशर्त पीटकर अध्ययन 4 द्वारा प्रदर्शन किया गया। कारण मध्यमस्तिष्क डोपामिन न्यूरॉन्स के लिए Nurr1 की महत्वपूर्ण भूमिका दिखा इन सुरुचिपूर्ण अध्ययन करने के लिए, कई बाद के अध्ययन काफी हद तक डोपामाइन न्यूरॉन्स और डोपामाइन से संबंधित neurodegenerative विकार मध्यमस्तिष्क पर ध्यान केंद्रित किया है, पार्किंसंस रोग (पीडी) 5।

विशेष रूप से, Nurr1 मध्यमस्तिष्क डोपामाइन (एमडीए) न्यूरॉन्स में, लेकिन यह भी डि में ही नहीं व्यक्त की हैयह दृढ़ता से Nurr1 मस्तिष्क के विभिन्न कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है दिखा रहा है कि और अधिक हाल ही के अध्ययन के द्वारा समर्थित है जो कई गैर-डीए क्षेत्रों में कार्यात्मक भूमिका हो सकता है सुझाव है कि कविता मस्तिष्क क्षेत्रों 2,। उदाहरण के लिए, यह इस तरह के सीखने के रूप में है कि स्मृति उत्प्रेरण गतिविधियों दिखाया गया था, या अन्य हिप्पोकैम्पस-निर्भर कार्य अप-विनियमन हिप्पोकैम्पस 6,7 में Nurr1 अभिव्यक्ति का परिणाम है। इसके अलावा, नीचे हिप्पोकैम्पस में Nurr1 अभिव्यक्ति की दस्तक जोरदार Nurr1 कई मस्तिष्क क्षेत्रों में विविध भूमिकाएं निभाता है, सुझाव है कि दीर्घकालिक स्मृति और / या synaptic plasticity 8-11 ख़राब करने के लिए पर्याप्त था। इस प्रकार, आगे Nurr1 की सेल प्रकार विशिष्ट है और subcellular अभिव्यक्ति को समझने के लिए, यह अपने homologs Nur77 या Nor1 के लिए किसी भी पार जेट प्रदर्शन नहीं करते जो Nurr1 विशिष्ट एंटीबॉडी, उपयोग करने के लिए वांछनीय है। इस पत्र में अपनी विशिष्टता दिखा Nurr1 विशिष्ट एंटीबॉडी और वर्तमान अतिरिक्त डेटा उत्पन्न करने के लिए एक पूर्व सोखना प्रोटोकॉल का वर्णन है।

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Protocol

नोट: नीचे उद्धृत सभी समाधान की संरचना सामग्री / उपकरण तालिका में पाया जा सकता है।

1. प्रोटीन एक स्तंभ शुद्धीकरण एंटीबॉडी

  1. एक प्रोटीन एक स्पिन स्तंभ और पूर्व प्रक्रिया शुरू करने के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए सभी आवश्यक बफ़र्स संतुलित करना।
  2. प्रतिरक्षा सीरम 1 पतला: 1 प्रोटीन एक आईजीजी बाध्यकारी बफर के साथ। (सीरम के 5 मिलीलीटर की सिफारिश की है)।
  3. धीरे टोपी में दर्ज कराई जा सकती है कि किसी भी राल बेदखल करने के लिए एक प्रोटीन बेंच शीर्ष पर एक स्पिन स्तंभ नल। शीर्ष टोपी निकालें और धीरे से नीचे बंद होने के बंद तस्वीर। एक 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्तंभ प्लेस और भंडारण समाधान के निकास के लिए अनुमति देते हैं।
  4. बफर बाध्यकारी प्रोटीन एक आईजीजी के 5 मिलीलीटर जोड़ें और समाधान के निकास के लिए अनुमति देते हैं।
  5. स्तंभ के लिए पतला प्रतिरक्षा सीरम लागू करें और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, स्तंभ के एंटीबॉडी के बंधन capacit के 80% से भी कम एंटीबॉडी के एक एकाग्रता जिसमें नमूना मात्रा जोड़नेवाई।
  6. बफर बाध्यकारी प्रोटीन एक आईजीजी के 15 मिलीलीटर के साथ या 280 एनएम पर absorbance नीचे 0.1 है जब तक स्तंभ धो लें।
  7. पांच से लेबल संग्रह ट्यूबों के निराकरण बफर के 100 μl जोड़ें।
  8. प्रोटीन के लिए एक स्तंभ आईजीजी Elution बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें और निराकरण बफर के 100 μl युक्त ट्यूबों में से प्रत्येक में 1 मिलीलीटर भिन्न के इकट्ठा।
  9. 0.5 की तुलना में अधिक से अधिक एक absorbance के साथ 280 एनएम और पूल भिन्नों में प्रत्येक अंश के absorbance के उपाय। डायलिसिस के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर जमा भिन्नों रखें।
  10. आईजीजी Elution बफर के 8 मिलीलीटर जोड़कर स्तंभ पुनर्जन्म और समाधान कॉलम के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति देते हैं।
  11. 7.4 eluent पीएच रिटर्न जब तक एक प्रोटीन आईजीजी बंधन समाधान के साथ स्तंभ कुल्ला।
  12. भंडारण समाधान के 5 मिलीलीटर (पीबीएस में 0.02% सोडियम azide) जोड़कर स्तंभ स्टोर। लगभग 3 मिलीलीटर स्तंभ, टोपी नीचे में रहते हैं और शीर्ष टोपी सुरक्षित है। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ स्टोर।
  13. लंबाई ओ का निर्धारण करते हैंएफ डायलिसिस टयूबिंग निर्माता के निर्देशों के अनुसार की जरूरत है। 16 मिमी फ्लैट व्यास ट्यूबिंग समाधान के प्रति मिलीलीटर ट्यूब लंबाई के 5.47 सेमी उपयोग का उपयोग dialyzed किया जाना है। ट्यूबिंग कट और 15 से 30 मिनट के लिए पीबीएस पीएच 7.4 से कुल्ला।
  14. गुना और डायलिसिस टयूबिंग के एक छोर क्लिप, पीबीएस 7.4 पीएच में equilibrated डायलिसिस टयूबिंग के लिए भिन्नों युक्त जमा आईजीजी हस्तांतरण और दूसरे छोर बंद कर दें।
  15. 2 घंटे के लिए पीबीएस 7.4 पीएच के 200 संस्करणों के खिलाफ कमरे के तापमान पर Dialyze।
  16. डायलिसिस बफर (ताजा पीबीएस 7.4 पीएच) को बदलें और कमरे के तापमान पर एक और 2 घंटे के लिए dialyze।
  17. डायलिसिस बफर (ताजा पीबीएस 7.4 पीएच) को बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात dialyze।
  18. आगे की शुद्धि चरणों के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर dialyzed एंटीबॉडी समाधान रखें।
  19. 280 एनएम पर अपने absorbance के उपयोग करते हुए एंटीबॉडी एकाग्रता और 210,000 एम -1 सेमी -1 12 की 280 एनएम पर एंटीबॉडी की दाढ़ अवशोषण गुणांक का आकलन करें।

LBD प्रोटीन 2. युग्मन युग्मन राल AminoLink करने के लिए

  1. दो कॉलम, Nor1 के लिए एक और Nur77 के लिए अन्य तैयार करें। दोनों प्रोटीन के लिए एक ही प्रोटोकॉल का पालन करें।
  2. प्रोटीन पिघलना बर्फ पर राल के लिए युग्मित किया जाना है। इसके दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक और 280 एनएम 12 पर अपने absorbance के उपयोग करते हुए प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
    1. वैकल्पिक रूप से, इस तरह के bicinchoninic एसिड परख 13 के रूप में एक प्रोटीन दृढ़ संकल्प परख का उपयोग करें। प्रोटीन युग्मन बफर के खिलाफ एक amine युक्त बफर dialyze या बफर विदेशी मुद्रा में भंग कर दिया है। प्रोटीन एक उपयुक्त बफर में (कोई मुक्त amines) है, तो यह युग्मन बफर में 4 गुना पतला।
  3. प्रोटीन के 2 मिलीग्राम के लिए राल के 2 मिलीलीटर का प्रयोग करें। का पालन करें कि सभी कदम एक 10 मिलीलीटर कॉलम में 2 मिलीलीटर राल के लिए कर रहे हैं। प्रोटीन के 10 मिलीग्राम तक राल के 1 मिलीलीटर (: 1 घोल 1 से 2 मिलीलीटर) प्रति जोड़ा जा सकता है।
  4. नीचे करने के लिए एक मिलाना धक्का और इसके माध्यम से पीबीएस 7.4 पीएच चलाकर एक 10 मिलीलीटर स्तंभ तैयार करें। कैप टीवह स्तंभ के नीचे और युग्मन बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. , स्तंभ के लिए (राल के 2 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए 4 एमएल) के घोल के वांछित मात्रा में जोड़ें नीचे टोपी हटाने और स्तंभ निकास। युग्मन बफर के 6 मिलीग्राम (3 राल-बिस्तर मात्रा) की कुल के साथ स्तंभ कुल्ला और स्तंभ पलायन करने की अनुमति देते हैं। युग्मन बफर सूखा है, के बाद नीचे टोपी की जगह।
  6. (280 एनएम पर absorbance या bicinchoninic परख का उपयोग कर कदम 2.11 में eluate के प्रोटीन एकाग्रता की तुलना द्वारा युग्मन दक्षता का आकलन करने के लिए प्रोटीन समाधान के एक विभाज्य रखने के लिए) स्तंभ के लिए युग्मन बफर में निलंबित कर दिया प्रोटीन के 2-4 मिलीलीटर जोड़ें । टोपी और एक सजातीय हल है अंत पर अंत मिश्रण।
  7. एक खाली 1.8 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब वजन और धूआं हुड के लिए कदम। ध्यान से पूर्व तौला ट्यूब में NaCNBH 3 (लगभग 0.05 छ) हस्तांतरण। ट्यूब बंद करें और NaCNBH 3 युक्त ट्यूब तौलना। हुड के बाहर ट्यूब मत खोलना।
  8. के वजन के आधार परNaCNBH 3, ट्यूब में स्थानांतरित 1 एम NaOH जोड़कर एक 5 एम समाधान करें। NaCNBH 3 की आणविक वजन 62.84 छ इसलिए 0.05 ग्राम (0.05 / 62.84 = 7.96 एक्स 10 -4 मोल) 7.96 एक्स 10 -4 मोल्स के बराबर है। एक 5 एम समाधान जोड़ें (7.96 एक्स 10 -4 / 5) 1 एम NaOH के 159 μl करना।
  9. प्रतिक्रिया की कुल मात्रा को ध्यान में राल मात्रा लेने के उपाय। प्रतिक्रिया की मिलीलीटर प्रति 5 एम NaCNBH 3 के 10 μl जोड़ें।
    1. उदाहरण के लिए: एक 4 मिली प्रतिक्रिया मात्रा के लिए 5 एम NaCNBH 3 के 40 μl जोड़ें। राल के 1 मिलीलीटर और कहा कि प्रोटीन के 3 मिलीलीटर के लिए, कुल मात्रा 4 मिलीग्राम है।
  10. स्तंभ कैप और अंत पर अंत मिश्रण। एक ट्यूब रोटेटर पर स्तंभ को सुरक्षित और प्रतिक्रिया 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जारी है।
  11. सुबह में, रासायनिक हुड के लिए स्तंभ लाने के लिए और ध्यान से कुछ गैस गठन हो सकता है के रूप में टोपी को हटा दें। एक साफ ट्यूब में स्तंभ नाली और प्रोटीन चोर को मापने के लिए eluate बचाने280 एनएम विधि 12 पर absorbance या bicinchoninic एसिड परख और कदम 2.6 में शुरू होने वाले प्रोटीन एकाग्रता के साथ तुलना का उपयोग कर centration।
  12. युग्मन बफर के 4 मिलीलीटर के साथ राल धो और स्तंभ निकास।

3. अवरुद्ध शेष साइटें

  1. बफर शमन के 4 मिलीलीटर के साथ राल धो लें। नाली और नीचे टोपी की जगह। बफर शमन के 2 मिलीलीटर जोड़ें और राल रोक देते हैं।
  2. राल मात्रा और शमन बफर मात्रा तो प्रतिक्रिया मात्रा के प्रति मिलीलीटर 5 एम NaCNBH 3 के 10 μl जोड़ने को मापने के द्वारा कुल प्रतिक्रिया मात्रा का आकलन करें।
  3. 30 मिनट के अंत से अधिक अंत के लिए कमरे के तापमान पर धीरे मिलाएं। 30 मिनट के बाद, धूआं हुड में स्तंभ लाने के लिए। ध्यान से शीर्ष हटाने और फिर नीचे की टोपी को हटा दें और बर्बादी ट्यूब में स्तंभ निकास।
  4. धो समाधान के 5 राल संस्करणों के साथ स्तंभ धो लें। Eluate के abso को मापने के द्वारा अवशिष्ट प्रोटीन की उपस्थिति के लिए washes के मॉनिटर280 एनएम पर rbance। Uncoupled प्रोटीन उच्च नमक एकाग्रता से बाहर धोया जाता है।
  5. Degassed पीबीएस पीएच 7.4 से युक्त 0.02% सोडियम azide के 6 मिलीलीटर के साथ राल धो लें। जब तक जरूरत 4 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ रखें।

Nurr1 विशिष्ट एंटीबॉडी 4. शुद्धीकरण

  1. पीबीएस 7.4 पीएच के 10 एमएल के साथ Nur77 LBD युग्मित स्तंभ कुल्ला और स्तंभ निकास। स्तंभ के नीचे टोपी और एक नया 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में सूखा Nur77 LBD युग्मित स्तंभ रखें।
  2. प्रोटीन की 5 मिलीलीटर एक शुद्ध विरोधी Nurr1 एंटीबॉडी जोड़ें 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर स्तंभ और जगह टोपी। ऊपर और नीचे के ढक्कन निकालें और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा। Nor1 LBD युग्मित स्तंभ में जोड़ने के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर अलग निर्धारित करें।
  3. पीबीएस 7.4 पीएच के 10 एमएल के साथ Nor1 LBD युग्मित स्तंभ कुल्ला और स्तंभ निकास। स्तंभ के नीचे टोपी और एक 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में Nor1 LBD युग्मित स्तंभ रखें।
  4. Nur77 LBD तख्तापलट से प्रवाह के माध्यम से जोड़ेंनेतृत्व में कॉलम, 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर स्तंभ और जगह टोपी। ऊपर और नीचे के ढक्कन निकालें और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा।
  5. 280 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा एंटीबॉडी एकाग्रता उपाय।

शुद्ध विरोधी Nurr1 एंटीबॉडी की 5. एलिसा आधारित विश्लेषण

  1. एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए प्रोटीन की 100 μl (2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें। 3 अलग प्रोटीन का परीक्षण करते हैं, तो एच 4 कुओं में A1, H8 कुओं A5 के लिए प्रोटीन 2 के 100 μl, और H12 के लिए कुओं ए 9 के लिए प्रोटीन 3 के 100 μl के लिए प्रोटीन 1 के 100 μl जोड़ें। प्लेट कवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  2. पीबीएस 7.4 पीएच के प्रति अच्छी तरह से 300 μl के साथ दो बार लेपित कुओं धो लें और पूरे प्रतिजन लेपित वेल्स को एलिसा अवरुद्ध बफर के 300 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे सेते हैं।
  3. थाली शुद्ध विरोधी Nurr1 एंटीबॉडी के एक वांछित शुरू करने कमजोर पड़ने को तैयार बाधा डाल रही है जबकि एलिसा अवरुद्ध बफर में (10 से 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर से लेकर)।
  4. अवरुद्ध के 2 घंटे के बाद, सभी कुओं के लिए ताजा एलिसा ब्लॉक बफर के 100 μl के साथ एलिसा ब्लॉक बफर जगह।
  5. Serially सी पंक्ति के लिए पंक्ति बी से समाधान के 100 μl स्थानांतरित द्वारा पीछा किया पंक्ति बी में कुओं के लिए पंक्ति एक से समाधान के 100 μl स्थानांतरित करके एंटीबॉडी पतला पंक्ति ए में सभी कुओं को पतला शुद्ध विरोधी Nurr1 एंटीबॉडी के 100 μl जोड़ें नीचे जारी रखने जी अतिरिक्त 100 μl त्यागने पंक्ति में कुओं में समाधान मिश्रण के बाद जी पंक्ति। पंक्ति एच में वेल्स केवल बफर अवरुद्ध की प्रारंभिक 100 μl प्राप्त करते हैं। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  6. पीबीएस 7.4 पीएच में थाली 0.05% के बीच 20 का अच्छी तरह से प्रति 300 μl के साथ तीन (3) बार धोएं और अतिरिक्त धोने बफर दूर करने के लिए थाली दाग।
  7. हार्स मूली peroxidase (एचआरपी) एलिसा ब्लॉक बफर में पतला संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी के 100 μl जोड़ें (1: 8,000 कमजोर पड़ने; ठेठ सीमा 1 से है: 25,000: 5,000 करने के लिए 1)। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  8. थाली वें धो लेंREE (3) टाइम्स 5.6 में वर्णित है। विआयनीकृत पानी के 300 μl के साथ उन्हें भरने के द्वारा सभी कुओं कुल्ला। कागज को अवशोषित पर inverting थाली से अतिरिक्त पानी दाग।
  9. सभी कुओं को tetramethylbenzidine (कमरे के तापमान पर गरम) 3 के 100 μl, 3 '5, 5,' जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के अंधेरे में से 30 सेते हैं।
  10. अतः 4 एनएच 2 2 के 50 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
  11. 650 एनएम पर पृष्ठभूमि घटाकर 450 एनएम पर absorbance पढ़ें।

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Representative Results

प्रोटीन की एक तुलना Nur77 LBD और Nor1 LBD कॉलम के माध्यम से पारित होने के बाद शुद्ध विरोधी Nurr1 एंटीबॉडी देखा जा सकता है चित्रा 1। के रूप में दिखाया गया है प्रोटीन के साथ एक स्तंभ शुद्ध Nurr1 विशिष्ट एंटीबॉडी, एक प्रोटीन शुद्ध Nurr1 एंटीबॉडी एक मजबूत बंधन का प्रदर्शन Nurr1 LBD करने के लिए। हालांकि, यह भी Nur77 LBD करने के लिए और Nor1 LBD के लिए बाध्य महत्वपूर्ण दिखाया। एक प्रोटीन शुद्ध Nurr1 एंटीबॉडी आगे Nur77 LBD और Nor1 LBD, Nurr1 एंटीबॉडी Nur77 और Nor1 करने के लिए अपने पार जेट था कि प्रदर्शन, Nur77 LBD या Nor1 LBD को बंधन से undetectable साथ Nurr1 LBD के लिए बाध्य विशिष्ट प्रदर्शन किया शुद्ध अंतिम आत्मीयता के खिलाफ शुद्ध थे जब पूरी तरह से हटा दिया।

इस विशिष्टता आगे पूरी लंबाई Nurr1, Nor1, या Nur77 प्रोटीन (चित्रा 2) टैगिंग MYC के लिए जुड़े हुए ले जाने अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट चो सेल से अर्क के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा प्रदर्शन किया गया। उम्मीद है, विरोधी MYC antib के रूप मेंodies प्रत्येक पूर्ण लंबाई प्रोटीन इसकी उम्मीद आणविक वजन में व्यक्त की गई थी कि पता चला। एलिसा परिणामों के साथ समझौते में, एक प्रोटीन शुद्ध Nurr1 विशिष्ट एंटीबॉडी मजबूती के साथ पूर्ण लंबाई Nurr1 का पता चला है, लेकिन यह भी कम कुशलता हालांकि Nor1 और Nur77 का पता चला। इसके विपरीत, पूरी तरह से शुद्ध Nurr1 एंटीबॉडी एलिसा द्वारा Nor1 और Nur77 करने के लिए किसी भी detectable पार जेट प्रदर्शन नहीं किया या पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करती है।

अंत में, पूरी तरह से शुद्ध Nurr1 एंटीबॉडी एमडीए न्यूरॉन्स के immunohistochemical विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह सर्वविदित है कि Nurr1 दर्ज़ है, लेकिन उसके पास homologs Nor1 और Nur77, प्रमुखता से कृंतक और mRNA दोनों पर मानव एमडीए न्यूरॉन्स और प्रोटीन के स्तर 14,15 में व्यक्त किया जाता है नहीं। पूरी तरह से शुद्ध Nurr1 एंटीबॉडी का उपयोग Nurr1 लगभग विशेष रूप से द्रव्य निग्रा क्षेत्र में एमडीए न्यूरॉन्स (चित्रा 3) के नाभिक में व्यक्त किया है कि पुष्टि की।

चित्र 1 चित्रा 1:। पहले और Nur77 और Nor1 LBDs के माध्यम से पारित होने से शुद्धि युग्मित कॉलम प्रोटीन एक शुद्ध विरोधी Nurr1 एंटीबॉडी (0.156 माइक्रोग्राम / एमएल) के बाद (एक) या प्रोटीन एक के द्वारा पीछा शुद्ध विरोधी Nurr1 एंटीबॉडी के पार reactivities की एलिसा तुलना Nor1 और Nur77 LBD युग्मित स्तंभों पर क्रोमैटोग्राफी विरोधी Nurr1 एंटीबॉडी (0.156 माइक्रोग्राम / एमएल) (ख) Nurr1 LBD, Nor1 LBD या Nur77 LBD या तो 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल के 100 μl के साथ लेपित 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए जोड़ा गया था। विधि अनुभाग में वर्णित के रूप में एलिसा बाहर किया गया था।

चित्र 2
चित्रा 2:। पूर्ण लंबाई Nurr1 की विशिष्ट पहचान पूरी तरह से शुद्ध Nurr1 विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर चो कोशिकाओं में व्यक्त MYC में चिह्नित के रूप में पूर्ण लंबाई Nurr1, Nor1, और Nur77 प्रोटीन व्यक्त किया गयासंलयन प्रोटीन चो कोशिकाओं में और Myc विशिष्ट एंटीबॉडी (क), एक प्रोटीन शुद्ध Nurr1 एंटीबॉडी (ख), और पूरी तरह शुद्ध Nurr1 एंटीबॉडी (ग) द्वारा पता लगाया। प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण (डी) के लिए इस्तेमाल किया विरोधी actin के एंटीबॉडी। प्रत्येक Myc टैग पूरी लंबाई की डीएनए (65, 66 की आणविक वजन, और Nurr1, क्रमशः Nur77, Nor1, के लिए 69 केडीए) क्षणिक चो कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था और सेल के अर्क का एक ही राशि प्रत्येक गली में भरी हुई थी। लेन 1: एक खाली वेक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट चो कोशिकाओं के अर्क से मिलकर नकारात्मक नियंत्रण; लेन 2: Myc-Nurr1; लेन 3: Myc-Nur77; लेन 4: Myc-Nor1।

चित्र तीन
चित्रा 3:। सब्सटैंशिया निग्रा में पूरी तरह से शुद्ध Nurr1 विशिष्ट एंटीबॉडी विशेष रूप से टाइरोसीन-hydroxylase पॉजिटिव डोपामाइन न्यूरॉन्स का पता लगाता है मध्यमस्तिष्क डोपामाइन न्यूरॉन्स ई के रूप में, Nurr1 के लिए सकारात्मक रहे हैंपूरी तरह से शुद्ध Nurr1 विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर immunohistochemistry द्वारा xamined। विशेष रूप से, Nurr1 एमडीए न्यूरॉन्स के नाभिक में स्थानीयकृत किया गया था। वें (tyrosine hydroxylase)। स्केल बार = 100 माइक्रोन। सफेद बॉक्स मर्ज में स्केल बार 10 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल की सफलता के हित के प्रोटीन परिवार का एक विशिष्ट सदस्य के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी के लक्षण वर्णन के लिए शुद्ध प्रोटीन की उपलब्धता पर निर्भर करता है। यह स्पष्ट रूप से एलिसा और पश्चिमी सोख्ता द्वारा महत्वपूर्ण पार reactivities है कि वहाँ की स्थापना की है, जब तक एक प्रोटीन / जी का उपयोग कर एंटीबॉडी शुद्ध करने के लिए कोई जरूरत नहीं है।

पाठ में कहा गया है, यह इस तरह के Tris या ग्लाइसिन के रूप में एक amine युक्त बफर में स्तंभ के लिए पार से जुड़े होने के लिए प्रोटीन (ओं) को निलंबित करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा पार से जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया इष्टतम प्रोटीन एकाग्रता अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। बहुत कम सोखना की क्षमता कम हो जाएगा, जबकि बहुत स्तंभ पर ज्यादा प्रोटीन steric बाधा हो सकती थी। इसलिए, यह एक अच्छा विचार है 2 से 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर से लेकर प्रोटीन सांद्रता का परीक्षण करने और परिणामस्वरूप एंटीबॉडी की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए है।

कई कारकों जब वें विचार किया जाना चाहिएतकनीक अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी उपज करने में विफल रहता है। इनमें शामिल हैं: पार से जोड़ने दक्षता, immunoreactive डोमेन की हानि, और पार से जुड़े प्रोटीन विकृतीकरण। प्रोटोकॉल में कहा गया है, बहुत ज्यादा या बहुत कम प्रोटीन स्तंभ पर स्थिर किया जा रहा है कि दृढ़ संकल्प पार से जोड़ने की दक्षता की अनुमति देता है पर नजर रखे। पार से जोड़ने प्रतिक्रियाशील amines का उपयोग कर कार्बोक्जिलिक समूह के माध्यम से या कार्बोहाइड्रेट के माध्यम से immunoreactive डोमेन (ओं), स्थिरीकरण को नष्ट करने का संदेह है, तो माना जाना चाहिए।

यह लगातार अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी उपज के लिए प्रक्रिया की दक्षता पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है। उत्थान प्रयोजनों के लिए, कॉलम उन्हें कठोर परिस्थितियों (उच्च या कम पीएच) का उपयोग करने के लिए बाध्य पार प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी के छीन लिया जाना चाहिए। इस पार से जुड़े प्रोटीन की एक तेजी से उच्च प्रतिशत प्रभावी ढंग से प्रदर्शन स्तंभ को कम करने, विकृत होने का कारण बनता।

एलिसा और Weste में अवरुद्ध एजेंट के अलावाआर.एन. सोख्ता आमतौर पर सफलता का एक उचित स्तर के साथ प्रयोग किया जाता है। हालांकि, इस वीडियो में वर्णित दृष्टिकोण सफलता की संभावना बढ़ जाती है और हाथ पर पार प्रतिक्रियाशील प्रोटीन की बड़ी मात्रा को बनाए रखने के लिए की आवश्यकता कम कर देता है। अभिकर्मकों और तरीकों मीडिया में सुधार रखने क्रोमैटोग्राफी के लिए प्रोटीन को स्थिर करने के लिए के रूप में, इस दृष्टिकोण बदल कोशिकाओं विशिष्ट एंटीबॉडी परिसंचारी की पहचान के लिए योगदान देगा।

यह दृष्टिकोण शुद्ध प्रोटीन की उपलब्धता सीमित है। इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा उचित तह पर निर्भरता प्रोटीन डोमेन का उपयोग करते समय है। प्रोटीन डोमेन पूरे प्रोटीन के रूप में गुना नहीं करते हैं, तो पूर्व सोखना रणनीति सेल या ऊतक निष्कर्षों का विश्लेषण करते समय आसानी से ब्याज की प्रोटीन सदस्य की पहचान कर सकते हैं कि एंटीबॉडी उपज नहीं हो सकता है।

हितों के कई प्रोटीन उच्च अमीनो एसिड अनुक्रम homologies के साथ प्रोटीन की (उप) परिवारों के हैं। कार्यात्मक लक्षण वर्णन और IDENप्रोटीन के वितरण का चना अक्सर परिवार के प्रत्येक सदस्य के खिलाफ विशेष एंटीबॉडी की उपलब्धता पर निर्भर हैं। एक ही परिवार में प्रोटीन के सदस्यों के बीच उच्च अमीनो एसिड homologies अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी पैदा करने में कठिनाइयों के लिए योगदान करते हैं। इन पार प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी का उपयोग अक्सर परस्पर विरोधी परिणामों को जन्म दे।

ऐसा ही एक उदाहरण Nur77 और Nor1 के साथ एक साथ, परमाणु रिसेप्टर्स की NR4A उपप्रजाति के अंतर्गत आता है कि अनाथ परमाणु रिसेप्टर Nurr1 है। इन तीन कारकों अमीनो एसिड अनुरूपता के एक उच्च डिग्री साझा के बाद से, प्रत्येक कारक के खिलाफ एंटीबॉडी प्रत्येक पहलू की सटीक विश्लेषण आसानी और लचीलापन है, जो महत्वपूर्ण पार reactivities, दिखाते हैं।

एक उदाहरण के रूप में इन NR4A सदस्यों का प्रयोग, यह Nor1 या Nur77 को reactivities के अति विशिष्ट Nurr1 एंटीबॉडी मुक्त उत्पन्न करने के लिए संभव था। LBDs डीएनए बाध्यकारी डोमेन के तुलना में कम अनुरूपता साझा के बाद से, प्रत्येक प्रोटीन की LBD व्यक्त की और शुद्ध और फिर मैं करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाविरोधी Nurr1 एंटीबॉडी की विशिष्टता mprove। एलिसा द्वारा जांच की और वेस्टर्न ब्लाट का विश्लेषण करती है के रूप में शुरू में, Nurr1 के LBD के खिलाफ एंटीबॉडी, अन्य प्रोटीन को पार जेट की मामूली लेकिन महत्वपूर्ण स्तर का प्रदर्शन किया। एक प्रोटीन शुद्ध Nurr1 एंटीबॉडी आगे Nur77 और Nor1 के पार प्रतिक्रियाशील LBD डोमेन के खिलाफ पूर्व सोखना के माध्यम से शुद्ध कर रहे थे फिर भी, जब, जिसके परिणामस्वरूप Nurr1 एंटीबॉडी पश्चिमी धब्बा द्वारा जांच के रूप में, किसी भी पार जेट नहीं दिखा था और एलिसा प्रमुखता से पता चला Nurr1 का विश्लेषण करती है मध्यमस्तिष्क क्षेत्रों में डीए न्यूरॉन्स -expressing। पश्चिमी धब्बा डेटा और एलिसा बारीकी से इन विश्लेषण पूरक हो सकता है और एक दूसरे का समर्थन कर सकते हैं यह दर्शाता है कि एक दूसरे के साथ सहमत विश्लेषण करती है।

साथ में ले ली, इस एंटीबॉडी शुद्धि रणनीति मुताबिक़ प्रोटीन सदस्यों को पार जेट को नष्ट करने से एक विशिष्ट एंटीबॉडी पैदा करने में अत्यंत उपयोगी हो जाएगा।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit Thermo Scientific 44890
Protein A spin column Thermo Scientific 89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Corning 21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl Thermo Scientific 3455
10% Normal Goat Serum KPL 50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate  KPL 50-82-01
IgG Elution Buffer Thermo Scientific 21004
Micro BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific 31460
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine Thermo Scientific 34028
2N H2SO4 Macron Fine Chemicals H381 05
Protein A IgG Binding Buffer Thermo Scientific 21001
IgG Elution Buffer Thermo Scientific 21004
Column Storage solution Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing Spectrum Labs 132128
10 ml Disposable columns Thermo Scientific 29924
AminoLink Coupling Buffer 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH
7.4
Wash Solution 1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 102 Nurr1 Nor1 Nur77 पार जेट विशिष्टता आत्मीयता शुद्धि परमाणु रिसेप्टर उपपरिवार 4 ligand बाध्यकारी डोमेन,
उसके पास homologs, Nor1 और Nur77 के खिलाफ पार जेट की Nurr -1 विशिष्ट पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी मुफ्त का उत्पादन
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Leblanc, P., Moon, M., Kim, W.,… More

Leblanc, P., Moon, M., Kim, W., Jeong, I., Kim, C. H., Kim, K. S. Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77. J. Vis. Exp. (102), e52963, doi:10.3791/52963 (2015).

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