Abstract
في هذا العمل وصفنا نهج الرواية التي تجمع بين خارج الجسم الحي المقايسات حساسية العقاقير وتحليل الصور الرقمية لتقدير chemosensitivity وتجانس المايلوما المتعددة (MM) الخلايا المشتقة من المريض. هذا النهج يتمثل في بذر خلايا MM الأولية المستخرجة حديثا من شفاطات نخاع العظم في غرف ميكروفلويديك تنفيذها في لوحات متعددة جيدا، يتألف كل منها من إعادة بناء المكروية نخاع العظم، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية (الكولاجين أو الغشاء القاعدي المصفوفة) وسدى (patient- الخلايا المشتقة الجذعية الوسيطة) أو الخلايا البطانية المستمدة البشرية (HUVECs). يتم تخديره غرف مع وكلاء وتركيزات مختلفة، ويتم تصوير متتالي لمدة 96 ساعة من خلال مشرق المجهري الميدان، في المجهر الآلية مزودة بكاميرا رقمية. الرقمي صورة برامج التحليل بالكشف عن الخلايا الحية والميتة من وجود أو عدم وجود حركة الغشاء، ويولد منحنيات التغير في جدوى بوصفها وظيفة سو تركيز الدواء ومدة التعرض. نستخدم النموذج الحسابي لتحديد معالم chemosensitivity من السكان الورم إلى كل دواء، فضلا عن عدد من السكان الفرعي الحالي كمقياس للورم عدم التجانس. ويمكن بعد هذه النماذج مصممة خصيصا المريض استخدامها لمحاكاة الأنظمة العلاجية وتقدير الاستجابة السريرية.
Introduction
والهدف من هذه الطريقة هو أن تميز حساسية العقاقير من المايلوما المتعددة (MM) الخلايا الأولية إلى لجنة من وكلاء خارج الحي، في أقرب وقت ممكن إلى الظروف الفسيولوجية، وبدقة كافية أن هذه النتائج يمكن استخدامها لتحديد chemoresistant الفرعية السكان داخل عبء الورم و، في نهاية المطاف، إلى بالحدود نماذج حسابية تهدف إلى تقدير استجابة سريرية.
النماذج الحسابية هي أدوات قوية لتحليل النظم المعقدة، مثل التفاعلات السرطان في استضافة العلاج. ومع ذلك، ليست سوى نماذج جيدة مثل البيانات المستخدمة لبالحدود لهم. لسوء الحظ، فإن معظم البيانات المتاحة في الأدب لا يمكن استخدامها في شكلها الحالي لبالحدود مثل هذه النماذج، لأنها غالبا ما يتم الحصول عليها في ظروف تجريبية يستبعد بعضها بعضا. وهكذا، غالبا ما يطلب من التجارب الجديدة وذلك بهدف الحصول على مجموعة من المعلمات التجريبية الحاجة. معظم فحوصات جدوى، ومع ذلك، هي مدمرة واللنا تقتصر على عدد قليل من النقاط الزمنية، في كثير من الأحيان واحدة فقط. هذا يعيق كثيرا من استخدام المقايسات chemosensitivity إلى بالحدود النماذج الحسابية، لأن مثل هذه التجارب تفشل في توفير معلومات عن ديناميات الزمنية للنظام. هذا ينطبق بشكل خاص مع الخلايا السرطانية الأولية، والتي غالبا ما تقتصر على بضعة ملايين في العينة، ولها عمر قصير بعد الخزعة، مما يحد من عدد من الظروف التجريبية المتاحة هذا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم فحوصات الجدوى تتطلب فصل من السرطان من غير السرطانية (سدى) الخلايا في وقت الكمي، وهو ما يضيف العمل الإضافي للبروتوكول، مما يشوش على الخلايا، ويحد من عدد من التجارب التي يمكن القيام بها .
قبل 40 عاما، سمك السلمون والمتعاونين 1 اقترح الشهيرة في المختبر تشكيل مستعمرة الفحص لتقييم chemosensitivity الخلايا السرطانية. للأسف وجدت هذا الاختبار متفاوتة من النجاح نظرا لقلة عدد MYE متعددةLOMA (MM) عينات المريض التي كانت قادرة على تشكيل مستعمرات تحت ظروف التحكم: وتشير التقديرات إلى أنه ليس هناك سوى مجموعة فرعية صغيرة من 0.001٪ إلى 0.1٪ من خلايا MM كانت قادرة على تكرارها، ويجري توصف بأنها خلايا الجذعية المايلوما المتعددة 2. هذه محدودة إلى حد كبير من نسبة نجاح الفحص وعدد من الأدوية التي يمكن اختبارها في وقت واحد، حتى في أكثر النماذج الأخيرة 3. هذه المسألة هي أكثر أهمية بكثير الآن عندما كلاء MM (معيار أو تجريبي) هم أكثر عددا مما كانت عليه قبل أربعة عقود.
وجود قيود كبير من هذه المقايسات المبكرة انتاجهم إنقسم: إما المريض "حساسة" أو "مقاومة" لدواء معين. يتم توفير أي معلومات بشأن درجة من الحساسية وعدم تجانس السكان الورم. وبالتالي، سيتم تصنيف المرضى الذين يعانون من جماعات فرعية صغيرة من الخلايا المقاومة سريعة النمو بأنها "حساسة" للعلاج، ولكن الانتكاس قريبا، وبالتالي لا بنefit من العلاج. ونظرا لأهمية مدة الاستجابة في البقاء على قيد الحياة (OS) من مرضى السرطان 4،5، فمن الواضح كيف كانت هذه المقايسات غير قادرة على تقدير OS صحيح على الدوام.
من أجل الالتفاف على هذه القيود، وتكون قادرة على توليد نماذج حسابية المريض محددة من شأنها أن تقدير استجابة سريرية شخصية إلى لجنة المخدرات، قمنا بتطوير طريقة لحساسية غير المدمر اختبار المخدرات من المايلوما المتعددة (MM) خطوط الخلايا والخلايا MM الأولية في إعادة الإعمار خارج الحي من نخاع العظام المكروية، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية وسدى 6. هذا الاختبار، ومع ذلك، كان الحد من الاعتماد على شريحة معينة ميكروفلويديك التجارية، أبعادها وتكلفة تقييد عدد من التجارب أو الأدوية التي يمكن أن يؤديها في وقت واحد في قطعة معينة من المعدات.
النظام هنا وصف يمتد هذا الاختبار الأصلي إلى أعلى-throughput عضوي النمط منصة الاستجابة للجرعة، لفي المختبر فحص المخدرات، استنادا إلى خوارزمية تحليل الصور الرقمية لغير المدمر تحديد بقاء الخلية. كل بئر في 384 أو 1536-جيدا لوحات هي إعادة الإعمار 3D من نخاع العظام المكروية، بما في ذلك الخلايا الأولية MM، المصفوفة خارج الخلية، وسدى ونمو العوامل المستمدة من المريض. يتم استخدام المجهر الحية وتحليل الصور الرقمية للكشف عن أحداث موت الخلايا في تركيزات المخدرات المختلفة، والتي تستخدم لتوليد السطوح الاستجابة للجرعة. من البيانات في المختبر، ويحدد نموذج رياضي حجم وchemosensitivity السكان فرعية ضمن عبء ورم المريض، ويمكن استخدامها لمحاكاة كيفية الورم سوف يستجيب للدواء (ق) في الظروف الفسيولوجية في نظام السريري 6 ( الشكل 1).
الابتكارات الرئيسية من هذه المنصة هي: (أ) عدد قليل من الخلايا السرطانية المطلوبة (1،000-10،000 في تناسق المخدراتالتموينية)؛ (ب) تقييم نجاعة الأدوية في الظروف الفسيولوجية (المصفوفة خارج الخلية، سدى، وعوامل النمو المشتق المريض)؛ يستخدم (ج) لا سمية من علامات الجدوى 7 منذ التصوير حقل مشرق فقط، وبالتالي لا حاجة ل transfect الخلايا مع مضان 8 أو 9 تلألؤ بيولوجي. (د) على التصوير المستمر تأثير المخدرات بوصفها وظيفة من التركيز ومدة التعرض (الدوائية)؛ و (ه) التكامل بين في المختبر ونماذج تطورية الحسابية، لتقدير نتائج سريرية 6 (سيلفا وآخرون، قيد الإعداد).
العامل الرئيسي الذي يسمح للخوارزمية تحليل الصور الرقمية لتبين السرطان من الخلايا اللحمية هو تقارب مختلف بهم إلى قاع البئر: خلايا MM لا تلتزم، ويبقى معلق في المصفوفة، في حين أن الخلايا اللحمية تلتزم الجزء السفلي من جيدا ثم تمتد.
يحدث هذا الفصل على الرغم من MM وسدى لإعادة المصنف في نفس الوقت، ويحدث أثناء O / N عملية الحضانة. يسرع البذر الغزل عليها في أجهزة الطرد المركزي التالي من لوحة مزيد من هذه العملية. ونتيجة لذلك، تظهر خلايا MM في الصورة كأقراص مشرق مستديرة تحيط بها حلقة مظلمة، في حين يحتفظ سدى عن الانظار وأغمق (الشكل 2). وهكذا، فإن فحص في شكله الحالي هو الانسب لخلايا السرطان غير ملتصقة، على الرغم من التعديلات في الخوارزمية يمكن القيام به لسرطان منفصل وسدى على أساس الخصائص الشكلية الأخرى، مثل الحجم والشكل. في هذا البروتوكول وصفنا نوعين من المصفوفة خارج الخلية (الكولاجين والطابق السفلي مصفوفة الغشاء)، فضلا عن نوعين من المشترك الثقافات، مع (نخاع المستمدة الخلايا الجذعية الوسيطة العظام) BMSC وHUVECS، التي تمثل منافذ فراغي وحول الأوعية من نخاع العظام ، على التوالي.
باستخدام لوحة 384 جيدا، 5 تركيزات في المخدرات واثنين من مكررات، كنا قادرين على قسم التدريب والامتحاناتتي تصل إلى 31 الأدوية المختلفة مع عينة من مريض واحد. في لوحات 1536 جيدا هذا الرقم 127. الشكل 3 يصور تخطيط المستخدمة حاليا اليدوي للزرع الخلايا، في حين يمثل التكميلي الشكل 1 التوزيع الأمثل باستخدام pipettor الروبوتية. في التصميم من الشكل 3، يمكن لكل لوحة 384 جيدا تحمل 3 عينات المريض مع 7 الأدوية المختلفة، أو عينة واحدة المرضى اختبار مع 21 المخدرات. يتم تمثيل كل دواء بنسبة 5 تركيزات، والمصنف كل شرط في التكرارات. والمصنف 4 آبار المراقبة (مضاف المخدرات) لكل مجموعة من 7 المخدرات (على سبيل المثال، الآبار 36-39، 126-129 و200-203). لضمان فاعلية من الأدوية المستخدمة، خط خلية الورم النخاعي الإنسان (على سبيل المثال، H929 أو MM1.S) هو أيضا المصنف، وتخديره في التكرارات على أعلى تركيز كل من العقاقير المستخدمة (الآبار 76-89). مراقبة خط الخلية إيجابية يضمن أن العقاقير المستخدمة لديها قوة كافية، منذ منحنيات الاستجابة للجرعة هي المتردد مقارنةتجارب روس. هي المصنفة بئرين مع خط خلية الورم النقوي عن السيطرة للظروف البيئية، وبعبارة أخرى، للكشف عن المشاكل المحتملة في مقاعد البدلاء كبار حاضنة أثناء التصوير (الآبار 75 و 90). تعداد الآبار يتبع نمطا متعرج من أجل تقليل المسافة التي مرحلة الآلية المجهر، مما يقلل من اكتساب الوقت ويقلل من التآكل من المعدات المشمولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
استخدام الخلايا البشرية المستمدة من الخزعات كما هو موضح أدناه والتي وافق عليها مجلس موفيت في المراجعة المؤسسية والتي أجريت تحت التجربة السريرية MCC # 14745 أجريت في مركز السرطان لي موفيت H. ومعهد بحوث.
1. فرز الخلايا MM من نخاع العظم شفاطات
- جمع شفاطات نخاع العظم (20 مل) من المرضى في هيبارين الصوديوم حقنة.
- عزل الخلايا وحيدات النوى بواسطة الطرد المركزي نخاع المخفف (1: 1 مع برنامج تلفزيوني العقيمة) على العقيمة مائي المتوسطة الطرد المركزي التدرج في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- جمع واجهة، الذي يحتوي على الخلايا وحيدة النواة. غسل الخلايا مع PBS الباردة والعد باستخدام عدادة الكريات أو خلية مكافحة الآلي، وذلك باستخدام التريبان الأزرق لتحديد جدوى.
- إعداد طبقة رقيقة إعداد الخلية الشريحة 10 وصمة عار مع رايت بالغيمزا صمة عار لتقييم نسبة خلية بلازما 11.
- حسابكمية من الخرز CD138 لاستخدامها على أساس عدد الخلايا ونسبة الخلايا البلازما. إذا بدءا العينة أقل من 20٪ خلايا البلازما، ثم إعادة تعليق الخلايا باستخدام 90 ميكرولتر من العازلة الفصل و 10 ميكرولتر من الخرز CD138 في 5 × 10 6 خلايا. إذا بدءا عينة أكثر من 20٪ خلايا البلازما، معلق باستخدام 80 ميكرولتر من العازلة الفصل و 20 ميكرولتر من الخرز CD138 في 1 × 10 7 الخلايا.
- احتضان الخلايا مع حبات عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- تمر الخلايا من خلال مصفاة 35 ميكرومتر وأضافت الفصل المبللة مسبقا ل(LS) أعمدة وضعها في فاصل المجال المغناطيسي (انظر قائمة المواد).
- إزالة عمود من المغناطيس. جمع الخلايا المختارة CD138 عن طريق غسل العمود 3 مرات مع 1 مل من العازلة الفصل.
- تقييم تخصيب CD138 مع إعداد خلية رقيقة طبقة أخرى الملون الشريحة 10.
- فلتر البلازما الحصول عليها من خزعة نخاع العظم من كل مريض مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون. استخدام البلازما الطازجةمن نفس المريض كما الخلايا CD138 +.
- إعداد وسائل الاعلام عن التجربة من خلال استكمال RPMI-1640 مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني، بلازما المريض 10٪ و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين.
- جمع التدفق من خلال التحديد (CD138-) واتبع طريقة التصاق الكلاسيكي 12 لتحديد لخلايا نخاع العظام الوسيطة (BMSCs). وبما أن هذه العملية تتطلب أسابيع قبل BMSCs مستعدون لاستخدامها، فمن الضروري أن يكون BMSCs جاهزة من المرضى السابق أو المتبرعين الأصحاء.
2. خلايا البذر في لوحات (عن طريق يدوي متعدد القنوات Pipettor)
- استخدام لوحة متعددة جيدا (384 أو 1536) مع الجدران السوداء ومسطحة القاع الشفاف، تفضيلي واحد الأمثل للتطبيقات البصرية وثقافة الخلية.
- شارك في ثقافة BMSCs مع الخلايا MM في أي الكولاجين النوع الأول أو مصفوفة الغشاء القاعدي، ومع ذلك، HUVECs تتطلب مصفوفة الغشاء القاعدي.
- الحفاظ على الكثافة النهائية من كل نوع من الخلايا فيالنطاق التالي: 3 × 10 5 خلية / مل للخطوط الخلايا MM، 2 × 10 5 خلية / مل لHUVECs أو BMSCs، و2 × 10 6 خلية / مل للخلايا MM المستمدة من المريض.
ملاحظة: هذه الكثافة هي نتيجة التحسين التجريبية للسماح لأعلى مستوى من الجودة صورة ممكنة وقتا أطول التصوير ممكن مع الحفاظ أهمية بيولوجية في المقايسات. هي المصنفة خطوط الخلايا MM بكثافة أقل من خلايا MM الأولية بسبب أسرع معدل تكرارها وحجم أكبر. - ثقافة مشتركة من الخلايا MM الأولية مع BMSCs:
- إعداد 100 مكل من وسائل الإعلام قبل مختلطة تتكون من 20 ميكرولتر من 10X MEM، 20 ميكرولتر من H 2 O منزوع الأيونات، 10 ميكرولتر من 7.5٪ محلول بيكربونات الصوديوم، و 50 ميكرولتر من 1X RPMI 1640 وتخزينها في 4 ° C.
- في وقت البذر لوحات مع الخلايا MM، مزيج قسامات وسائل الإعلام قبل مختلطة مع 150 ميكرولتر من 3.1 ملغ / مل البقري نوع الكولاجين أنا إلى الحجم النهائي من 250 ميكرولتر.
- إعادة المعلإنهاء 50 ميكرولتر من الخلايا في RPMI 1640 في ستة أضعاف الكثافة النهائية المرجوة.
- مزج لتعليق الخلية مع مزيج الكولاجين لإنشاء وحدة تخزين النهائي من 300 ميكرولتر باستخدام ماصة P200.
- باستخدام ماصة اليدوية أو مكرر، إيداع انخفاض 8 ميكرولتر من خلية النهائية / مزيج مصفوفة في وسط كل بئر في لوحات 384 جيدا، أو 2 ميكرولتر في كل بئر من 1536 لوحات جيدة (راجع الخطوة 2.6 للحصول على مثال الترتيب المكاني من الآبار).
- لوحة أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 500 x ج لتركيز كل الخلايا إلى نفس المستوى البؤري أثناء التصوير.
- ترك لوحة في حاضنة (5٪ CO 2، 37 ° C) لمدة 1 ساعة، لجل البلمرة.
- إضافة 80 ميكرولتر من وسائط النمو تستكمل (RPMI-1640، و 10٪ FBS مرحبا، 10٪ المستمدة من المريض البلازما، 1٪ P / S) إلى كل بئر في 384 جيدا لوحات، أو 8 ميكرولتر في لوحات 1536 جيدا.
- ترك لوحة O / N في الحاضنة (5٪ CO 2، 37 ° C) للالتصاق سدى في الجزء السفلي من لوحة.
- شارك مكعبlture الخلايا MM الأولية مع HUVECs:
- نقل مصفوفة الغشاء القاعدي من -80 ° C إلى دلو مع الجليد لذوبان الجليد.
- العد وإعادة تعليق الخلايا الأولية وHUVECs في وسائل الإعلام RPMI-1640 في 4 أضعاف الكثافة النهائية، كل في أنبوب منفصل.
- مزج خلايا المريض وأحجام HUVECs في 1: نسبة 1.
- مرة واحدة يتم إذابة مصفوفة الغشاء القاعدي، ولكن لا يزال لا بلمرة، خلط 1: 1 مع خليط الخلية من الخطوة السابقة.
- قطرات البذور مع حجم كاف من مزيج خلايا المصفوفة في وسط كل جانب (8 ميكرولتر لوحات 384 جيدا و2 ميكرولتر لوحات 1536 جيدا، راجع الخطوة 2.6 للحصول على مثال الترتيب المكاني للآبار).
- لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10 دقيقة.
- مكان لوحة في الحاضنة (5٪ CO 2، 37 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة لمصفوفة البلمرة.
- إضافة وسائط النمو (RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ FBS، البلازما المريض 10٪ و 1٪ P / S) إلى كل بئر (80 ميكرولتر لوحات 384 جيدا، 8 ميكرولتر عن 1،5لوحات 36-جيدا).
- ترك لوحة O / N في الحاضنة (5٪ CO 2، 37 ° C) للالتصاق HUVECs إلى الجزء السفلي من لوحة.
- البذور لوحة 384 جيدا الشكل 3 يصور التوزيع المكاني نموذجية من البذر.
- ابتداء من B2 جيد، البذور العديد من الأعمدة كعقاقير لفحصها. في المثال في الشكل 3، استخدم سبعة المخدرات.
- كرر بذر عدة مرات كما تركيزات لاستخدامها. في المثال في الشكل 3، استخدم خمسة تركيزات.
- البذور أربعة آبار أكثر لظروف السيطرة.
- كرر الخطوات من 2.6.1 و2.6.2 لتكرار الثاني.
- كرر الخطوات من 2.6.1 إلى 2.6.4 لكل عينة المريض لفحصها في اللوحة.
- البذور خط الخلية MM في سطرين من الآبار، ولكل منها العديد من الآبار مثل الأدوية لفحصها (في نسختين). سيتم التعامل مع كل من هذه الآبار وفقا لأعلى تركيز من كل دواء للتأكد من أن الأوراق المالية المستخدمة زيارتها الهياج كافيةقبرصي (انظر الشكل 3 على سبيل المثال).
- البذور بئرين مع خط خلية MM لتكون بمثابة السيطرة على الظروف التجريبية، مثل حسن سير العمل في أعلى حاضنة مقاعد البدلاء، وسائط النمو، وما إلى ذلك.
3. بذر خلايا في لوحات (باستخدام الروبوتية Pipettor)
ملاحظة: هذه السلسلة من بذور خطوات لوحة 384 جيدا باستخدام pipettor الروبوتية. وصفت تصميم لوحة في التكميلي الشكل 1، حيث يتم اختبار الخلايا MM الابتدائية ضد فريق من 31 أدوية مختلفة في خمس تراكيز مختلفة في اثنين من مكررات، بالإضافة إلى مراقبة سلبية. والمصنفة A خط الخلية أيضا السيطرة الإيجابية لتقييم نجاعة الأدوية واختبارها ضد جميع الأدوية 31 على أعلى تركيز، في اثنين من مكررات. الملفات المقدمة هي لعلامة تجارية ونموذج معين (انظر الجدول المواد) لكن الخوارزمية يمكن أن تتكيف مع أي pipettors الروبوتية.
- شارك في ثقافة من الخلايا MM الأوليةالصورة مع BMSCs:
- إعداد أنبوب 15 مل يتكون من 240 ميكرولتر من 10X MEM، 240 ميكرولتر من H 2 O منزوع الأيونات، 120 ميكرولتر من 7.5٪ محلول بيكربونات الصوديوم، 600 ميكرولتر من 1X RPMI 1640 و 1.8 مل من 3.1 ملغ / مل البقري نوع الكولاجين I. تسمية أنبوب ب "ما قبل المزيج لCD138 +". وضع على الجليد حتى الاستخدام.
- إعداد أنبوب 1.5 مل يتألف من 50 ميكرولتر من 10X MEM، 50 ميكرولتر من H 2 O منزوع الأيونات، 25 ميكرولتر من 7.5٪ محلول بيكربونات الصوديوم، 125 ميكرولتر من 1X RPMI 1640 و 375 ميكرولتر من 3.1 ملغ / مل البقري نوع الكولاجين I. تسمية أنبوب ب "ما قبل المزيج لخط الخلية". وضع على الجليد حتى الاستخدام.
- إعادة تعليق 300 ميكرولتر من CD138 + الخلايا في RPMI 1640 في ستة أضعاف الكثافة النهائية المرجوة. إعادة تعليق 300 ميكرولتر من الخلايا BMSC في RPMI 1640 في ستة أضعاف الكثافة النهائية المرجوة. خلط كلا المجلدين معا في أنبوب 1.5 مل وتسمية "CD138 +". وضع في الحاضنة حتى الاستخدام.
- إعادة تعليق 60 ميكرولتر منخط خلية في RPMI 1640 في ستة أضعاف الكثافة النهائية المرجوة. إعادة تعليق 60 ميكرولتر من الخلايا BMSC في RPMI 1640 في ستة أضعاف الكثافة النهائية المرجوة. خلط كلا المجلدين معا في أنبوب 1.5 مل وتسمية "خط الخلية". وضع في الحاضنة حتى الاستخدام.
- باستخدام البرامج المقدمة مع pipettor الروبوتية، تحميل ملف البرنامج النصي الأول، "cell_seedingPt47.PGM". وضع 200 ميكرولتر مربع ماصة، لوحة microtiter، ومعقمة 384 لوحة جيدا في محطات A، B و E، على التوالي، للروبوت.
- خلط محتويات الأنابيب "قبل المزيج لCD138 +" و "CD138 +". نقل 1.5 مل من محتوياته إلى البئر رقم 1 من لوحة microtiter. وضع أنبوب مع حجم المتبقية على الجليد. بدء تشغيل البرنامج. الروبوت سوف البذور الآبار 176 الأولى (11 اليسار معظم الأعمدة) من 384 لوحة جيدا ثم وقفة. نقل ما تبقى من الأنبوب على الجليد لبئر رقم 2 من وحة microtiter. استئناف البرنامج. السوف الروبوت البذور 144 الآبار المتبقية من 384 لوحة جيدا وقفة.
- خلط محتويات الأنابيب "قبل المزيج لخط الخلية" و "خط خلية" ونقل المحتويات إلى جانب رقم 3 من بين وحة microtiter. استئناف البرنامج. الروبوت سوف البذور على 64 بئرا المتبقية من 384 لوحة جيدا.
- وضع لوحة 384 جيدا في أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 500 x ج و 4 ° C. لوحة نقل إلى حاضنة (5٪ CO 2، 37 ° C) لمدة 1 ساعة لالكولاجين بلمرة.
- تحميل الملف النصي الثاني، "media_layer.PGM". وضع 120 ميكرولتر مربع ماصة، وخزان كاشف مع 31 مل من RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ FBS، بلازما المريض 10٪ و 1٪ P / S، واللوحة 384 جيدا مع الخلايا في محطات A، B و E، على التوالي. تشغيل البرنامج. الروبوت سوف نقل 81 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى كل بئر. الانتهاء مرة واحدة، ونقل 384 لوحة جيدا إلى الحاضنة والسماح سدى التمسك الركيزة O / N.
4. إعداد المخدرات والتخدير من لوحات (عن طريق يدوي متعدد القنوات Pipettor) - إعداد قالب مشابهة للشكل 3 وذلك لتسهيل عملية إضافة المخدرات إلى الآبار وتقليل فرصة من الارتباك.
- يعد، لوحة 96-جيدا، والتخفيف المتسلسل لكل من المخدرات لفحصها في لوحة، وعلى سبيل المثال، لمدة خمس تركيزات باستخدام التخفيف 3 أضعاف:
- إضافة 120 ميكرولتر من المخدرات في 10X التركيز المطلوب في أعلى تركيز جيدا. على سبيل المثال، استخدم 500 ميكرومتر ملفلان إذا كان أعلى تركيز سوف يتعرض الخلايا في لوحة ستكون 50 ميكرومتر.
- إضافة 80 ميكرولتر من وسائط النمو (RPMI تستكمل مع 10٪ FBS، 10٪ المستمدة من المريض البلازما و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S)) إلى الآبار الأربع اللاحقة.
- نقل 40 ميكرولتر من أول بئر للثاني وتخلط، إلى وحدة تخزين ما مجموعه 120 ميكرولتر في 1/3 من تركيز الدواء أول البئر، أو 167 ميكرومتر.
- كرر الخطوة 4.2.3 إلى الآبار المتبقية (على سبيل المثال، نقل 40 ميكرولتر من المركز الثاني إلى المركز الثالث، مزيج، ثم نقل 40 ميكرولتر من المركز الثالث الى المركز الرابع، وما إلى ذلك).
- نقل 8 ميكرولتر من كل دواء يحتوي كذلك على المقابلة بشكل جيد في لوحة الخلية. كل دواء يحتوي أيضا يجب أن يكون حجم كاف لمدة 10 بئرا في لوحة الخلية. في المثال في الشكل 3، يضاف كل تركيز الدواء إلى 6 آبار مختلفة، باستثناء أعلى تركيز، والذي يضاف إلى 8 آبار.
- إضافة 8 ميكرولتر من وسائط النمو (RPMI تستكمل مع 10٪ FBS، 10٪ المستمدة من المريض البلازما و 1٪ P / S) إلى آبار المراقبة.
- خلايا مكان في المجهر في أقرب وقت جاهزة وتشغيل حضانة أعلى مقاعد البدلاء.
- تحميل ملفات البرامج النصية لpipettor الروبوتية من http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS فايles.zip
- تحميل البرنامج النصي "media_layer_DRUGPLATE.PGM" في واجهة المستخدم pipettor الروبوتية. وضع 120 ميكرولتر مربع ماصة، خزان مع 21 مل من RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ FBS، بلازما المريض 10٪ و 1٪ P / S وفارغة لوحة 384 جيدا في محطات A، B و E، على التوالي. تشغيل البرنامج، سوف pipettor الروبوتية إضافة 30 ميكرولتر من وسائل الإعلام لجميع الآبار في لوحة 384 جيدا.
- بعد قالب من التكميلي الشكل 2 إضافة 200 ميكرولتر من المخدرات في 20x والتركيز الأقصى إلى كل بئر من وحة microtiter. هذا الإعداد يستوعب ما يصل إلى 31 المخدرات. لرقابة جيدا (CTRL)، إضافة RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ FBS، البلازما المريض 10٪ و 1٪ P / S.
- وضع 120 ميكرولتر مربع ماصة، وحة microtiter مع المخدرات في 20X تركيز، و 384 بشكل جيد مع وسائل الإعلام (من الخطوة 5.1) في محطات A، B و C، على التوالي. تحميل برنامج "drug_plate.PGM". سوف pipettor الروبوتية إنشاء التخفيف المتسلسل1: 3، وبعد التوزيع المكاني في التكميلية الشكل 1.
- وضع 120 ميكرولتر مربع ماصة، لوحة 384 جيدا مع تخفيف المخدرات (من الخطوة 5.3) ولوحة 384 جيدا مع الخلايا (من الخطوة 3.1.9) إلى محطات A، B و C، على التوالي. تحميل وتشغيل البرنامج "drug_add.PGM". سوف pipettor الروبوتية نقل 8 ميكرولتر من المخدرات من كل بئر في لوحة المخدرات إلى نظيرتها في لوحة الخلية. وبمجرد الانتهاء، نقل لوحة الخلية إلى حاضنة للالمجهر الرقمي في أقرب وقت ممكن.
- تنظيف المناطق الداخلية من أكبر حاضنة مقاعد البدلاء مع الإيثانول الرطب مسح وإزالة بعناية غطاء لوحة في حين وضع غطاء من المؤتمر الوطني العراقيubator.
- اتبع الخطوات البرامج لإضافة منارات. هذا هو مصطلح يستخدم للإشارة إلى المعالم للمناطق ذات الأهمية، ليمكن تصوير تباعا خلال التجربة (انظر دليل مستخدم البرنامج للحصول على التفاصيل).
- استخدام الهدف التكبير 5X أو 10X. تأكد من أن التركيز يشبه الشكل 2: خلايا MM تظهر الأقراص كما مشرق تحيط بها حلقة مظلمة وBMSCs أو HUVECs هي بالكاد مرئية. بعض الخلايا MM الأساسية هي صغيرة جدا، وبالتالي قد تكون هناك حاجة إلى صقل للعثور على التركيز الأمثل.
- ضبط الفاصل الزمني الاستحواذ بين 10-30 دقيقة ومدة لا يقل عن 96 ساعة. في حين فترات أطول بين عمليات الاستحواذ مقبولة، قد فترات من 45 دقيقة أو أكثر يقلل بشكل كبير من دقة قياس قدرتها على البقاء.
- تكوين البرنامج بحيث يتم تخزين الصور من كل بئر في ملفات منفصلة اسمه منارة-1، منارة-2، وما إذا تم استخدام pipettor الروبوتية، تعيين منارات في الترتيب المبين فيالشكل التكميلي 3.
- تأكد من أن هناك ما يكفي من المياه في المرطب الحاضنة والغاز، وذلك أن الخلايا ستكون في أفضل الظروف.
- عند الانتهاء من التجربة، نسخ المجلدات التي تحتوي على الصور إلى الكمبيوتر الذي سيتم تشغيل التحليل.
- تحميل برنامج يماغيج من موقع المعاهد الوطنية للصحة: http://imagej.nih.gov/ij/
- تحميل برنامج نصي والإضافات في http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
- اتبع الإرشادات الموجودة في http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf لتشغيل البرمجيات الرقمية تحليل الصور. يجب أن تكون النتيجة جدول اسمه Results.csv تحتوي على قياسات حيوية على فترات منتظمة لمجموعة شرق افريقياح بشكل جيد في لوحة لمدة التجربة (أي 96 ساعة).
- في حالة استخدام يدوي متعدد القنوات pipettor، قم بالخطوات التالية.
- تحميل الملف http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt وتعديله لتتناسب مع تخطيط لوحة المعرفة في الخطوة 3.1 (على سبيل المثال، الشكل 3).
- تحميل البرنامج http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar وتشغيله باستخدام الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوات 5.3 و 5.4 كمعلمة الإدخال. ستكون النتيجة تقرير اسم المجلد الذي يحتوي على جداول متعددة، ولكل مجموعة نتائج لدواء معين.
- نسخ ولصق المحتويات في قالب جدول http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
ملاحظة: يجب أن تكون النتيجة الرسوم البيانية مثل واحد هو مبين في الشكل (4)، وهو ما يمثل chemosensitivity من العينة إلى الأدوية المختلفة بوصفها وظيفة من تركيز الدواء ومدة التعرض. </ OL>
- إذا باستخدام pipettor الروبوتية، قم بالخطوات التالية.
- تحميل ملفات قالب من تحميل ملفات البرامج النصية لpipettor الروبوتية من http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic قالب Files.zip واستخراج الملفات في الدليل.
- تعديل الملف DrugList.csv وفقا لقائمة من الأدوية وأعلى تركيز الدواء في لوحة مع الخلايا. اتبع تخطيط التكميلي الشكل 2.
- تشغيل البرنامج BuildExperimentalDesign.java تمرير كمعلمة المجلد الذي يحتوي على الملفات التي تم استخراجها في الخطوة 7.5.1 والملفات Results.csv من الخطوة 7.3. وينبغي أن تكون نتائج مجلدين أسم MM1_S وPtSample. أول تتضمن وصفا للآبار (المخدرات وتركيزات) لمراقبة إيجابية خط الخلية. والثاني يحتوي على نفس المعلومات، ولكن فيما يتعلق جزء من لوحة المصنف مع خلايا المريض.
- نسخ ملف Results.csv في كل من الدلائل التي تم إنشاؤها في الخطوة 7.5.3. تحميلبرنامج http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar وتشغيله باستخدام الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوات 7.5.3 لكل من المجلدات. ستكون النتيجة تقرير اسم المجلد في كل من المجلدات التي تم إنشاؤها في 7.5.3. المجلد تقرير يحتوي على جداول متعددة، ولكل مجموعة نتائج لدواء معين.
- تشغيل البرنامج BuildGraphPadFile.java وتمرير كمعلمة المجلد الذي يحتوي على الملفات التي تم استخراجها في الخطوة 7.5.1 والملفات Results.csv من الخطوة 7.3. ستكون النتيجة ملف graphpad تحتوي على منحنيات الاستجابة للجرعة لكل من 31 المخدرات، وتطبيع بواسطة عنصر التحكم. وسيتضمن كل مخطط 5 تركيزات الدواء للخلايا MM الابتدائية وتركيز واحد لمراقبة خط الخلية إيجابية.
5. إعداد المخدرات والتخدير من لوحات (باستخدام الروبوتية Pipettor)
6. التصوير من الخلايا في لوحة
ملاحظة: يتم تطبيق الإجراء أدناه لالمجهر Evos السيارات FL، ولكن يمكن أن تتكيف بسهولة مع غيرها من المجاهر مرحلة الآلية مع أعلى مقاعد البدلاء الحضانة أو المجاهر جزءا لا يتجزأ من الحاضنة.
7. الكمي من المخدرات الحساسية
ملاحظة: الإرشادات التالية ترشد استخدام تحليل الصور باستخدام مجموعة الكمبيوتر، لأن تحليل لوحة متعددة جيدا في جهاز كمبيوتر شخصي هو قتا طويلا جدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوصف تدفق التجربة لفترة وجيزة في الشكل 1 إذا تم الانتهاء من جميع الخطوات بنجاح، يجب أن الصور التي حصلت عليها المجهر معادلا إلى الشكل 2: يعيش خلايا MM ينبغي النظر بوضوح الأقراص كما مشرق وBMSCs أو HUVECs ينبغي أن يكون بالكاد مرئية وتوزع بشكل جيد في الخلفية. كما رأينا في الشكل 2A، خلايا MM تتراوح في حجمها من مريض إلى آخر، ولكن بشكل عام هم أصغر من خطوط الخلايا. لأنها عمليا لا تكرار السابقين فيفو خلال فترة التجربة (96 ساعة) التي يمكن المصنف في تركيزات أعلى (1-3 مليون خلية / مل). وينبغي أن يكون سدى بالكاد يمكن كشفها، كما BMSC تلتزم قاع البئر وتمتد، وتقديم الانظار. خط خلية الورم النقوي البشري H929 أكبر بكثير من الخلايا MM المستمدة من المريض (الشكل 2B)، ويكرر في غضون 24 ساعة. لمنع الازدحام من الصورة، خطوط الخلايا MM ويرىدائرة التنمية الاقتصادية أقل كثافة، 0.3 مليون / مل. أرقام 2C و 2D تمثل الخلايا المشتقة من المريض MM وخطوط الخلايا المايلوما الإنسان H929، على التوالي، وشارك في تربيتها مع HUVECS. HUVECS أولا التمسك قاع البئر ومن ثم البدء في الاتصال كل الشبكات الأخرى والشكل، والتي أصبحت في وقت لاحق شمعة سمكا ومع.
يجسد شخصية 4 ما هو متوقع من أشرطة الفيديو المجهزة التي تم إنشاؤها بواسطة خوارزمية تحليل الصور، والتي تبين الكشف عن خلايا MM الحية الملونة الزائفة باللون الأخضر (الشكل 4A) مع عدم وجود أو القليل جدا من إشارة خضراء في BMSCs وHUVECs في نهاية التجربة في تركيز الدواء أعلى، عندما تكون جميع الخلايا MM هي ميتة (الشكل 4B). البرنامج يجب تجميع النتائج من الآبار المختلفة، وبناء مخطط تصور فقدان تدريجي للبقاء مع مرور الوقت من التعرض لتركيزات المخدرات المختلفة (الشكل 4C). منحنى الاستجابة للجرعة للمراقبة خط الخلية (على سبيل المثال، H929 أو MM1.S) يجب أن تكون هي نفسها كما في التجارب السابقة؛ قد يشير انحرافات كبيرة مشاكل مع محلول المخزون من دواء يستخدم في التجربة.
من المهم أن نلاحظ بعناية جميع الآبار المصنف قبل البدء في عملية التصوير، والقطع الأثرية قد تضليل صورة برامج التحليل وتؤدي إلى نتائج خاطئة. على سبيل المثال، الشكل 5A يظهر نتيجة لكثافة كبيرة من BMSCs في البئر أو الكثير من الوقت المنقضي بين trypsinization والبذر، مما أدى إلى هذه الخلايا تشكيل كتل. يبين الشكل 5B "المستعمرات" الخلايا MM. إذا المصنف خطوط الخلايا بكثافات عالية، وسوف تشكل مستعمرات لأنها تكرار وهذا يقلل من دقة الخوارزمية تحليل الصور الرقمية ويصبح من الصعب على نحو متزايد أن نتبين خلية واحدة عن الأخرى. الشكل 5C مثال على العكس، حيث أيضا كان المصنف خلايا MM قليلة. تيله غالبا ما يحدث عندما يكون عدد الخلايا MM الحصول عليها من نضح نخاع العظم أقل من 500،000، و "حجم القتلى" اليسار في الأنبوب قبل إعادة تعليق ليصبح مماثلا لحجم وسائل الاعلام المطلوبة لاعادة تعليق الخلايا MM في كثافات عالية . لحل هذه المشكلة، وتحديد حجم القتلى لأنبوب المستخدمة وإدراجه في حسابات التخفيف. الشكل 5D مثال البؤري منحرفة. لاحظ كيف MM الخلايا على أعلى اليسار مشرقة وتلك الموجودة في أسفل اليمين مظلمة. ويتسبب هذا من قبل أنا وضعت بشكل غير متساو لوحة أو الهدف وضعت بشكل غير صحيح. وهذا سوف يسبب الخلايا MM في أجزاء مختلفة من الصورة ليتم احتساب مختلف. الحانات النطاق (أسفل اليمين من كل صورة) تمثل 500 ميكرون.
الشكل 1. بروتوكول صفا عاما. (A) خلال نخاع العظامث خزعة يتم الحصول على أنبوب واحد إضافي من نضح للبروتوكول. يتم فصل (B) المايلوما المتعددة (MM) الخلايا مغناطيسيا من الخلايا الأخرى في نضح. (C) ثلاثة أنابيب، تحتوي على خلايا MM (MM)، والخلايا غير MM، والبلازما، على التوالي، يتم الحصول عليها من عملية الفصل. (D) نخاع العظم المشتقة الخلايا الجذعية الوسيطة (BMSCs) من شفاطات السابقة هي شارك في تربيتها مع الخلايا التي تم الحصول عليها حديثا MM، وإعادة علقت في المصفوفة خارج الخلية (الكولاجين أو الغشاء القاعدي المصفوفة). (E) ونسج لوحة أسفل لضمان أكبر عدد ممكن من MM ممكن في نفس المستوى البؤري وBMSC على استعداد للانضمام إلى قاع البئر. يتم وضع لوحة في الحاضنة حتى تتصلب المصفوفة. يتم تعبئة (F) كل جيدا مع مزيج من وسائل الإعلام والثقافة، والبلازما المستمدة من المريض. يتم وضع لوحة في حاضنة O / N. وأضاف (G) المخدرات إلى كل بئر ويتم وضع لوحة في المجهرمزودة بكاميرا رقمية، مرحلة الآلية ومقاعد البدلاء الأعلى الحاضنة، وتصويرها على فترات منتظمة لمدة 96 ساعة. (H) وملفات الصور لكل بئر يتم تحليلها باستخدام خوارزمية قطاعات تعيش خلايا MM بناء على اقتراح غشاء (الملونة الخلايا الحية الزائفة باللون الأخضر) ويخلق جدول مع التغيرات في الخلوية لكل بئر لكل نقطة زمنية. شريط النطاق (أسفل اليمين) يمثل 500 ميكرون. (I) مجموعة A البرنامج الآبار التي كتبها المخدرات وتجمعات ويخلق جدول مع منحنيات الاستجابة للجرعة تطبيع بحيث التدابير الأولية هي 100٪. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. قبل ظهور المخدرات المتوقعة من الآبار. (A) خلايا MM شارك في تربيتها مع سدى. (B) خط خلية الورم النقوي البشري H929 المشارك مثقف مع سدى. (C) المريض المستمدة من الخلايا MM بالتعاون مع ثقافة HUVECS. المايلوما (D) الإنسان خط الخلية H929 بالتعاون مع ثقافة HUVECS. الحانات النطاق (أسفل اليمين من كل الشكل) تمثل 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. يوصى التوزيع المكاني للآبار في 384 لوحة جيدا. كل لوحة 384 جيدا يمكن أن تحمل 3 عينات المريض مع 7 الأدوية المختلفة، أو عينة واحدة المرضى اختبار مع 21 المخدرات. الآبار في الضوء الأخضر والأزرق الفاتح وتأن، تحتوي على خلايا MM من ثلاثة مرضى مختلفة. RX1، RX2، وما إلى ذلك، تمثل الأدوية المختلفة، كل في خمسة يخدع مختلفةcentrations ومكررة. وتستخدم أربعة آبار والضوابط لكل مريض (36-39 بالنسبة للمريض 1، 126-129 للمريض 2 و 200-203 للمريض 3). الآبار في البرتقال تحتوي على خطوط الخلايا في أعلى تركيز الدواء من كل دواء، في نسختين. آبار باللون الأصفر هي الضوابط خط الخلية (لا للمخدرات). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. مثال لتحليل الصور الرقمية والرسوم البيانية الاستجابة للجرعة. (A) خلايا MM بالتعاون مع ثقافة BMSCs، جزءا لا يتجزأ من الكولاجين الأول، تعرضت لتركيز 50 نانومتر carfilzomib. خوارزمية تحليل الصور بالكشف عن الخلايا الحية والزائفة الألوان منها باللون الأخضر. يتم الحصول على (B) الصور على فترات منتظمة لمدة التجربة. في هذا concentratiعلى المخدرات، وتقريبا كل الخلايا الميتة في نهاية 96 ساعة. (C) يظهر على الرسم البياني التغييرات في عدد من خلايا قابلة للحياة لمدة خمس تركيزات مختلفة من carfilzomib على طول انقطاع دام 96 ساعة، تطبيع للمرة = 0 ساعة الى 100٪. تم استخدام خط خلية الورم النقوي البشري MM1.S عن السيطرة لفعالية الدواء. الحانات النطاق (أسفل اليمين من A و B) تمثل 500 ميكرون. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. الأخطاء الشائعة أثناء البذر أو التصوير لوحة. (A) خلايا ستروما "متشابكة". (B) "المستعمرات" الخلايا MM. (C) خلايا MM قليلة جدا. (D) منحرفة البؤري. الحانات النطاق (أسفل اليمين من كل صورة) تمثل 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1. التوزيع المكاني الأمثل للآبار في 384 لوحة جيدا باستخدام pipettor الروبوتية. في هذا التكوين 31 أدوية مختلفة يمكن اختبارها في 5 تركيزات مختلفة و 2 مكررات (الخضراء). بالإضافة إلى ذلك، الضوابط الإيجابية مع خط خلية يمكن أن تستخدم لضمان فاعلية الدواء (وردي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
التكميلي الشكل 2. التوزيع المكاني لل عقار "لوحة رئيسية". وpipettor الروبوتية سوف تستخدم هذه اللوحة حيث تتضمن كل بئر واحدة من 31 المخدرات في 20x وتركيز، لخلق لوحة تخفيف المخدرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3. الترقيم الآبار لاستخدامها عند إعداد طبق من ذهب مع pipettor الروبوتية. البرنامج هو موضح في البروتوكول يتطلب هذا الترقيم من الآبار من أجل الخريطة بشكل كاف الآبار للأدوية وتركيزات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
/ftp_upload/53070/53070fig4sup.jpg "/>
خلفية المقارنة بين الشكل 4. شريحة ميكروفلويديك (خين وآخرون، 2014) والبروتوكول الحالي. الاستجابة للجرعة من H929 متعددة خط خلية الورم النقوي قياس لمدة 24 ساعة في النظام السابق (bortezomib أعلى اليسار، ملفلان اليسار الوسط) والنظام الحالي ( كبار bortezomib الصحيح وملفلان الصحيح المتوسطة). لأغراض المقارنة، كان LD50 على مدار 24 ساعة لكل المنابر 3.9 نانومتر و 4.1 نانومتر لbortezomib، و 6.4 ميكرومتر وميكرومتر 14.65 لملفلان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باختصار، هذا هو وسيلة قوية وعالية الإنتاجية لتحديد chemosensitivity الخلايا MM الابتدائية وخارج الحي الدوائية للأدوية في إعادة بناء نخاع العظم. الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي بذر السليم للآبار وتركز كافية (انظر الشكل 2 للنتائج المتوقعة): تأكد من أن الخلايا MM وانسجة تتوزع بشكل موحد، أن الخلايا اللحمية هي ملتصقة إلى قاع البئر، أن جميع MM الخلايا في نفس المستوى البؤري، وأن الخلايا MM لديها جانب من جوانب القرص مشرق تحيط بها حلقة مظلمة.
في حالة البذر غير لائق (انظر الشكل 5)، لا الاستمرار في التجربة، بل البذور لوحة ثانية. إذا اكتشفت المشكلة كان MM منخفضة أو عالية أو سدى كثافة الخلايا، والتحقق من تركيز الخلية في أنبوب قبل البذر و resuspend على فترات منتظمة أثناء عملية البذر لضمان توزيع متجانس من الخلايافي وسائل الإعلام. استخدام ماصة متعدد القنوات مع وظيفة مكرر أو موزع الروبوتية يمكن أن تقلل إلى حد كبير هذه المشكلة. سعت نسبة خلية / المصفوفة إلى وسائل الإعلام (1:10) المستخدمة في هذا الاختبار لزيادة عدد الآبار التي يمكن المصنف، وبالتالي الظروف دراستها. ومع ذلك، لدراسة العوامل القابلة للذوبان المنتجة أو المستهلكة من قبل الخلايا السرطانية أو سدى، فمن المستحسن أن نسبة خلية / مصفوفة لوسائل الإعلام أن تكون 1: 1.
كما تنفذ حاليا، وهذا النظام كميا فقط الخلايا غير ملتصقة. من أجل تحديد التغيرات في الخلوية من سدى سيحتاج البرنامج إلى تعديل وتعديلها لالخصائص المورفولوجية للسدى. وهذا من شأنه أن يكون ميزة مفيدة لدراسة تأثير الخلايا السرطانية أو المخدرات في المقصورة سدى. النظام المذكور هنا هو أيضا غير قادر على تحديد الخلوية للخلايا السرطانية ملتصقة، خصوصا إذا كانوا جنبا إلى جنب مع سدى ملتصقة. سيكون الحل تعديلات في ايماج الرقميةخوارزمية تحليل ه للفصل بين السرطان من سدى على أساس الخصائص المورفولوجية، أو إلى ما قبل احتضان إما السكان مع صبغة الفلورسنت التي يمكن استخدامها لتحديد الخلايا إما من السكان.
أهمية هذا البروتوكول بالمقارنة مع المناهج السابقة هي قدرة تقييم الاستجابة للدواء من الخلايا السرطانية الأولية في إعادة الإعمار خارج الحي من المكروية نخاع العظم بطريقة غير مدمرة، بحيث قياسات متسلسلة يمكن أن يتم، وبالتالي توفير أكثر تفصيلا معلومات للالدوائية، وليس في نقطة زمنية محددة. كان واحدا من القيود المفروضة على لدينا فحص مسبق 6 التدرج الخطي الناتجة عن انتشار المخدرات، التي تقييم حساسية العقاقير يسمح فقط ضمن إطار خطية من التركيزات. الفحص الحالي يسمح تقييم الجدوى عبر أي مجموعة من تركيزات الدواء، لأن كل بئر هو كيان مستقل. كلا المقايسات، ومع ذلك، تولد النتائج تعادل ( ومن بين التطبيقات المستقبلية متعددة من هذا النهج، وتركز مجموعتنا في استخدام النماذج الرياضية لاستقراء المعلومات الدوائية التي تقدمها هذه المقايسات في الاستجابة السريرية. لتحقيق هذا الهدف فإننا نقترح لتتناسب مع نقاط البيانات التي تم الحصول عليها (الشكل 4C) لكل دواء لنظام المعادلات التفاضلية، واصفا ديناميات موت الخلايا الناجم عن المخدرات. ثم، من خلال تطبيق هذه النماذج الرياضية الخصائص الدوائية المعروفة من كل دواء في نظام السريري، سيكون من الممكن تقدير الاستجابة الفعلية للمريض 6. من خلال أتمتة البذر والتخدير باستخدام نظام الروبوتية، سيكون من الممكن لاختبار مستوى ليس فقط المخدرات الرعاية، ولكن أيضا أكثر من مائة الأدوية التجريبية لكل عينة (في 1536 لوحة جيدا). وهذا من شأنه فتح إمكانية للسيليكون في التجارب السريرية، حيث يمكن اختبار المئات من الأدوية التجريبية فيأفواج من المرضى العينات، وبالتالي خلق منحنيات البقاء على قيد الحياة للتجارب السريرية الافتراضية 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل دولة بانكهد-كولي الفريق العلمي منحة ولاية فلوريدا (2BT03)، والمعاهد الوطنية لل/ المعهد الوطني للسرطان الصحة (1R21CA164322-01) ومركز موفيت للسرطان علوم فريق غرانت. وقد تم دعم هذا العمل في جزء من مرفق بالحركة البحوث الأساسية في لي موفيت للسرطان ومعهد بحوث H.، وهو مركز السرطان الشامل NCI المعينة (P30-CA076292). تم الحصول على الخلايا الأولية ممكن من خلال بروتوكول رعاية مرضى السرطان إجمالي في مركز موفيت للسرطان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVOS FL AUTO | AMG | AMAFD1000 + AMC1000 | Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator. |
| 384-well plate CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid |
| 1,536-well plate CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood. |
| CD138 magnetic beads | Miltenyi | 130-051-301 | Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells. |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | Column for separation of cells. |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | Magnet for separation column. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC ) |
| RPMI-1640 media | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red |
| FBS Heat inactivated | GIBCO | 10082-147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| 3.1 mg/ml Bovine collagen type I | Advanced Biomatrix | 5005-B | Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 | Robotic pipettor system |
References
- Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
- Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
- Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
- Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
- Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
- Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
- Scott, J.
