Introduction
בניגוד לתרבויות 2D רגיל, מודלים פונדקאית תרבית תאים 3D לאפשר לחקר התנהגות תא אפיתל בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, אחד הדומה רקמות. תרבויות 3D של בלוטת החלב סייעו להבהיר היבטים רבים של התפתחות בלוטת חלב וגידולים. עם זאת, רוב דגמי תרבות 3D הזמינים כרגע אינם מתאימים ללמוד פעולת הורמון משום שורות התאים אנושי אפיתל המשמשים את המשימה חסרות ביטוי קולטן הורמון 6,7,9.
בזאת, אנו מתארות מודל התרבות 3D של האפיתל השד האנושי כי הוא מתאים ללמוד פעולת הורמון 12. מודל זה עושה שימוש שורת תאי אפיתל שד אדם הורמון מגיבים הזמין המסחרית, T47D 3,11,13, אשר הופקו במקור מתוך תפליט פלאורלי המתקבל מטופלת בת 54 עם קרצינומה ductal הסתננות של שד. אנו משתמשים קולגן זנב חולדה סוג 1 כמטריצה. פולחן 3D זהמודל יור מתאים לחקר הפעולה של שלושה הורמונים mammotropic הראשי (אסטרדיול, promegestone (אנלוגי של פרוגסטרון), ופרולקטין) על תאי אפיתל שד אנושיים. הורמון נגרם מורפולוגיה אפיתל ניתן להעריך כמותית לאורך זמן על ידי ניתוח morphometric 12.
צפיפות זריעה מתאימה מאפשרת תרבויות 3D אלה כדי להישמר במשך 2 שבועות. בשלב זה, את הפיתוח של מבנים מספיק הערכה כמותית חזקה פעולת הורמון על מורפולוגיה אפיתל. ג'לים ניתן לקצור גם בנקודות זמן קודמות עבור התפשטות תאים ביטוי גנים מנתח. בנוסף, מודל זה מתאים כדי לבחון את ההשפעה של טיפול הורמונלי רציף; למשל, לאחר הטיפול עם אסטרדיול בשבוע והחלפת הראשון עם / שילוב הורמונים אחרים של הורמונים במהלך השבוע הבא. השפעת תרכובות antiestrogens אסטרוגניים, כגון ICI 182,780, יכול גם להיות סטומת באמצעות מודל התרבות 3D זה 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים
- ממס את promegestone progestagen הסינטטי (R5020) ו -17 β-אסטרדיול (E2) באתנול לעשות 10 פתרונות מניות -3 M. ממיסים פרולקטין מים ללא יונים מזוקקים כדי להפוך פתרון מניות 1 מ"ג / מ"ל. ממיסים את antiestrogen ICI 182,780 ב DMSO להכין פתרון המניה 10 -2 M. אחסן הפתרונות הללו ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
- dextran הפחם (CD) הפשיט בסרום ובינוני CDFBS:
- מחממים להשבית בסרום שור העובר (FBS) באמבט מים 57 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
הערה: השתמש רק זכוכית חומצת שטף לשארית בפרוטוקול זה. - לחשב את כמות פחם צורך. תוך שימוש בנפח 10% יותר מהסכום של בסרום כדי לפצות על עקירה הנגרמת על ידי פחם, לשקול wt / כרך 5% מופעל אבקת פחם.
- לשטוף פחם פעמיים עם מים מזוקקים deionized קר באמצעות באותו נפח כסכום בסרום. עבור כל ג לשטוףentrifuge ב 50 XG במשך 2 דקות עד גלולת הפחם. הסר את המים בין שוטף. הוסף 0.5% wt / כרך Dextran T-70 של גלולת הפחם האחרון. Re- להשעות עם מזוקקים, מים ללא יונים צנטריפוגות ב 100 XG במשך 5 דקות. לשאוב את המים.
- להוסיף נפח מתאים של סרום על גלולה מחדש להשעות גלולה dextran פחם לתוך בסרום. דגירה, תוך גלגול (6 סל"ד), ב 37 ºC למשך 60 דקות. צנטריפוגה XG ב 2000 עבור 20 דקות. אם supernatant מופיע מעונן, חזור צנטריפוגה; עם זאת, סרום לא יכול להיות ברור לחלוטין בשלב זה, אך ינוקו במהלך סינון.
- סינון דרך מסנן 0.80 מיקרון ואז שוב דרך פילטר 0.45 מיקרון להסיר חומר חלקיקים גדולים. לבסוף, לסנן לעקר עם מסנן 0.20 מיקרון. חנות מסוננת CDFBS במבחנות או T-25 צלוחיות תרבות ב -20 ºC.
- פחם Dextran Stripped שור עוברי המכיל תקשורת (מדיה CDFBS): לערבב 375 מיליליטר של DMEM האדום ללא פנול 125 מיליליטר של DMEM/ F-12. הסר 37.5 מ"ל ולהחליפה נפח זהה של בסרום שור עוברית Stripped פחם Dextran. הוסף 10 6 U / ml פניצילין L- גלוטמין לריכוז 2 מ"מ הסופי. התקשורת וכתוצאה מכך הוא 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7.5% פחם dextran הפשיטו FBS, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו -10 6 U / פניצילין מ"ל.
- מחממים להשבית בסרום שור העובר (FBS) באמבט מים 57 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- כן PBS 10X, 1N NaOH ומי deionized מזוקקים. הכינו מספיק נפח של כל בהתאם להיקף של פתרון קולגן הצורך. לעקר את כל הפתרונות על ידי סינון. אחסנו את 10x PBS ומי deionized מזוקקים סטריליים על 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש. אין לאחסן פתרון 1N NaOH.
- כן פתרון קולגן בריכוז 1 מ"ג / מיליליטר סופי לפי פרוטוקול עבור "נוהל gelation חלופי כי אני קולגן, זנב עכברוש" המסופק על ידי יצרן. ג'ל כל גרם של 1.5 מ"ל של תמיסת קולגן. לדוגמה, להכין 18.5 מ"ל (0.5 מ"ל לתת דין וחשבון על אובדן במהלך pipetting) של פתרון קולגן להכין12 ג'לים. השתמש פתרון קולגן מייד או להיאחז קרח עד 2-3 שעות.
- קרמיין אלום לצבוע:
- שלב 1 גרם קרמיין סולפט אלומיניום אשלגן 2.5 גרם ב 500 מ"ל מים מזוקקים. מרתיחים תוך ערבוב במשך 20 דקות. צפה בזהירות כדי למנוע רותחים מעל. התאם נפח סופי חזרה 500 מ"ל מים מזוקקים נוספים.
- הוספת קריסטל של תימול לפעילות מיקרוביאלית ולכסות בקבוק עם רדיד אלומיניום על מנת להגן מפני אור. סינון דרך מסנן נייר דירוג מעבדה לפני כל שימוש. שימוש חוזר הפתרון הארגמן לתקופה של עד שלושה חודשים. חנות ב RT, מוגן מפני אור.
- פתרון Collagenase: לפזר את collagenase במדיום DMEM / F12 בריכוז של 0.125% w / v. אין לאחסן את הפתרון הזה.
2. תאים 3D תרבות של T47D ב זנב עכברוש קולגן מסוג 1 ג'לים וטיפול הורמונלי
הערה: לשמור טפטפות סרולוגיות סטרילי וטיפים פיפטה ב 4 ° C..
- Prepaמחדש השעית תא בודד ולבצע ספירת תאים. בתרביות תאים פיצול T47D לפני שהם מגיעים למפגש 70%. צנטריפוגה נפח המכיל כמות התאים הדרושים. יחשוב על זה ג'ל אחד צריך להכיל כ 75,000 T47D תאים.
- באמצעות הגלולה קרה-פיפטה, מחדש להשעות את תא הנפח המתאים של קולגן. תחשוב על זה כל ג'ל מורכב 1.5 מיליליטר של קולגן. מערבבים את התאים ואת קולגן בעדינות כדי למנוע החדרת בועות.
- כדי למנוע את ההשפעה של חשמל סטטי על חלוקת תא, לצחצח את הגבולות, העליון והתחתון של צלחת 12-היטב עם מברשת חשמל סטטי הפחתה לאחר להוריד את הכיסוי מעל הצלחת. כדי למנוע הצטברות חשמל סטטי במהלך מגע עם משטח עבודה של מכסה המנוע, להציב צלחת זו על גבי זו צלחת 12-היטב (צלחת ריקה) כי גם כבר מוברש עם brush.Gently מפחיתי סטטי, יוצקים 1.5 מ"ל של תערובת לבאר כל צלחת 12-היטב.
- מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הסר הצלחת דואר מהחממה ולמקם אותו בחזרה על מכסה המנוע.
- בעזרת קצה p200 סטרילית, לנתק את ג'ל בזהירות בתנועה מעגלית עדינה מגבול הבאר. הג'ל צריך גם לנתק מתחתית הבאר.
- לדלל הורמונים במדיה CDFBS שיתווספו הבארות. השתמש E2 ו- R5020 בריכוז ופרולקטין הסופי 10 -10 M בכל ב- 10 -7 M הריכוז הסופי. כפי בקרה, שימוש במדיה CDFBS ללא הורמונים הוסיפו אך עדיין מכיל את הנפח הגבוה ביותר של DMSO השווה מניות הורמון המשמש. ודא כי כל טוב מכיל 1.5 מ"ל של התקשורת. מניחים את תרבויות 3D בתוך 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 100% לחות רקמת תרבות חממה. שמירה על תרבויות עבור 1 או 2 שבועות, שינוי התקשורת כל 2 ימים.
3. עיבוד ג'ל Mounts הפריטים
- הסר מדיה התרבות ולהוסיף 1.5 מ"ל של PBS היטב כל אחד.
- מעבירים את הג'ל על שקופית. חותך את ג'ל לשניים באמצעות עקומהלהב כירורגי ד. המשך עיבוד עם חצי אחד ולשמור את החצי השני לניתוח היסטולוגית.
- מעבירים את הג'ל וחצי הר שלם לשקופית. תן יבש ג'ל למשך 5 דקות ולאחר מכן להעביר את השקופית בצנצנת coplin המכיל פורמלין 10%.
הערה: כל incubations צריך להיעשות ב RT. - תקן ג'לים בצנצנת coplin על N / שייקר O.
- לשטוף מחליק פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד על שייקר. העברת שקופיות 70% EtOH; דגירה במשך שעה 1 על שייקר. מגלשות העברת קרמיין אלום O / N.
- למחרת, מייבשים שקופיות על שייקר ב 70% EtOH, 95% EtOH ו 100% EtOH עבור שעה 1 כל אחד. העברת שקופיות קסילן פעמיים במשך שעה 1 כל ולשמור על שייקר. השתמש הרכבה בינונית מבוססי טולואן לעלות הג'לים coverslips עבה 1.5 מ"מ.
- בדוק mounts כל תחת אור רגיל (מיקרוסקופ או סטריאוסקופ). לניתוח מפורט יותר של הצורה לומן להשתמש במיקרוסקופ confocal ולדמיין לצבוע קרמיין עם לייזר ננומטר 633 HeNe.
4. עיבוד ג'ל עיבוד עבור ניתוח היסטולוגיה
- מעבירים את החצי הנותר של הג'ל על בקבוקון זכוכית 20 מ"ל המכיל 10% פורמלין ולתקן על שייקר O / N.
- לשטוף ג'לי פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד על שייקר. ג'לי מקום לתוך קלטות עיבוד להטבעת פרפין.
- ג'לים העברת 70% EtOH, דגירה במשך שעה 1 ופעל עם 95% EtOH עבור שעה 1, לשנות כדי EtOH 95% טרי עבור שעה 1, 100% EtOH עבור שעה 1, ולשנות כדי EtOH 100% טרי 1 שעה. בשלב זה, ניתן לאחסן ג'לים 100% EtOH O / N ב RT או מודגרות עם קסילן במשך שעה 1 ולאחר מכן שוב קסילן טרי 1 hr.
- קלטות העברה פרפין עבור שעה 1 ב 60 מעלות צלזיוס חממה ואקום, לחזור עם פרפין טרי עוד פעמיים.
- מלאו תבניות פלסטיק עם פרפין נקי. פתח את הקלטת, להסיר את הג'ל ומניחים אותו בתוך פרפין המכיל עובש פלסטיק. להתמלא פרפין ולהוסיף גבי קלטת שמע ובה התווית על גבי ולתת בלוק מגניב.
- הסר את plastעובש סעיף ic הבלוק באמצעות microtome. השג 5 אממ חלקים עבים כי הוא מכתים immunocytochemistry.
הפקת 5. של תאי תאי ג'לים באמצעות טיפול Collagenase
- הסר ג'ל מהבאר ולהעביר אותו בצלחת פטרי המכילות PBS. בקצרה ג'ל שטיפה.
- מעבירים את הג'ל על שפופרת 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של collagenase 0.125%. פיפטה למעלה ולמטה 4-5 פעמים כדי לשבור את הג'ל לחתיכות קטנות.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות (עד נמס ג'ל התאים בתרחיף)
- הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות בתוספת סרום. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה (1,000 XG, 5 דק '), supernatant שנזרקו, מחדש להשעות תאים ולספור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מסכם את הליך הכנת תרבויות 3D רגיש להורמון. מבנים אפיתל הם נצפו mounts שלם של ג'לים בתרבית למשך 2 שבועות בנוכחות E2 לבד או ביחד עם הורמונים אחרים. רק תאים בודדים או קבוצות של 2-3 תאים נוכחים כשאף הורמונים מתווספים עד בינוני תרבות (בינוני CDFBS) (איור 2). מצב זה משמש כביקורת שלילית.
תאים במבני טופס תרבות 3D שמשתנים צורה, גודל, ונוכחות לומן. חלוקת המבנים בתוך הג'ל היא בדרך כלל הטרוגנית. כפי שהוצג קודם, יש בדרך כלל יותר מבנים לאורך הגבולות של הג'ל מאשר לראות במרכז 4. בגלל ההטרוגניות המרחבית, השוואות בין דגימות צריכות להיות מוגבלות מקביל אזורים ברחבי דגימות.
המין שממנו קולגן מסוג 1 נגזר משפיע על הפנוטיפאיכות nd של 5 מבנים אפיתל שהתקבלו. סוג קולגן זנב עכברוש 1, כפי שמוצג כאן, נבחר מאז הזריעה בסוג קולגן שור 1 הביא להיווצרות קבוצות תאים מאורגנות (איור 3).
ניתוח המפורט של המבנים אפיתל יכול להיות מושג באמצעות מיקרוסקופיה confocal (איור 4). תוצאות טיפול E2 במבנים מעוגלים מוארכים (איור 4 א). הנוכחות של E2 ותוצאות פרולקטין יותר מבנים ניצני (איור 4B), בעוד שנוכחות E2 ותוצאות promegestone במבנים לא סדירים עם תחזיות הסלולר מזכירות צדדית המסתעפים (4C איור). E2 לבד E2 בתוספת פרולקטין לעבות מבנים רקמות כאשר נמדד על ידי צמיחת-בכיוון z, וכאשר בהשוואה לאלה שנצפו E2 בתוספת promegestone.
על מנת לכמת את מספר הסלולרי אחרי טיפול הורמונלי, התאים הם extracte ד מן הג'ל באמצעות טיפול collagenase. לדוגמה, באמצעות שיטה זו אנו יכולים ללמוד כיצד antiestrogen ICI 182,780 מעכב את ההשפעה של E2 על התפשטות תאים בתרבויות 3D (איור 5).
באיור 1. נוהל לעריכת תרבויות 3D הורמון רגיש. בקצרה, השעית תא בודד של תאי T47D הוא מעורבב עם סוג קולגן זנב עכברוש 1 ושפך לתוך בארות של צלחת 12-היטב. הג'לים מותר להקפיא למשך 30 דקות בתוך חממה CO2% 37 ° C / 5. בינוני תרבות הוא הוסיף את הג'לים מנותקים מן הבאר. ניתן לקצור תרבויות אחרי שבועות 1 או 2 על פי נקודת הסיום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.within-page = "1"> 
. איור 2. mounts שלמים של תרבויות 3D לאחר צביעה עם קרמיין אלום לצבוע (א) הר שלם של חצי ג'ל מוכתם אלום ארגמן לחזות המבנים אפיתל, דוגמה ROI לניתוח מורפולוגיה מסומנת באמצעות תיבת; WM של תרבויות 3D גדל במשך 2 שבועות (ב ') CDFBS תקשורת (ללא הורמונים אינו במקור) ו- (ג) CDFBS תקשורת השלים עם E2 ופרולקטין. ברים סולם הם 5,000 מיקרומטר (א) ו 500 מיקרומטר (B & C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. השוואה של מטריצות המשמשות בתרבות 3D. (א) Bovi ne קולגן מסוג 1 תוצאות באשכולות לא מאורגן של תאים, להבדיל את המבנה הסדור (B) נצפתה כאשר באמצעות עכברוש זנב קולגן מסוג 1. סרגל קנה מידה:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונות איור 4. Confocal של מבני T47D שנצפו ג'ל קולגן 3-D לאחר 2 שבועות. הטיפול ב- (א) E2, (B) E2 + פרולקטין ו- (ג) E2 + R5020. חצים להצביע על תחזיות cytoplasmic. עובי של מבנים אפיתל היה 24, 40 ו -20 מיקרומטר בהתאמה. סרגל קנה מידה:. 40 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
s = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> 
איור 5. תרבויות 3D שטופלו או E2 לבד או E2 בתוספת ICI 182,780 עבור 1 בשבוע. ספירת תאים לאחר מיצוי התא באמצעות טיפול collagenase. (א) CDFBS בינוני, (B) CDFBS בינוני פלוס E2 ב 1x10 -10 M, (C) ICI 182,780 ב 1x10 -8 M בתוספת E2 ב 1x10 -10 M ו- (ד) ICI 182,780 ב 1x 10-7 M בתוספת E2 ב 1x10 -10 מ ' ברים:. SEM אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מעריכים מאוד את תרומתם העריכה על ידי שריל Schaeberle. מחקר זה מומן על ידי Avon מענקים # 02-2009-093 ו 02-2011-095, ו NIEHS / NIH ES 08,314 ל AMS. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה או מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325 (2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
- Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
- Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
- Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
- Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
- Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
- Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
- Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).
