Abstract
吸附的二氧化钛(TiO 2的)的表面上的有机污染物可以通过光催化下的紫外线(UV)光分解。在这里,我们描述了一种新的协议采用二氧化钛光催化局部改变衬底表面的细胞亲和力。在这个实验中,一个薄的TiO 2膜为溅射镀膜在玻璃盖玻片,并在TiO 2表面随后改性以从十八烷基三氯硅烷(OTS)衍生的有机硅烷单层,其抑制细胞粘附。将样品浸在细胞培养基中,和聚焦UV光照射至一个八角形区域。当神经元细胞系PC12细胞铺在样本,细胞粘附只在紫外线照射的区域。进一步的研究表明这种表面改性也可以在原位进行,也就是说,即使当细胞生长在衬底上。适当的修改表面的所需的细胞外矩阵Protein胶原存在于在紫外线照射时的介质。这里提出的技术可以潜在地在图案形成多种细胞类型可以采用用于构建共培养系统或任意地操纵细胞培养下。
Introduction
半导体光刻工艺及其衍生物-诸如光刻1,2,电子束光刻3-6,和微接触印刷7-10 -现在已成为一个既定的工具在细胞生物学生长的活细胞在限定位置和几何形状。图案形成方法依赖于使用微制造基底的,由微岛细胞容许涂料在非允许的背景。例如基底用作模板图案的细胞。这些技术为我们提供了新的方法来设计的细胞和它们的功能在一个单和多细胞水平上,以提取细胞的固有特性,并增加细胞为基础的药物筛选11的吞吐量。
在细胞图案化的自由度度会大大增加,如果模板图案几何可以改变在原位 , 即 ,当细胞是上一次一培养urface。常规方法的图案形成,不能直接应用于这里,因为它们处理样品中的气氛或真空。因此各 种新型的表面改性技术已被提出,它是基于,例如,在光反应性化合物12,13或激光烧蚀5,14,仅举几例。所提出的方法已经由Robertus 等人已很好地审查 。15,以及最近由Choi 等人的 16和中西17。
在这里,在这篇文章中,我们描述了一种新的原位表面修饰,这需要对二氧化钛的优势有机分子的光催化分解( 二氧化钛)表面18,19协议。在该方法中,TiO 2膜被插入在玻璃基板和接口单元中的有机薄膜之间,且有机薄膜通过局部地照射紫外线(UV)的分解原位光到感兴趣的区域(λ<388纳米)。我们表明,新的协议可以用于创建细胞外基质蛋白和活细胞双方易地和原位微图案。 二氧化钛是生物相容的,化学稳定的,且光学透明的,特征,其中使得它友好引入在细胞培养实验。该协议提供了一个材料科学为基础的替代修改细胞培养支架的细胞培养环境。
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Protocol
包被的玻璃盖玻片1.准备二氧化钛
- 号码使用金刚石划片盖玻片。这不仅有助于跟踪每个盖玻片的同时也确保了样品的正确的一面朝上。清洁的盖玻片,第一下运行DDH 2 O的,然后通过浸入它们食人鱼溶液(H 2 SO 4 :H 2 O 2 = 4:1)。 10分钟后,彻底冲洗盖玻片,8次双蒸2 O.在干燥N 2流盖玻片。
- 在射频(RF)溅射系统设置的 TiO 2靶。附加的盖玻片上使用聚酰亚胺胶带将溅射设备的一个样品架。将样本保持在溅射室中。疏散室,直到压力达到2.0×10 -4帕。
- 引入Ar气到腔室内,并设置在沉积压力为4.0毫乇。当保持闸板关闭时,逐渐增加RF功率至70瓦
- 打开快门和溅射15分钟,得到一个薄膜的厚度为120-150毫微米( 图1:步骤A)。膜的生长速率需要被衍生为每个机。
2.表面涂层与细胞排斥膜
- 通过用O 2等离子体处理样品,以下由等离子体反应器的制造商提供的说明书亲水在TiO 2表面上。我们治疗的样品进行5分钟,在200瓦与O 2流量以100sccm。沉浸在样品中DDH 2 O的,并确认表面超亲水性。表面干燥彻底在N 2流。
- 制备1mM的十八烷基三氯硅烷(OTS)溶液中加入39.6微升的OTS 100毫升甲苯。浸在1小时在室温下的溶液中的样品。进行此步骤内的N 2 -filled手套袋中( 图1:步骤B)。
- 要除去物理吸附的分子,sonicatE中的样品中的甲苯,丙酮,乙醇和DDH 2 O的,每次5分钟,在该顺序。冲洗样品四次新鲜的DDH 2 O的和干燥在N 2流的表面。表面应是疏水为100-110°的接触角。
3. 前现场表面图案
- 工作在层流罩,得出一些划痕,表面上的钻石划线。这些标记有助于跟踪处理过的区域,也使显微镜聚焦。通过浸渍在70%乙醇的样品5分钟消毒OTS涂覆的 TiO 2。然后用清水冲洗样品两次消毒的双蒸2 O.
- 放置在一个35毫米的培养皿的样品,并加2ml的PC12生长培养基(参见步骤4.2)。孵育超过3小时,在CO 2培养箱中(37℃)。这个程序的目的是让血清白蛋白吸收在表面上。吸附白蛋白抑制其他prote随后的吸附插件和细胞 (图1:步骤C)。
- 在等待时,设置了倒置荧光显微镜。
- 打开弧光灯,插入UV滤光立方体,和物镜设置为20X。
- 测量光强度 I(W厘米-2)用紫外线强度计,并计算辐照时间 t(秒)为一个在剂量d的(以J厘米-2)为:T = D / I。
例如,照射在为200J厘米-2的剂量使用的600毫瓦cm -2的光源,333秒的照射是必需的。 - 使用一个阶段微米和关闭场光阑设置要被照射的区域的尺寸,例如,200微米。
- 在3小时温育后,补充用200μl的3.0毫克毫升-1 IV型胶原的培养基(COL-IV;最终浓度300微克毫升-1)。
- 转移35毫米的菜显微镜阶段。发现划痕米柜,聚焦显微镜到样品表面上,并且照射UV光以为200J cm -2的( 图1:步骤D)的剂量。紫外线照射的面积可以通过调整视场光阑的开口,或通过与仲裁几何形状的金属掩模代替场光阑被改变。
- 替换为新鲜生长培养基的培养基(无COL-IV)中,并将样品放回到培养箱。
4.细胞培养
- PC12细胞常规培养进行在胶原包被的塑料盘。
- 涂覆60mm的组织培养皿山口-Ⅳ,第一润湿表面与DDH 2 O的,吸所有双蒸2 O.
- 用双蒸2 O稀释原液(3毫克毫升-1)10X准备300微克毫升-1 COL-IV
- 加入200μl的300微克毫升-1每60毫米的菜COL-IV。让该溶液通过表面扩散。
- 干吨他菜在层流罩约1小时。
- 用4ml的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)的漂清表面的两倍。如果不立 即使用的涂层菜,用4mL双蒸2 O.的涮菜一次吸气DDH 2 O的后,保存在孵化器的菜。尽量不要把它存放超过两个星期。
- PC12细胞生长在该组成的生长培养基:Dulbecco改良的Eagle培养基(低葡萄糖)+ 10%胎牛血清+ 5%马血清+ 1%青霉素 - 链霉素溶液。孵育细胞在 CO 2培养箱中(37℃,5%的CO 2),并更换一半培养基每隔一天。传代细胞才达到汇合。
- 吸出生长培养基,并加入2毫升PBS +(D-PBS + 10毫克毫升-1牛血清白蛋白(BSA)+ 10mM EDTA的)预热至37℃。孵育5分钟,在37℃。轻轻敲击菜分离所有CELLS。
- 收集细胞在15ml锥形管中。冲洗用3毫升新鲜的D-PBS,预热至37℃的菜。
- 离心反应管,在150×g下4分钟。
- 吸出上清液,并添加1毫升生长培养基。
- 对于常规培养,分裂细胞1:3至1:5。
- 板块细胞对紫外线改性的OTS / TiO 2的样品,计数细胞密度,并在35毫米培养皿( 图1:步骤E)添加3.0×10 5个细胞 。孵育在加湿培养箱的培养皿(37℃,5%CO 2)1-2天。既幼稚和神经生长因子(NGF)-differentiated PC12细胞可用于构图实验。对于NGF分化的7S-NGF 100纳克毫升-1电镀细胞到样品之前加入到生长培养基中数天。 NGF分化似乎增加了PC12细胞的粘附性和使处理更容易,尤其是在原位图案化Éxperiments。
5. 原位表面图案
- 经过1-2天的培养上易地修饰表面,确认细胞附着并只在紫外线照射区域增长。设置的显微镜,如步骤3.4中所述。
- 将样品转移到含有生长培养基的新35毫米组织培养皿,100纳克毫升-1 NGF(在使用NGF分化的细胞的情况下),和100μg毫升-1 COL-IV。
- 放在显微镜阶段的菜。找到相应的位置,并且照射UV光以为200J cm -2的( 图1:步骤F,G)的 剂量。新创建的许可区域表示与图1中以星号:步骤G
- 尽量在30分钟内完成一个样品的处理。照射后,将样品转移回未经COL-IV。
- 携带与铜的菜时,要特别小心ltured细胞和从盘传送样品盘,以防止拆卸图案的细胞。
图中,整个过程1示意图。详见说明书。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Representative Results
图2A示出了溅射沉积的 TiO 2膜的横截面扫描电子显微镜(SEM)图像。从观察,膜的厚度估计为大约150纳米。引人注目这里是所沉积的TiO 2膜的平整度。通过原子力显微镜(AFM)进一步分析显示,在表面的根均方(RMS)粗糙度为0.2纳米( 图2B)。
当TiO 2的表面被改性以OTS,然后浸渍在含有血清的生长培养基中,血清白蛋白吸附到OTS表面并抑制随后的蛋白质吸附和细胞粘附18,20。随后,当聚焦UV光被照射到表面,活性氧(ROS)是在TiO 2的表面21,其分解OTS自组装单层(SAM)上TiO 2和取出SAM和吸附的一个生成lbumins从表面。这使得照射区域亲水和许可对蛋白质的吸附。活性氧与白蛋白的直接交互可能同时发生,但OTS的分解应该是主要的反应,因为OTS SAM的接口白蛋白和TiO 2。在当前的协议,细胞外基质蛋白质胶原-Ⅳ被照射期间补充的介质中,和Col-Ⅳ优先吸附到UV照射区域,其中白蛋白被去除(图3A)。其它蛋白如纤连蛋白可以被图案化在相同的协议(图3B),表明该方法的多功能性。
血清白蛋白,它也存在于在紫外线照射时的介质,还应该吸附到照射区域,但结果表明,量不高,关于完整的OTS的SAM。为了证实这一点,我们调查的差的BSA的亲和力紫外线照射和完好OTS SAM通过染料标记的BSA的荧光显微镜。对于该实验,聚焦紫外光照射该OTS / TiO 2的样品尚未浸没在含有血清的培养基,然后将样品浸渍在荧光素的溶液标记的BSA。 图3C示出的吸附图案BSA。在完整的OTS的SAM区域比UV照射区域更亮的荧光表明吸附的BSA的量是在完整的区域高。优先吸附的机理可以通过在两个区域的疏水性的差异来理解。 BSA的吸附量是已知的更高的疏水表面22,并且完整的OTS的SAM区域比紫外线照射区域18更疏水。
的胶原-Ⅳ由此产生的图案作为支架用于细胞粘附。 图4A示出的NGF分化的PC12细胞上的培养的 ñ1天易地图案化区域。接着,紫外线照射到微图案的一侧,并将细胞培养额外5天。 如图4B-D,将细胞进一步迁移到改质区域,说明该表面的细胞亲和力已成功修改在细胞培养环境中。
图TiO 2薄膜的2表征。(A)的样品的横截面SEM图像。 TiO2表面的(B)AFM图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
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蛋白质到紫外线照射区域的图3.站点选择性吸附。(A)的荧光素标记的胶原(200微米八角图案) 和 (B)若丹明标记的纤连蛋白(100微米正方形图案)。这些蛋白质的优先吸附依赖于没有白蛋白,阻止蛋白质吸附(C)的。注意,在(C)中,OTS的SAM之前没有应用荧光标记BSA的浸泡在含有血清的培养基。比例尺,100微米(A)和 50微米(B,C)。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 异地和就地图案PC12细胞,PC12细胞(A)附着到一个异地图案化区域。虚线八边形表示的原位紫外线照射的部位。 ( 乙 - D)的 PC12细胞迁移到原位图案化区域,在2天(B)中 ,3天(C)和 5天(D)的照射后。比例尺,200微米。从Yamamoto等18修饰许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在我们目前的协议, 二氧化钛膜通过射频磁控溅射形成。我们是有利于沉积的这种方法,因为它允许我们可重复使用亚纳米粗糙度调制成光催化二氧化钛薄膜。虽然溅射淀积过程是熟悉的材料科学家和电子工程师,它可能不是很访问生物学家。在这种情况下,旋涂的TiO 2膜 。将另外的选择23。在该方法中, 二氧化钛纳米颗粒溶解在溶剂中通过离心力铺展在基板表面上。需要特殊的设备是旋涂机,它比的溅射系统多实惠。我们已经使用了我们自己一个旋转涂敷的 TiO 2纳米颗粒薄膜,并已证实该薄膜还可以用于进行类似的实验(数据未显示)。旋涂的TiO 2膜的表面比较粗糙,几十均方根粗糙度纳米秒,它需要一些练习均匀涂布基材时,需要多个旋转涂层,以获得厚膜重复地尤为明显。然而,该方法可能是生物学家第一候选。
到目前为止,我们已经利用这种方法在图案形成不仅PC12细胞,而且一个人胰腺癌细胞系的AsPC-1和从大鼠胚胎海马19获得原代神经元。的AsPC-1细胞的粘附性都比PC12细胞或海马神经元,并补充脚手架分子,如胶原蛋白,并没有要求在图案化其中的强得多。我们还注意到细胞对未照射区域被偶尔观察到,这可能是,非特异性粘附由于在OTS SAM缺陷。
图案主神经元更具挑战性,因为它们的粘合力较弱。事实上,目前的方法的关键步骤在于在合适的吸附脚手架分子。一个简单的补充胶原或层粘连蛋白的不足以提高改质区域的亲和力的神经元。海马神经元的常规培养带正电荷的肽聚-赖氨酸依赖于以涂覆盖玻片24的表面上。在这种情况下,多聚赖氨酸的诱导选择性连接到UV照射区域是需要的,但由于在完整的OTS的SAM区域多聚赖氨酸吸附以及是不可能的。我们尝试其他表面涂层,如聚乙二醇 - 硅烷的SAM和全氟硅烷的SAM,发现所有这些都是防污到聚 - 赖氨酸。为了解决这个问题,我们最近发现,交联分子,可以用于诱导脚手架分子的活性吸附到紫外线照射区域 19。这样的选择脚手架分子和它的浓度的优化的,应进行每个实验。
紫外线照射剂量还应该优化,因为它强烈地影响蛋白质吸附的量。在我们的情况下,荧光强度测定用于衍生为200J cm -2的18最佳UV剂量。该值可能取决于实验参数,如厚度和在TiO 2膜的结晶度而变化。
之间的原位表面改性迄今开发的各种技术,在本方法的主要优点是,它不需要专门的分子用于表面处理的有机合成。这里介绍的方法是,在原则上,与从市售的聚合物,肽,和SAM前体的广阔文库制备有机膜相容。这也是有利的,从某种意义上说,表面改性方法可以使用常规的实验室设备,诸如配备有汞弧灯一宽视场荧光显微镜,如这里显示出。运用紫外激光作为光源,亚细胞分辨率降至〜3微米,可以实现(数据未显示)。
当前方法的一些限制包括表面改性,需要用于补充脚手架分子在介质的不可逆性的ROS,和生成。此处所描述的方法适用于非允许在表面的容许转换,但转换是单向的,并且可以不被逆转。对于需要细胞亲和性的反转转换实验,其他方法15需要考虑。此外,我们的方法需要脚手架分子诸如胶原可以浴施加到细胞培养基中。因为预先图案化细胞群将不可避免地暴露于分子,这可能会限制这种方法的一些应用。光催化ROS产生,例如羟基自由基,在紫外线照射区域可以是有毒的附近小区,但是,至少,这种效果不是在我们的实验中观察到。即使这成为突出于其它应用中,此问题应通过补充的氧清除剂在生长培养基中来解决。自清除分子的氧不会被位于该TiO 2和在其表面上非允许分子之间,预期它们消除过度ROS而不影响图案化工艺动力学。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm diameter, #1.5 thickness |
Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
Toluene | Wako | 204-01866 | |
Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use |
Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 μm filter before use |
Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
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