Abstract
تعصيب يلعب دورا رئيسيا في تطوير والتوازن وتجديد الأعضاء والأنسجة. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء هذه الظواهر ليست مفهومة جيدا حتى الآن. على وجه الخصوص، وإهمال دور تعصيب في نمو الأسنان والتجدد.
قدمت عدة الدراسات المجراة على معلومات هامة حول أنماط تعصيب من أنسجة الأسنان خلال عمليات التنمية وإصلاح مختلف النماذج الحيوانية. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب ليست الأمثل لتسليط الضوء على الأساس الجزيئي للتفاعلات بين الألياف العصبية والأجهزة المستهدفة والأنسجة.
المشترك الثقافات تشكل وسيلة قيمة للتحقيق والتعامل مع التفاعلات بين الألياف العصبية والأسنان في بيئة تسيطر عليها والمعزولة. في العقود الأخيرة، وقد أجريت التقليدية المشترك الثقافات باستخدام نفس مستنبت لفترات قصيرة جدا (على سبيل المثال، يومين)للتحقيق في الآثار جذابة أو مثيرة للاشمئزاز لتطوير أنسجة الفم والأسنان على الألياف العصبية الحسية. ومع ذلك، لا بد من تمديد فترة ثقافة للتحقيق في آثار تعصيب على التشكل الأسنان وتمايز خلوي.
نظم على microfluidics تسمح المشترك الثقافات من الخلايا العصبية وأنواع مختلفة من الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة المناسب لها. لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن العقد الثلاثي التوائم (TG) والأسنان قادرين على البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة من الزمن عندما شارك في تربيتها في أجهزة ميكروفلويديك، وأنها تحافظ في هذه الظروف نمط تعصيب نفسه أنها تظهر في الجسم الحي.
على هذا الأساس، نحن تصف كيفية عزل ويصف التعاون ثقافة تطوير مثلث التوائم العقد والأسنان الجراثيم في البروتوكول ميكروفلويديك شارك في الثقافة system.This وسيلة بسيطة ومرنة للمشاركة في ثقافة العقد / الأعصاب والأنسجة المستهدفة ودراسة الأدوار من جزيئات محددة بشأن هذه التفاعلات في مقاولاتolled وبيئة معزولة.
Introduction
تعصيب يلعب دورا رئيسيا في تطوير والتوازن وتجديد الأعضاء والأنسجة 1،2. وعلاوة على ذلك، تشارك تعصيب في تنظيم تكاثر الخلايا الجذعية، وتعبئة والتمايز 3-5. في الواقع، أظهرت الدراسات الأخيرة التي تحققت في أنسجة مجمع فموي وجهي أن الأعصاب الحركية ضرورية لالظهارية وظيفة الخلايا الاصلية خلال تطوير وتجديد اللعابية الغدد 6،7. وبالمثل، فقد ثبت أن تعصيب ضروري لتطوير وصيانة براعم الذوق 8-11. وبالتالي، فمن المهم تحليل الأدوار إلا أنها مهملة من تعصيب في تطوير أجهزة فموي وجهي الهامة الأخرى والأنسجة مثل الأسنان.
على الرغم من تعصيب غنية من أسنان الكبار، وعلى النقيض من جميع الأعضاء والأنسجة الأخرى في الجسم، develoالأسنان بينغ تبدأ في أن معصب في المراحل الأولى بعد الولادة. تنشأ الأسنان نتيجة للتفاعلات متسلسلة ومتبادلة بين الأديم الظاهر عن طريق الفم والجمجمة العصبية المشتقة من قمة اللحمة المتوسطة. هذه التفاعلات تؤدي إلى خلايا تكوين المينا المستمدة الظهارية والخلايا المولدة للعاج المستمدة من اللحمة المتوسطة التي هي المسؤولة عن تشكيل المينا وعاج الأسنان، على التوالي 12. الأعصاب الحسية من العقد مثلث التوائم والأعصاب متعاطفة من العقد عنق الرحم متفوقة يعصب أسنان البالغين 13-15. خلال مرحلة التطور الجنيني، الألياف العصبية المنبثقة عن مشروع العقد الثلاثي التوائم نحو جراثيم الأسنان النامية وتدريجيا تحيط بهم ولكنها لا تخترق حليمة اللحمة المتوسطة طب الأسنان (13). الألياف العصبية تدخل اللب اللحمة المتوسطة الأسنان في مراحل نمو أكثر تقدما التي ترتبط مع التمايز مصورات العاج وعاج مصفوفة ترسب 16. لب الأسنان تعصيب هو COMPLeted قريبا بعد بزوغ الأسنان في تجويف الفم (13). وقد كشفت الدراسات السابقة بأن مختلف semaphorins وneurotrophins يشاركون في تنظيم تعصيب أثناء تكون السن 16-19. وقد أثبتت دراسات سابقة بوضوح أن تعصيب هو شرط أساسي لتكوين الأسنان في الأسماك 20. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن توازن الخلايا الجذعية اللحمة المتوسطة الأسنان في القواطع الماوس ينظمه الأعصاب الحسية عن طريق إفراز القنفذ سونيك (SHH) 21. ومع ذلك، فإن دور تعصيب في السن بدء وتطوير وتجديد لا يزال مثيرا للجدل في الثدييات 22-24.
وقد قدم عدد كبير من الدراسات المجراة على معلومات هامة حول أنماط تعصيب من أنسجة الأسنان خلال عمليات التنمية وإصلاح مختلف النماذج الحيوانية 13،25،26. ومع ذلك، فإن معظم هذه APPROأوجاع ليست الأمثل لتسليط الضوء على الأساس الجزيئي للتفاعلات بين الألياف العصبية والأجهزة المستهدفة والأنسجة. المشترك الثقافات تشكل وسيلة قيمة للتحقيق والتعامل مع التفاعلات بين الألياف العصبية والأسنان في بيئة تسيطر عليها والمعزولة 26-29. في الوقت نفسه، وشارك في زراعة تخضع لتعديلات فنية مختلفة. على سبيل المثال، الأعصاب والأنسجة الأسنان محددة (على سبيل المثال، لب الأسنان، جريب الأسنان، طب الأسنان ظهارة) غالبا ما تتطلب ثقافة وسائل الإعلام المختلفة من أجل ضمان بقاء الأنسجة لفترات طويلة من الزمن 30-32.
في العقود الأخيرة، وقد أجريت التقليدية المشترك الثقافات باستخدام نفس مستنبت لفترات قصيرة جدا (على سبيل المثال، يومين) للتحقيق في الآثار جذابة أو مثيرة للاشمئزاز لتطوير أنسجة الفم والأسنان على الألياف العصبية الحسية 27-29.ومع ذلك، لا بد من تمديد فترة ثقافة للتحقيق في آثار تعصيب على التشكل الأسنان وتمايز خلوي، ودراسة ديناميات الألياف العصبية المتفرعة داخل الأجهزة المستهدفة. ولذلك، فإن غير متجاورة المشترك الثقافات يكون أكثر ملاءمة لإجراء دراسات على الخلايا العصبية الأسنان الأنسجة التفاعلات.
نظم على microfluidics تسمح المشترك الثقافات من الخلايا العصبية وأنواع مختلفة من الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة المناسب لها. في هذه الأجهزة، يتم فصل الأنسجة الأسنان والخلايا العصبية في أماكن مختلفة، بينما يسمح للنمو من المحاور من أجسام الخلايا العصبية من خلال microchannels نحو مقصورة تحتوي على الأنسجة المستهدفة 33. تم الأجهزة ميكروفلويديك تستخدم بالفعل لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة 34،35، فضلا عن الخلية إلى التفاعلات الخلية في سرطان واتساع الأوعية الدموية 35. وعلاوة على ذلك، وقد استخدمت هذه الأنظمة لدراسة التفاعلات بين DORSآل العقد الجذرية وبانيات 36.
لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن العقد الثلاثي التوائم (TG) والأسنان قادرين على البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة من الزمن عندما شارك في تربيتها في أجهزة ميكروفلويديك 37. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن الأسنان من مراحل تنموية مختلفة الحفاظ في هذه الظروف في المختبر نفس الآثار مثير للاشمئزاز أو جذابة على تعصيب مثلث التوائم أنها تظهر في الجسم الحي 37. وينص هذا البروتوكول على معلومات حول طريقة بسيطة وقوية ومرنة للمشاركة في ثقافة العقد / الأعصاب والأنسجة المستهدفة ودراسة دور جزيئات محددة بشأن هذه التفاعلات في بيئة تسيطر عليها والمعزولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
واستمرت كل الفئران والتعامل معها وفقا لقانون رعاية الحيوان السويسري وامتثالا لتعليمات مكتب كانتون البيطرية، زيورخ.
1. إعداد تشريح المواد، الثقافة وسائل الإعلام، أجهزة ميكروفلويديك
- الأوتوكلاف ملقط تشريح الصغرى والمقص (121 ° C، التعقيم الوقت: 20 دقيقة) وتخزينها في حاوية معقمة.
- تعقيم coverslips الزجاج (24 ملم × 24 ملم) التي يحتضنها منهم في 1 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 24 ساعة على شاكر المداري عند 37 درجة مئوية. غسلها ثلاث مرات مع معقم، المقطر H 2 O وثلاث مرات مع الإيثانول 99٪. جاف ثم لل coverslips عند 37 درجة مئوية أو تحت غطاء تدفق العقيمة. أخيرا، الأوتوكلاف أو فضح لل coverslips للأشعة فوق البنفسجية (30 دقيقة) لإتمام عملية التعقيم. ويمكن بعد ذلك أن يتم تخزين Coverslips في الايثانول 70٪.
- إزالة بعناية الأجهزة عزل AXIS أكسون من الحزمة باستخدام ملقط معقم ووضعها في طبق بتري معقمة. عن طريق خزعة لكمة معقمة (ø: 1MM) خلق ثقب واحد لكل عينة من زراعتها (الشكل 1) في المراسلات الدوائر الثقافة.
ملاحظة: لا لكمة قريبة جدا من microgrooves، لأنها قد تكون تضررت من الضغوط التي مورست. - تعقيم الأجهزة عزل AXIS أكسون التي كتبها immerging لهم في الايثانول 70٪. ثم الجافة الأجهزة عزل AXIS أكسون وcoverslips تماما تحت غطاء تدفق العقيمة. الانتظار لمدة لا تقل عن 3 ساعات قبل المتابعة.
ملاحظة: تجفيف ناقصة ستؤدي إلى التجمع على عيب من الأجهزة ميكروفلويديك. - وضع كل ساترة إلى 35 مم طبق بتري أو في بئر داخل لوحة 6 آبار.
- وضع AXIS أكسون عزل الأجهزة على ساترة واضغط بلطف ولكن بحزم مع ملقط مع نهايات عازمة من أجل السماح للالتصاق كامل بين الجهاز العزلة وساترة الزجاج.
- في كل غرفة الثقافة، ماصة 150 ميكرولتر من بولي-D-ليسين (0.1 ملغ / مل في العقيمة، المقطر H 2O). وضع أجهزة ميكروفلويديك في ظل فراغ لمدة 5 دقائق، وذلك لإزالة كل الهواء من غرف الثقافة.
- ما إذا كان يمكن النظر إلى الهواء داخل الغرف وإعادة ماصة الحل بولي-D-يسين في غرف.
- احتضان الأجهزة مع O بولي-D-يسين / N عند 37 درجة مئوية.
- غسل غرف ثلاث مرات مع معقم، H المقطر 2 O.
- ملء الغرف مع 150 ميكرولتر حل العاملة laminin (سيغما الدريتش، 5 ميكروغرام / مل، في برنامج تلفزيوني أو المصل خالية المتوسطة)، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
- تجهيز 50 مل من المتوسط للثقافات العقد مثلث التوائم 37، تتألف على النحو التالي: 48 مل Neurobasal المتوسطة، 1 مل B-27، و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، 5 نانوغرام / مل عامل نمو الأعصاب (NGF) ، 12:25 السيتوزين الأرابينوزيد.
- تجهيز 50 مل من المتوسط للثقافات الجرثومية الأسنان 37، تتألف على النحو التالي: 40 مل DMEM-F12، 10 مل مصل بقري جنيني (FBS، التركيز النهائي: 20٪)، و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، 150 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك.
2. ماوس الجيل الأجنة والتشريح
- تحديد العمر الجنيني وفقا للسد عن طريق المهبل (المكونات المهبلية: يوم الجنينية للتنمية 0.5، E0.5) وتأكيد ذلك من خلال معايير شكلية. لهذا البروتوكول، ونحن عادة استخدام أجنة الفئران E14.5-E17.5.
- تنظيف المنطقة تشريح والمجسام مع الايثانول 70٪.
- تضحية الأم الحامل عبر خلع عنق الرحم. منع رقبة الفأر مع الإصبع الأول والثاني على الشبكة، وسحب لقرار الذيل.
- تشريح الجلد حول الجزء الأسفل من البطن، وفتح البطن باستخدام مقص. تحديد الرحم: خلال هذه المراحل المتأخرة من الحمل، والرحم تملأ تماما تجويف البطن.
- تشريح خارج الرحم ووضعه في أنبوب مملوء PBS على الجليد. عندما على الجليد، والأنسجة يمكن أن تترك لعدة ساعة. تجاهل جثة الأم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية <لى> تشريح خارج الأجنة من الرحم وتحريرهم من أنسجتها خارج الجنين. وضع الأجنة في برنامج تلفزيوني على الجليد.
- قطع رأس الأجنة باستخدام مقص، وفصل الفك السفلي عن بقية الرأس باستخدام مقص تشريح الصغيرة (الشكل 2A). إزالة بالضبط الفك السفلي، دون الإضرار العقد مثلث التوائم. كما يتم ترجمة هذا الأخير على مقربة من الفك السفلي، والضرر العرضي هو ممكن. الحفاظ على الفك السفلي وبقية الرأس في برنامج تلفزيوني الباردة، على الجليد.
- لتشريح TG، واتخاذ الرأس وضعه على طبق بتري الزجاج تشريح، وشغل سابقا مع PBS الباردة. باستخدام ملقط، إزالة الجلد والجمجمة. إزالة ثم الدماغ الانتهائي والمخيخ عن طريق وضع ملقط تحت الدماغ الانتهائي ورفع. فإن الدماغ الانتهائي والمخيخ الوجه معا، وترك الجزء السفلي من الجمجمة المكشوفة.
- توطين العقد الثلاثي التوائم (كما هو موضح في الشكل 2B). استخدام ملقطلفصل TG من الأعصاب مثلث التوائم. القضاء على ما تبقى من التوقعات مثلث التوائم باستخدام الإبر تشريح كما السكاكين. وضع TG تشريح في طبق بتري مليئة PBS الباردة والاحتفاظ بها على الجليد.
- لتشريح الأسنان الجنينية، ووضع الفك السفلي، وفصلها في السابق من الجمجمة، وعلى الزجاج تشريح طبق بتري، مليئة PBS الباردة. استخدام الإبر تشريح كما السكاكين، وإزالة اللسان والجلد المحيط بها الفك. فصل اليسار واليمين بين فكي هيمي عن طريق قطع على طول خط الوسط من الفك. جراثيم الأسنان مرئية بسهولة، كما هو مبين في الشكل 1C. عزل جراثيم الأسنان باستخدام الإبر تشريح وإزالة الزائد من الأنسجة غير الأسنان. وضع جراثيم الأسنان تشريح في طبق بتري مليئة PBS الباردة والاحتفاظ بها على الجليد.
3. ميكروفلويديك المشارك الثقافات
- بعد التشريح، وإزالة laminin من الأجهزة ميكروفلويديك. ملء الغرف مع 200 ميكرولتر من respectiلقد سائل الإعلام.
- بالملقط، ونقل بلطف تشريح TG والأسنان الجراثيم في الثقوب التي أنشأتها اللكم (1D الشكل). تأكد من أن الجراثيم الأسنان لا تطفو وأنها تغرق حتى الاتصال لل coverslips.
- ثقافة العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- تغيير ثقافة المتوسط كل 48 ساعة. لا إفراغ غرف تماما، ولا ماصة مباشرة إلى غرف الثقافة. تفريغ كامل للغرف شأنه أن يؤدي إلى تشكيل فقاعات الهواء داخل غرف. سوف pipetting لمباشرة الى غرفة يؤدي إلى تلف المحاور. لتجنب هذه المشاكل، وإزالة المتوسطة مشيرا ماصة نحو الجانب الخارجي من الآبار. وبالمثل، ماصة متوسطة جديدة إلى جانب الآبار الواقعة قبالة الدوائر.
- خلال الفترة الثقافة والثقافات شارك ويمكن تصويرها بسهولة عن طريق الوقت الفاصل بين المجهري. يمكن الحفاظ المشترك الثقافات لأكثر من 10 يوما.
- بعد اللثة الثقافةد، وغسل الدوائر من قبل pipetting 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في بئر واحدة لكل غرفة، والسماح PBS تتدفق من خلال الدوائر الثلاث مرات.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإصلاح عينات من قبل pipetting 150 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ (في برنامج تلفزيوني) في بئر واحدة لكل غرفة. في احتضان RT لمدة 15 دقيقة.
- غسل الدوائر مرتين مع PBS كما هو موضح في 3.6.
- المضي قدما في مزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتشير هذه النتائج إلى أن العقد الثلاثي التوائم معزولة يمكن أن تنمو في حجرة واحدة من الجهاز ميكروفلويديك وبالإضافة إلى ذلك، أن تطور جراثيم الأسنان معزولة وتدوم لفترة طويلة من الوقت في حجرة أخرى من الجهاز ميكروفلويديك. وتستخدم وسائل الإعلام ثقافة مختلفة في القسمين، وmicrogrooves بين القسمين تسمح تمديد محور عصبي من عقدة العصب الثلاثي التوائم نحو جراثيم الأسنان النامية. الشكل 3 يمثل التصور من خيط عصبي عبر المناعي 37، في ثقافة مشتركة من ماوس عقدة العصب الثلاثي التوائم الجنينية والفأر القاطعة الجنينية في ميكروفلويديك نظام المشاركة في الثقافة وصفه. لا معصب القواطع الماوس أثناء التطور في الجسم الحي؛ باستمرار، وإلغاء محاور من عقدة العصب الثلاثي التوائم قبل وضع جرثومة الأسنان في ثقافة ما يصل الى 10 يوما ويبين الشكل 3A لمحة عامة عن غرفة محور عصبي في هذا نظام المشاركة في الثقافة. الشكل 3B وتظهر 3C تكبير التدريجي للneurites التي داخل غرف محور عصبي وبساتين الصغرى. جراثيم الأسنان (أو أي أجهزة أو أنسجة المشترك الثقافات) ويمكن إزالتها بسهولة من الأجهزة ميكروفلويديك وتحليلها بشكل منفصل على سبيل المثال، المجهزة للstainings النسيجية أو لتحليل التعبير الجيني.
الشكل 1. آراء شنت جهاز ميكروفلويديك شارك في ثقافة (A) من أعلاه؛ ويسلط الضوء على (B) الجانبي جزئيا وغرف الثقافة (سم مكعب) في الحمراء (يوزين) والأزرق (طولويدين الأزرق)؛ ويمكن رؤية microgrooves (ملغ) كخط أبيض بين الغرف الثقافة. توضع العقد وشارك في تربيتها الأجهزة / الأنسجة في غرفة الثقافة المناسبة عبر ثقبا (PH) في الجهاز. يتم إضافة وسائل الإعلام وإزالة عن طريق الآبار (ميغاواط). "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. (A) عرض جانبي لرأس جنين فأر (اليوم الجنينية من E14.5 التنمية). خط أسود يشير إلى حيث يجب أن تقطع الفك السفلي من أجل الحفاظ على سلامة كل العقد والأسنان مثلث التوائم الجراثيم. (B) الفأر رئيس الجنين (E14.5) بعد إزالة الفك السفلي، والجمجمة والدماغ الانتهائي. السهام السوداء تشير العقد الثلاثي التوائم (TG). (C) الفك السفلي من جنين فأر (E14.5) بعد إزالة اللسان. السهام السوداء تشير إلى توطين جراثيم الأسنان المختلفة (المؤتمر الوطني العراقي: القاطعة، وزير الخارجية: الأضراس الأولى). (D) تمثيل تخطيطي للجهاز التعاون ثقافة ميكروفلويديك.p_upload / 53114 / 53114fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. المشارك ثقافة عقدة العصب الثلاثي التوائم والجرثومية الأسنان القاطعة من النوع البري الأجنة E15.5 الماوس. (A) نظرة عامة للغرفة محور عصبي (خيط عصبي، دابي). شريط مقياس: 300 ميكرون. (B) التكبير العالي للmicrogrooves وneurites التي المتزايد في غرفة محور عصبي (خيط عصبي، دابي؛ تراكب الفلورسنت وbrightfield الصور). شريط مقياس: 150 ميكرون. (C) التكبير العالي تظهر نمو المحاور داخل microgrooves (خيط عصبي). شريط النطاق: 75 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سابقة في الدراسات المختبرية من تعصيب الأسنان استندت شارك الثقافات التقليدية من العقد مثلث التوائم وأنسجة الأسنان أو خلايا 26،28،29. وأجريت هذه الدراسات للتحقيق أساسا الآثار جذابة من هذه الخلايا أو الأنسجة على محاور الحسية 38. على الرغم من تحقيق تقدم كبير في هذا المجال، أثيرت العديد من القضايا الفنية. جراثيم الأسنان تبدأ في التدهور بعد بضعة أيام الثقافة 37. وبناء على هذه الملاحظات، وتزايد الخلايا العصبية والأسنان في ظروف الثقافة نفسها تضر بأي من التحليل في نهاية المطاف من الجزيئات المعنية في الحديث المتبادل بين هذه الأنسجة اثنين. هي الشروط اللازمة الثقافة المثلى للحفاظ على المستوى الجزيئي الفسيولوجية من العقد مثلث التوائم وأنسجة الأسنان.
وقد استخدمت نظم على microfluidics حتى الآن للمشاركة في ثقافة الخلايا العصبية وأنواع الخلايا المختلفة في وسائل الإعلام الأمثل 34،36. هذا النظام على microfluidics يمكن أن يمثل المزيد من الثقةفي الجسم الحي الوضع تماما، حيث يتم عادة تتعرض أجسام الخلايا العصبية، والمحطات محور عصبي والأنسجة المستهدفة لمختلف microenvironments الخلوية والجزيئية. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمت أجهزة على microfluidics للمشاركة في ثقافة كله العقد الجذرية الظهرية وبانيات 36. نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن العقد الثلاثي التوائم والأسنان قادرين على البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة من الزمن عندما شارك في تربيتها في أجهزة ميكروفلويديك 37. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن الأسنان من مراحل تنموية مختلفة الحفاظ في هذه الظروف في المختبر نفس الآثار مثير للاشمئزاز أو جذابة على تعصيب مثلث التوائم أنها عرضت في الجسم الحي 37.
بروتوكول صفها يتطلب الممارسة والمهارة اليدوية، ولا سيما بالنسبة للتسليخ مجهري من مثلث التوائم العقد والأسنان الجراثيم. ومزق العقد مثلث التوائم بسهولة أثناء تشريح. ولذلك، فإننا نقترح استخدام الإبر تشريح بدلا من القوة تشريحملاحظة، وذلك لإزالة الأنسجة المحيطة العقد. وبالمثل، ينبغي توخي الحذر خاصة في حين تشريح جراثيم الأسنان، وذلك لتجنب إتلاف ظهارة الأسنان بينما يفصلها عن الأنسجة المحيطة الوسيطة. وعلاوة على ذلك، خلال اليوم الأول من ثقافة مشتركة، ينبغي توخي الحذر خاصة في التعامل مع الحاضنة، واهتزازات عنيفة يمكن أن يضعف مثلث التوائم العقدة الانضمام إلى ساترة الثقافة. خلال الفترة الثقافة المشتركة، يجب إزالة وسائل الإعلام، وأضاف قبل pipetting في الآبار، على عكس الجانب إلى غرف الثقافة. أن تطمح أو pipetting لوسائل الإعلام في القرب من الدوائر ثقافة يؤدي إلى تلف المحاور.
بروتوكول صفها يمكن تعديلها لدراسة تعصيب من عدة أجهزة الجنينية والخلايا الجنينية أو بعد الولادة وأنواع الخلايا. نظم على microfluidics يمكن أن تمثل منصة مناسبة للسماح فترات أطول الثقافة لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية ونقطة الإنطلاق متزايدعشر. وعلاوة على ذلك، والفصل بين الخلايا العصبية من مقصورة الأسنان يسمح تحليل آثار التعريب بروتين معين وتقدير 33،37. منع الأجسام المضادة أو البروتينات المؤتلف ويمكن أيضا أن تضاف إلى حجرات منفصلة من الأجهزة على microfluidics لتحليل آثارها على الأنسجة العصبية والأسنان. على سبيل المثال، علاج العقد الثلاثي التوائم مع NGF تدعم بقاء على قيد الحياة، ويسمح ثمرة العصبية. ومع ذلك، في هذا خارجية المنشأ العمل NGF غائب عن مقصورة الجرثومية الأسنان، حيث إشارات المستمدة من الأسنان هي مسؤولة فقط عن جذب الخلايا العصبية أو تنافر. وبالمثل، وغيرها من الجزيئات المؤتلف، والأجسام المضادة أو الأدوية يمكن أن تستخدم للتلاعب النظام في ظروف خاضعة للرقابة.
القيود الرئيسية للبروتوكول المعروضة تكمن في التكلفة العالية نسبيا من الأجهزة ميكروفلويديك التجارية و2D-وضع أساسا تتكون من نظام المشاركة في الثقافة. في الواقع، على الرغم من أن الأجهزة كلها يمكن أن تكون الثقافةد، كل من الأجهزة والمحاور تنمو في ظروف ثقافة 2D ملتصقة على ساترة الزجاج؛ وستكون هناك حاجة التخصيص للنظام من أجل الحصول على ثلاثي الأبعاد، تمثيل واقعي لتعصيب.
في الختام، أجهزة ميكروفلويديك هي الأمثل للتحقيق في دور تعصيب في تطوير أو تجديد الأجهزة وتسمح دراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والأنسجة المستهدفة في ظروف ثقافة المثلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).
- Katayama, Y., Battista, M., et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell. 124 (2), 407-421 (2006).
- Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. a, Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
- Oakley, B., Witt, M. Building sensory receptors on the tongue. Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).
- Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research. Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).
- Sun, H., Oakley, B. Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor. Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).
- Mistretta, C. M., Goosens, K. a, Farinas, I., Reichardt, L. F. Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs. The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).
- Mitsiadis, T. a, Graf, D. Cell fate determination during tooth development and regeneration. Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).
- Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. A histological study of the innervation of developing mouse teeth. Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).
- Luukko, K. Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies. Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).
- Johnsen, D. Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment. Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).
- Mitsiadis, T. a, Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat. Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).
- Mitsiadis, T. a, Luukko, K.
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kettunen, P., Løes, S., et al. Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme. Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).
- Tuisku, F., Hildebrand, C. Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species. Developmental biology. 165, 1-9 (1994).
- Zhao, H., Feng, J., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers. Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).
- Lumsend, A., Buchanan, J. An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo. Archives of oral biology. , 301-311 (1986).
- Kollar, E., Lumsend, A. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Luukko, K., Kettunen, P. Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models. Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Lumsend, A., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323 (9), 538-539 (1986).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).
- Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system. Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).
- Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H.
- Mitsiadis, T. a, Drouin, J. Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes. Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).
- Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction. Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).
- Neto, E., Alves, C. J., et al. Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment. Integrative Biology. , (2014).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).
- Connor, R., Tessier-Lavigne, M. Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons. Neuron. 24, 165-178 (1999).
