Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Opdigte superhydrofobe Polymere materialer til biomedicinske anvendelser

Published: August 28, 2015 doi: 10.3791/53117
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Departments of Biomedical Engineering, Chemistry, and Medicine, Boston University

Abstract

Superhydrophobic materialer, med overflader besidder permanente eller metastabile ikke-fugtet stater, er af interesse for en række biomedicinske og industrielle applikationer. Her beskriver vi, hvordan elektrospinding eller electrospraying en polymerblanding indeholdende en biologisk nedbrydelig, biokompatibel alifatiske polyester (f.eks polycaprolacton og poly (lactid-co-glycolid)), som hovedkomponenten, doteret med en hydrofob copolymer bestående af polyester og en stearate- modificerede poly (glycerol carbonat) giver en superhydrofob biomateriale. De fremstillingsteknik af elektrospinding eller electrospraying give den forbedrede overfladeruhed og porøsitet på og inden i fibrene eller partiklerne, henholdsvis. Anvendelsen af ​​en lav overfladeenergi copolymer doteringsmiddel, der blander sig med polyester og stabilt kan elektrospindes eller electrosprayed giver disse superhydrophobic materialer. Vigtige parametre som fiber størrelse, copolymer doteringsmateriale sammensætning og / eller concentration, og deres virkninger på befugtelighed diskuteres. Denne kombination af polymer kemi og procesteknik giver en alsidig tilgang til at udvikle applikationsspecifikke materialer under anvendelse af skalerbare teknikker, som kan generaliseres til en bredere klasse af polymerer til en lang række applikationer.

Introduction

Superhydrophobic overflader er generelt kategoriseres som udviser tilsyneladende vandkontakt vinkler større end 150 ° med lav kontaktvinkel hysterese. Disse overflader er fremstillet ved at indføre høj overfladeruhed på lave overflade energi materialer til at etablere en resulterende luft-væske-fast interface, der modstår befugtning 1-6. Afhængigt af fremstillingsmetode, tynde eller flerlagede superhydrophobic overflader, flerlags superhydrophobic substrat belægninger, eller endda bulk-superhydrophobic strukturer kan fremstilles. Denne permanent eller semi-permanent vandafvisning er en nyttig egenskab, der er ansat til at forberede selvrensende overflader 7, mikrofluidenheder 8, Bundmalingslag celle / protein overflader 9,10, drag-reducerende overflader 11 og medikamentafgivelsesindretninger 12- 15. For nylig er stimuli-responsive superhydrophobic beskrevne materialer, hvor den ikke-befugtet til befugtet tilstand udløses af kemiske, fysiskeEller miljømæssige signaler (f.eks, lys, pH, temperatur, ultralyd, og anvendt elektrisk potentiale / strøm) 14,16-20, og disse materialer er at finde anvendelse til yderligere applikationer 21-25.

Den første syntetiske superhydrophobic overflader blev fremstillet ved behandling af materialeoverflader med methyldihalogenosilanes 26, og var af begrænset værdi for biomedicinske anvendelser, som de anvendte materialer ikke var egnede til in vivo anvendelse. Heri beskrives fremstillingen af ​​overfladen og bulk superhydrophobic materialer fra biokompatible polymerer. Vores tilgang indebærer elektrospinning eller electrospraying en polymerblanding indeholdende en biologisk nedbrydelig, biokompatibel alifatiske polyester som hovedkomponenten, doteret med en hydrofob copolymer bestående af polyester og et stearat-modificerede poly (glycerol carbonat) 27-30. De fremstillingsteknik giver den forbedrede overfladeruhed og porøsitet og inden for fibers eller partiklerne henholdsvis mens anvendelsen af en copolymer doteringsmiddel giver en lav overfladeenergi polymer, der blander sig med polyester og stabilt kan elektrospindes eller electrosprayed 27,31,32.

Alifatiske polyestere biologisk nedbrydelige, såsom poly (mælkesyre) (PLA), poly (glycolsyre) (PGA), poly (mælke syre co -glycolic syre) (PLGA), og polycaprolacton (PCL) er polymerer, der anvendes i klinisk godkendte anordninger og fremtrædende i biomedicinsk materialeforskning på grund af deres ikke-toksicitet, bionedbrydelighed, og nem syntese 33. PGA og PLGA debuterede i klinikken som bioresorberbare suturer i 1960'erne og begyndelsen af 1970'erne, henholdsvis 34-37. Siden da har disse poly (hydroxy syrer) blevet forarbejdet til en række andre applikationsspecifikke formfaktorer, såsom mikro- 38,39 og nanopartikler 40,41, vafler / skiver 42, masker 27,43, skummer 44, og film 45

Alifatiske polyestere, samt andre polymerer af biomedicinsk interesse, kan elektrospindes at producere nano- eller microfiber mesh strukturer, som har et højt overfladeareal og porøsitet samt trækstyrke. Tabel 1 indeholder de syntetiske polymerer elektrospundne til forskellige biomedicinske anvendelser og deres tilsvarende referencer. Elektrospinning og electrospraying er hurtige og kommercielt skalerbare teknikker. Disse to lignende teknikker afhængige af anvendelsen af højspænding (elektrostatiske frastødning) til at overvinde overfladespændingen af en polymeropløsning / smelte i en sprøjtepumpe setup som det er rettet mod et jordet mål 46,47. Når denne teknik anvendes i forbindelse med lav overfladeenergi polymerer (hydrofobe polymerer, såsom poly (caprolactone- co-glycerol-monostearat)), den resulterende materialer udviser superhydrophobicity.

For at illustrere dette generelle syntetiske og materialer forarbejdning tilgangat konstruere superhydrophobic materialer fra biomedicinske polymerer beskriver vi syntesen af superhydrofobe polycaprolactone- og poly (lactid-co-glycolid) -baserede materialer som repræsentative eksempler. De respektive copolymer doteringsmidler poly (caprolactone- co-glycerol-monostearat) og poly (lactid-co-glycerol-monostearat) syntetiseres først, derefter blandet med polycaprolacton og poly (lactid-co-glycolid), henholdsvis, og endelig elektrospindes eller electrosprayed. De resulterende materialer er karakteriseret ved SEM billeddannelse og kontaktvinklen vinkelmåling, og testet for in vitro og in vivo biokompatibilitet. Endelig er hovedparten befugtning gennem tredimensionelle superhydrophobic masker undersøgt ved hjælp af kontrast-forstærket MikroCT tomografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sammenfatning funktionaliserbare poly (1,3-glycerol carbonat- co-caprolacton) 29 og poly (1,3-glycerol carbonat- co-lactid) 27,28.

  1. Monomer syntese.
    1. Cis-2-phenyl-1,3-dioxan-5-ol (50 g, 0,28 mol, 1 ækv.) I 500 ml tør tetrahydrofuran (THF) opløses og omrøres på is under nitrogen. Tilføj kaliumhydroxid (33,5 g, 0,84 mol, 3 ækv.), Finthakket med en morter og støder. Placer kolbe i isbad.
    2. Tilføj 49,6 ml benzylbromid (71,32 g, 0,42 mol, 1,5 ækv.) Dråbevis under omrøring på is. Tillad reaktionen at varme op til stuetemperatur under omrøring i 24 timer under nitrogen.
    3. Tilsæt 150 ml destilleret vand for at opløse kaliumhydroxid og fjerne THF ved roterende fordampning.
    4. Uddrag det resterende materiale med 200 ml dichlormethan (DCM) i en 1-liters skilletragt. Ekstraktionen gentages to gange.
    5. Den organiske fase på natriumsulfat tørre.
    6. Krystallisereproduktet ved tilsætning af 600 ml absolut ethanol til opløsningen, blande godt, og opbevaring natten over ved -20 ° C. Produktet kan opbevares ved -20 ° C i flere dage før udførelse af efterfølgende trin.
    7. Isoler produkt ved vakuum-filtrering gennem en Buchner-tragt og tørres på højvakuum. Produktet kan opbevares i flere dage før udførelse af efterfølgende trin. Et typisk udbytte for dette trin er ~ 80%.
    8. I en 1-liters rundbundet kolbe, suspendere produktet opnået i trin 1.1.7. i methanol (300 ml). Tilsæt 150 ml 2 N saltsyre. Tilbagesvaling ved 80 ° C i 2 timer.
    9. Inddampes opløsningsmidlet og anbringes under højvakuum i 24 timer. Udbyttet for dette trin er typisk> 98%.
    10. Opløs produktet af 1.1.9 i THF (650 ml) og overføres til en 2-liters rundbundet kolbe. Placer kolben på isbad og omrøres under nitrogen. Tilføj 22,4 ml ethylchlorformiat (25,6 g, 0,29 mol, 2 ækv.) Til kolbe under nitrogen.
    11. Tilføj 32,8 ml triethylamin (0,29 mol, 2 ækv.) To en tilsætningstragt. Bland med et lige volumen af ​​THF. Placer tilsætningstragt på rundbundet kolbe og holdes under nitrogen.
    12. Under kraftig omrøring forsigtigt dispensere triethylamin / THF-blandingen dråbevis til rundbundet kolbe på is. ADVARSEL: dette er en exoterm reaktion. For at forhindre hurtig temperaturstigning, tilsæt triethylamin / THF-opløsning ikke hurtigere end 1 dråbe per sekund. Efter tilsætning af fuld volumen, omrør reaktionen i 4 timer, opvarmning til stuetemperatur eller i 24 timer.
    13. Bortfiltrere triethylamin hydrochloridsaltet under anvendelse af en Buchner-tragt. Opløsningsmidlet afdampes på en rotationsfordamper.
    14. Tilføj dichlormethan (200 ml) til kolben og opvarmes forsigtigt, indtil resten er opløst. Tilføj 120 ml diethylether, mens hvirvlende. Opbevares ved -20 ° C natten over for at krystallisere produktet.
    15. Filter monomer krystaller og re-krystallisere før polymerisering. Monomeren produkt kan opbevares forseglet ved stuetemperatur i 2 uger eller ved -206 C ubestemt tid. Bekræft produkt ved 1H NMR, massespektrometri og elementaranalyse. Et typisk udbytte for dette sidste trin i monomeren syntesen er 40-60%.
  2. Copolymerisation af D, L-lactid / ε-caprolacton med 5-benzyloxy-1,3-dioxan-2-on.
    1. Heat silikone oliebad til 140 ° C.
    2. Mål 2,1 g 5-benzyloxy-1,3-dioxan-2-on (fremstillet i 1.1) og føje den til en tør 100 ml rundbundet kolbe. Hvis copolymerisation D, L lactid, udmåle 5,7 g og føje til kolben nu. Tilføj en magnetisk omrørerstav og kolben med en gummiprop.
      1. Også måle 240 mg (et overskud) af tin (II) ethylhexanoat i en lille pæreformet kolbe. Denne polymerisation vil resultere i en 20 mol% glycerol carbonat monomersammensætning. Juster masser af monomerer for at opnå forskellige monomersammensætninger.
    3. Skyl begge kolber med kvælstof på en Schlenk manifold i 5 min og tilsæt 4,24 ml ε-caprolactone under nitrogen. Evakuere kolber 'atmosfære ved at anvende højvakuum (300 mTorr) i 15 minutter til fjernelse af spor vand.
    4. Genoplad kolberne 'atmosfære med nitrogen; gentage denne cyklus to gange mere.
    5. Bland 500 pi tør toluen med tinnet katalysator under nitrogen.
    6. Placer monomer kolbe i 140 ° C oliebad og tilføj katalysator, når alle faststoffer er smeltet. Den samlede mængde af katalysatorblanding leveret bør være ~ 100 pi. Hold ved 140 ° C i mere end 24 timer, og derefter køle den smeltede polymer til stuetemperatur. Udfør de efterfølgende trin med det samme eller mindst 24 timer senere.
    7. Polymeren i dichlormethan (50 ml) opløses og udfældes i kold methanol (200 ml). Dekanter supernatanten og tør under højvakuum. De efterfølgende trin kan udføres straks eller på noget tidspunkt. Opbevar polymerer i fryseren indtil videre anvendelse. Den typiske polymerisation udbytte / konvertering er mellem 80-95%.
    8. Udfør 1H NMR-analyse for at bestemme de co-monomer molforhold. Opløs polymer i deutereret chloroform (CDCI3) og integrere den benzyliske proton forskydning af carbonat monomer ved 4,58-4,68 ppm; sammenligne denne topareal med den methylen top ved 2,3 ppm (PCL) og methyngruppe top ved 5,2 ppm (PLGA).
  3. Polymermodificering: afbeskyttelse og podning.
    1. Opløs polymer (~ 7 g) i 120 ml tetrahydrofuran (THF) i en højtryks-hydrogenering fartøj. Afvej og tilføj palladium-carbon-katalysator (~ 2 g).
    2. Tilføj hydrogen til beholderen ved hjælp af en hydrogeneringsapparat. Der hydrogeneres ved 50 psi i 4 timer. ADVARSEL: brintgas er yderst brandfarlig. Søge bistand fra personer bekendt med denne procedure, og altid inspicere forsyningsledninger til mulige lækager, før du udfører dette eksperiment.
    3. Bortfiltrere palladium-carbon-katalysator under anvendelse af et pakket leje af diatoméjord. Koncentrer polymeren til ~ 50 ml under rotationsinddampning og præcisionenpitate i kold methanol. ADVARSEL: Tørre palladium partikler kan spontant antændes. Hold et vådt håndklæde i nærheden i tilfælde af en opblussen for kvæler flammerne. Tilsæt vand til palladium / carbon filterkage at holde det klumpet og forhindre antændelse. Søge bistand fra personer bekendt med denne procedure.
    4. Dekanteres og tør under højvakuum. Bekræft total omdannelse til fri hydroxylgruppe ved at bemærke peak forsvinden ved 4,65 ppm (1H NMR i CDCl3). Disse polymerer kan anvendes straks eller gemmes til senere brug. Udbytter for dette trin er> 90%.
    5. Opløse polymeren og stearinsyre (1,5 ækv.) I 500 ml tør dichlormethan (DCM). Tilføj N, N'-dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 2,0 ækv.) Og 3 flager af 4-dimethylaminopyridin. Der omrøres under nitrogen ved stuetemperatur i 24 timer.
    6. Fjerne uopløseligt N, N'-dicyclohexylcarbourea gennem en række gentagne filtreringer og koncentrationer. Ved udgangen koncentreresopløsning til 50 ml.
    7. Udfælde polymer i kold methanol (~ 175 ml) og dekanter supernatanten. Tør polymer under højvakuum natten over. Efterfølgende anvendelse af disse polymerer kan udføres på ethvert tidspunkt, men holde polymerer i fryseren for langtidsopbevaring. Udbyttet for denne sidste ændring trin er generelt mellem 85-90%.

2. karakterisering af Syntetiserede Copolymerer

  1. Afvejes ~ 10 mg polymer (rekord den faktiske masse) og tilføje til aluminium prøve gryde, så hermetisk forsegle den. Load prøve gryde og en ulastet (reference) pan i differentialscanningskalorimeter.
  2. Program en temperaturstigning og afkøling ("varme / køle / varme") cyklus: 1) varme fra 20 ° C til 225 ° C ved 10 ° C / min, 2) afkøles til -75 ° C ved 5 ° C / min, 3) opvarmes til 225 ° C ved 10 ° C / min.
  3. Bestem smeltepunkt (T m), krystallisation (<em> T c) og glasovergangstemperaturer (Tg), og smeltevarme (AH f) fra de termiske spor (hvis relevant).
  4. Hver syntetiseret copolymer i THF (1 mg / ml) opløses og filtreres gennem et 0,02-um PTFE-filter. Den indsprøjtes i en gelpermeationskromatografi systemet og sammenligne retentionstiden versus en række polystyrenstandarder.

3. Forberedelse Polymer Løsninger til Electrospinning / electrospraying 27,31

  1. Opløs polymer (s) ved 10-40 vægt% i et egnet opløsningsmiddel, såsom chloroform / methanol (5: 1) for PCL eller tetrahydrofuran / N, N-dimethylformamid (7: 3) for PLGA, natten over. Massen af ​​polymer kræves til dette trin vil afhænge af dimensionerne af den ønskede mesh.
    Bemærk: For eksempel, for at fremstille en 10 cm x 10 cm mesh på ca. 300 micron, vil 1 gram typisk være påkrævet. Det er værd at bemærke, at materiale tabes kan forekomme i efterfølgende trin i denne protokol, såsom under opløsnings overførsels på sprøjten (især for viskose opløsninger), og fra dødvolumener stede i valgfri forbindelsesslangen og nålehuset selv, hvilket vil reducere udbyttet af elektrospinningsprocessen . Disse reduktioner i udbytte kan resultere i op til 20% tab af materiale, og det anbefales at optrappe 1,5-fold at foregribe disse tab, og også de tab i forbindelse med optimering elektrospinningsprocessen parametre, når de forsøger denne fremgangsmåde for første gang.
    1. Kontrollere fiberstørrelse ved at variere den totale polymerkoncentration, med større fibre, der forventes af mere koncentrerede opløsninger. For en beskeden forbedring af hydrofobicitet, bruger 10% (af den samlede polymer masse) superhydrofobe doteringsmiddel. Til ekstremt hydrofobe / superhydrophobic materialer, bruge 30-50% doteringsmidlet og / eller reducere den samlede koncentration polymer (dvs.., Reducere fiber størrelse). Efterfølgende arbejde med disse løsninger kan PERFORMED næste dag eller inden for en uge derefter.
    2. For electrospraying, fremstille opløsninger ved lavere koncentrationer (dvs. 2-10%) i et egnet opløsningsmiddel, såsom chloroform. Ligesom elektrospinning, modulere partikelstørrelse ved at variere polymerkoncentrationen.
  2. Vortex polymeropløsning blandes grundigt. Tillad store luftbobler at stilne (5 min).
  3. Load opløsning i en glassprøjte. Afhængigt af opløsningsviskositet, kan det være lettest at fjerne stemplet og hæld opløsningen direkte ind i sprøjten. Et stykke af inaktiv, fleksible rør kan hjælpe manøvredygtighed i electrospinning opsætningen. Vend sprøjten til at fortrænge luft gennem slangen / nåleaggregatet.

4. elektrospinning / electrospraying Polymer Solutions

  1. Load sprøjtens sprøjtepumpe, indstille totalvolumen (f.eks 4,5 ml) og prisen (f.eks 5 ml / time) ved at dispensere denne løsning.
  2. Dæk samleren plade med enluminum folie for at lette efterfølgende fjernelse og transport. Fastgør folie med malertape langs de ydre kanter.
  3. Fastgør den høje spænding DC (HVDC) levering ledning til nålespidsen. Afstanden af ​​denne nålespidsen til kollektoren er en vigtig variabel til at overveje, fordi det 1) påvirker det elektriske felt ved en given spænding, og 2) påvirker fordampning af opløsningsmiddel og efterfølgende tørring af fibrene under deres samling.
    1. Som et første forsøg, bruge et tip-til-kollektor afstand på 15 cm. Advarsel: højspænding og brændbare opløsningsmidler er involveret i elektrospinning / electrospraying. Sørg for tilstrækkelig ventilation til uden udstødning, og aldrig røre sprøjten / nål eller åbne kabinettet, indtil helt sikker på HVDC forsyningen er slukket.
  4. Hvis elektrospinding / electrospraying et stort dækningsområde, tænde roterende og oversætte opkøber tromme. Ellers gå videre til næste trin,.
  5. Start sprøjtepumpen.
  6. Tænde og justere høje voltalder kilde til at opnå en acceptabel Taylor Cone. Hvis opløsningen på nålens spids er sagging, øge spændingen. Hvis flere dyser danner, mindske spændingen. Ud over disse justeringer, kan det være nødvendigt at justere tip-to-opsamlerafstanden hvis fibre / partikler vises våd eller hvis justere spændingen ikke tilstrækkeligt løse en trække dråbe på nålens spids.
    Bemærk: For detaljeret fejlsøgning, se den omfattende electrospinning optimering proces ved Leach og medarbejdere 47. Electrospraying vil generelt indebære højere spændinger og lavere koncentrationer løsning end elektrospinding.
  7. Sluk højspændingskilden og derefter sprøjtepumpen og motoriseret tromle (hvis relevant). Tillad elektrospinningsprocessen kabinet at fortsætte ventilerende i 30 minutter.
  8. Fjern masker / belægninger fra solfangeren. Tillad spor opløsningsmidler fordampe i en hætte natten over. Materialer kan opbevares ved stuetemperatur i mindst to uger (PLGA) eller tomåneder (PCL). Trin 4,5-4,8 kan udføres i vilkårlig rækkefølge.

5. karakterisere Fiber og partikelstørrelse ved Lys og Scanning Electron Microscopy

  1. Lysmikroskopi
    1. Hvis producere en elektrospundet mesh, klippe og montere tynde dele af det på en glasplade.
    2. Observere fiberdiameter, node karakteristika (blobs eller diskrete), og fiber form (dvs. beaded, flad, lige / bølget). Ideel elektrospundet mesh fibre er ensartede, lige eller bølget, og perle-fri.
  2. Scanning elektronmikroskopi (SEM)
    1. Klip og montere masker eller coatede overflader på aluminium SEM stubbe hjælp ledende kobber tape. Elektrospundne fibre og electrosprayed belægninger kan også observeres ved SEM ved direkte deponering fibre / partikler på båndet på forhånd.
    2. Coat maskerne / belægninger med en tynd (~ 4 nm) lag af Au / Pd gennem sputter belægning.
    3. Load stubbe i SEM kammer og observere på 1-2 keV. En 250X magnification giver en generel topografisk vurdering af materialet, mens højere forstørrelser afslører yderligere fiber og partikel funktioner såsom hierarkiske mønstre for ekstremt superhydrophobic fibre og sammenkobling for partikel belægninger.

6. Bestemmelse Ikke-befugtningsegenskaber

  1. Fremme og vigende vandkontaktvinkel målinger ved hjælp af lydstyrken variation metoden
    1. Skær tynde (0,5 cm x 5 cm) strimler af mesh eller overtrukket materiale (hvis muligt) og sted på den fase af en kontakt goniometer.
    2. Fang vanddråben profil, mens dispensering det (fra en 24 AWG sprøjte nål) på materialets overflade.
      1. For at gøre dette, skal du starte med en omtrentlig 5-ul drop, og få kontakt med materialet overflade. Fortsæt til langsomt tilføje volumen (20-25 pi) og fange den lille dråbe billede, som repræsenterer de fremrykkende vandkontaktvinkel. Nålespidsen skal være lille i forhold til dråben, og the kapillar længde bør være større end dråben for at minimere forvrængning af dråbe form.
    3. Trække dette samme fald samtidig erobre sin drop profil. Gentag på diskrete overflade placeringer af flere prøver at rapportere en gennemsnitsværdi-typisk, er tilstrækkelige til at karakterisere disse materialer 10 målinger af både fremrykkende og vigende kontakt vinkler.
  2. Bestem kritisk overfladespænding materialer ved at modificere tast væsker.
    1. Fremstille opløsninger varierende i ethanol, propylenglycol eller ethylenglycol indhold, da disse blandinger har kendt overfladespændinger 99-101.
      1. Alternativt brug af opløsningsmidler med varierende overfladespændinger-fx vand (72 mN / m), glycerol (64 mN / m), dimethylsulfoxid (44 mN / m), benzylalkohol (39 mN / m), 1,4- dioxan (33 mN / m), 1-octanol (28 mN / m), og acetone (25 mN / m). Det er vigtigt at anvende opløsningsmidler, der ikke opløser polymererne, da disse vilforvirre resultater. Derudover er det vigtigt at bemærke, at ud over overfladespænding, har disse væsker forskellige viskositeter, hvilket kan påvirke kontaktvinkelmålinger og er en begrænsning i denne teknik.
      2. Måle kontaktvinklen af ​​disse løsninger probet på materialeoverfladen. Plot kontaktvinkel som funktion af overfladespænding.

7. Afsløring Bulk befugtning af masker 31

  1. Overhold vand infiltration i 3D masker ved hjælp af mikro-computertomografi (μCT).
    1. Forbered en løsning 80 mg / ml ioxaglat (et ioderet kontrastmiddel) i vand.
    2. Dykke masker i disse opløsninger og inkuberes ved 37 ° C; periodisk måling kontrastmiddel (vand) infiltration af μCT (18 um 3 voxel opløsning) under anvendelse af en 70 KVP rørspænding, 114 uA strøm, og en 300 ms integrationstid.
    3. Brug billedbehandling software, måle pixel intensity hele tykkelsen af ​​masken, hvor lyse pixels repræsenterer vandindtrængning. Vælg en pixel tærskelværdi (~ 1500), for hvilken højere intensitet repræsenterer vand infiltration.

8. Test de mekaniske egenskaber af masker

  1. Klip masker til 1 cm x 7 cm og sted mellem greb af et apparat trækprøvning. Mål den nøjagtige bredde, længde og tykkelse.
  2. Udfør en rampe test af udvidelse på tre prøver. Plot en stress-strain kurve ved hjælp af disse data til at bestemme elasticitetsmodulet, trækbrudstyrke og brudforlængelse-at-break.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gennem en række kemiske omdannelser, er den funktionelle monomer carbonat 5-benzyloxy-1,3-dioxan-2-on syntetiseret som et hvidt krystallinsk faststof (figur 1A). 1H NMR bekræfter strukturen (figur 1B) og massespektrometri og grundstofanalyse bekræfter sammensætningen. Dette faststof derpå copolymeriseres med enten D, L-lactid eller ε-caprolacton under anvendelse af en tin-katalyseret ringåbningsreaktion ved 140 ° C. Efter oprensning ved udfældning, er polymersammensætningen bestemt under anvendelse af 1H NMR-analyse ved at integrere den benzyliske proton kemiske skift ved 4,58 til 4,68 ppm og methylen karakteristiske top af caprolacton eller methyngruppe top af lactid (2,3 eller 5,2 ppm). Selektiv fjernelse af benzylbeskyttelsesgruppen opnås ved Pd / C-katalyseret hydrogenolyse. Komplet afbeskyttelse bekræftes ved at bemærke forsvinden af benzyl top i 1H-NMR-spektre. Subseqgelige podning af stearinsyre på den frie hydroxylgruppe gør de endelige copolymerer hydrofob. Disse copolymerer er hvide faste stoffer ved stuetemperatur (figur 1C), og de ​​er i stand til at blive forarbejdet til film, elektrospundne masker, og electrosprayed belægninger (figur 1D).

Copolymersammensætningen (dvs. lactid / caprolacton til glycerol carbonat) er indstillet ved at variere de tilsvarende monomer fødeforhold. Variere sammensætningen tilvejebringer et middel til at syntetisere copolymerer med en række af termiske og / eller mekaniske egenskaber. For eksempel, termisk analyse under anvendelse af differentiel scanningkalorimetri (DSC) viser, at PLA-PGC 18 polymerer indeholdende 10, 20, 30 eller 40 mol-% PGC 18 monomer gradvist bliver mere krystallinsk med øget PGC mol-%. De termiske egenskaber af PCL-PGC 18 og PLA-PGC 18 copolymerer er opsummeret i tabel 2.

Poly (glycerol-monostearat) -baserede copolymerer har lavere overfladeenergi end deres tilsvarende PCL- eller PLGA modparter, som bestemt under anvendelse kontaktvinkelmålinger på glatte støbte film (figur 2A). Mens PCL besidder en fremrykkende vandkontaktvinkel på 84 °, den fremrykkende kontaktvinkel for PCL-PGC 18 (80:20) er ~ 120 °. Ligeledes PLGA besidder en fremtrængningskontaktvinkel på 71 °, mens PLA-PGC 18 (90:10) og PLA-PGC 18 (60:40) udviser fremrykkende kontaktvinkler på 99 ° og 105 °, henholdsvis. Blending PCL eller PLGA med deres tilsvarende copolymer dopingmidler resultater i fremtrængningskontaktvinkel værdier mellem dem, der opnås for rene polymerer og copolymerer, og giver et letkøbte middel til at tune hydrofobicitet (figur 2B). I dette tilfælde, såvel copolymer doteringsmiddelkoncentration (dvs. 10% eller 30% vægt / vægt) og copolymer sammensætning (dvs. PLA-PGC 18 (90:10) eller PLA-PGC 18 (60: 40) art) påvirker hydrofobicitet, med større PGC 18 indhold giver højere kontakt vinkler.

Doping de syntetiserede copolymerer i en opløsning af PCL- eller PLGA og efterfølgende elektrospinding blandingerne opnår fibrøse masker med afstemmelig hydrofobicitet. Figur 3A illustrerer, hvordan doping i 30% PCL-PGC 18 eller PLA-PGC 18 overgange masker fra hydrofob til superhydrofobe. Superhydrophobicity defineres som en tilsyneladende vandkontaktvinkel ≥ 150 ° med en lav kontaktvinkel hysterese defineret som forskellen mellem fremføring og vigende vandkontaktvinkel målinger. Den øgede overfladeruhed elektrospundne masker øger også den tilsyneladende vandkontaktvinkel af disse materialer i forhold til glatte film. Befugtningsevne er tunet ved at variere koncentrationen af ​​copolymer doteringsmiddel. For eksempel elektrospundet ren PCL indgreb med ~ 7 um fibre diameter besidder en tilsyneladende kontakt angle på 123 °, mens masker doteret med 10, 30 og 50% (vægt / vægt) PCL-PGC 18 udviser tilsyneladende kontaktvinkler af 143 °, 150 ° og 160 ° på sammenlignelige fiberdiametre henholdsvis (figur 3B). Befugtelighed styres også af valget af copolymer tilsætningsmaterialer arter. I dette tilfælde, masker 6,5-7,5 um fiber PLGA doteret med 30% PLA-PGC 18 (90:10) eller 30% PLA-PGC 18 (60:40) udviser tilsyneladende kontaktvinkler af 133 ° eller 154 °, henholdsvis ( figur 3C). Ændring (dvs. reducere) fiberen størrelse forbedrer også hydrofobicitet uafhængig af doteringsstof udvælgelse og / eller koncentration. Denne afhængighed af tilsyneladende kontaktvinkel på fiberdiameteren er vist for både PCL og PLGA i figur 3D. Svarende til elektrospinning, electrosprayed PCL og dopede-PCL belægninger vise også kontakte vinkler, der øger med doping procent, og endnu højere kontakt vinkler end dem, der opnås ved elektrospinning eropnås med denne teknik (figur 3E). Ved at probe maskeoverfladen med forskellige væsker (som har forskellige overfladespændinger) og rapportering kontaktvinklen, en kritisk overfladespænding, ved hvilken mesh hurtigt befugter bestemmes. Figur 3F er en modificeret Zisman, der illustrerer de kritiske overfladespænding undersøgelser for PLGA masker doteret med 30% PLA-PGC 18 (60:40) og PCL masker doteret med 30% PCL-PGC 18.

SEM billeddannelse afslører, at maskerne er resultatet af sammenfiltrede mikrofibre. Denne teknik er også egnet til bestemmelse af fiber eller partikelstørrelse, homogenitet og sammenkobling. Figur 4A viser PCL + 30% PCL-PGC 18 masker med fiberdiametre på 1-2 um og 4-5 um, mens figur 4B viser PLGA + 10 % PLA-PGC 18 masker varierende i størrelse fra fiber ~ 3 um til 7 um ~. Electrosprayed belægninger af PCL og PCL + 50% PCL-PGC 18 er vist i figur 4C, mens electrosprayed belægninger af PCL + 30% PCL-PGC 18 af varierende partikelstørrelse er vist i figur 4D.

Superhydrofobe PCL- og PLGA-baserede masker er ikke-cytotoksisk over for NIH / 3T3-fibroblaster (figur 5A) og er veltolereret i C57BL / 6-mus med moderat fibrøst indkapsling. Sammenlignet med ikke-porøse film (ikke vist), masker vise en større grad af cellulær infiltration (dvs. makrofager) efter 4 ugers implantation (figur 5B-E) 27. Mens cytocompatibility / biokompatibilitet superhydrophobic masker ligner ikke-superhydrophobic masker, kan in vitro udførelsen af superhydrophobic masker være overlegen i drug delivery applikationer. På grund af deres langsomme befugtning, superhydrophobic masker er i stand til at opretholde lægemiddelfrigivelse for betydeligt længere varigheder end ikke-superhydrofobiske masker, idet lægemiddelfrigivelse ikke kan forekomme uden vandkontakt. De effektstudier in vitro drug release demonstrerer dette princip er beskrevet andetsteds 12,13.

Befugtning af elektrospundne masker kan følges ikke-destruktivt over tid ved hjælp af MikroCT tomografi og kommercielt tilgængeligt ioderet kontrastmiddel ioxaglat. Masken er placeret i en vandig opløsning indeholdende kontrastmidlet og afbildet over tid. Som vist i figur 6A den rene PCL mesh hurtigt befugter vand infiltrerer bulkmaterialet i den første dag. I modsætning hertil maskerne doteret med 30% PCL-PGC 18 forbliver ikke-befugtet til> 75 dage, med luft forbliver inden for hovedparten struktur (figur 6B). Disse resultater illustrerer betydningen af ​​superhydrophobic bulkmaterialer til ikke-befugtende applikationer.

Endelig er de mekaniske egenskaber af elektrospundne masker bestemmes ud fratrækprøvning. Tabel 3 viser repræsentative mekaniske data for PCL, PLGA og deres respektive doterede masker (fiber size = 7 um for alle masker) opnået fra deres spændings-strain kurver. Som den procentdel af doping stiger, de elastiske moduli (E) og ultimative trækstyrker på masker tendens til at falde.

Figur 1
. Figur 1. Monomer / polymer-syntese, karakterisering og efterfølgende forarbejdning til film, elektrospundne masker, og electrosprayed belægninger (A) Oprenset monomer er et hvidt krystallinsk faststof ved stuetemperatur; (B) svarende 1H-NMR-spektre for monomer; (C) fotografi af oprensede polymerer PLA-PGC 18 (til venstre) og PCL-PGC 18 (til højre); (D) fotografi af PCL doteret med 30% (vægt / vægt) PCL-PGC 18 og forarbejdes til a (fra venstre mod højre): film, elektrospundne mesh og electrosprayed belægning.

Figur 2
Figur 2. Fremme og vigende vand kontakt vinkler på polymer / copolymer-film (A) Fremme og vigende vandkontaktvinkel målinger for udoteret PCL og PLGA glat film i forhold til dem for ren PCL-PGC 18 og rent PLA-PGC 18 glatte film.; (B) fremme og vigende kontaktvinkelmålinger til doteret PCL og PLGA film. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Processerne elektrospinningog electrospraying generere ru overflader, som yderligere forstærker hydrofobicitet PCL og PLGA (A) Kontakt vinkel for elektrospundet PCL og PCL masker doteret med 30% PCL-PGC 18 (80:20) masker (fiber diameter ≈ 2,5 um).; PLGA masker og PLGA masker doteret med 30% PLA-PGC 18 (60:40) masker (fiber diameter ≈ 6,5 um), med begge systemer, der viser en overgang fra hydrofobt til superhydrofobe; (B) kontaktvinkler for PCL masker som en funktion af doteringsmiddel copolymer koncentration; (C) kontaktvinkler for PLGA masker på ~ 6,5 um diameter som en funktion af copolymersammensætning; (D) befugtningsevne som funktion af fiberdiameteren for PCL (600 nm og 2,5 um) og PLGA-baserede masker (2,5 og 6,5 um); (E) kontakt vinkler for electrosprayed PCL-baserede belægninger som funktion af copolymer doping koncentration; (F) modificeret Zisman kurverviser kritiske overfladespænding undersøgelser for PLGA masker doteret med 30% PLA-PGC 18 (60:40) (cirkler med stiplede forbinder linie) og PCL masker doteret med 30% PCL-PGC 18 (firkanter med fast forbindelseslinje). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. SEM billeder af elektrospundne masker og electrosprayed belægninger afslører fiber / partikelstørrelse og morfologi. (A) med lille diameter PCL + 30% PCL-PGC 18 fibre (1-2 pm) og tilsvarende stor diameter mikrofiber (4-5 um) mesh (venstre og højre, henholdsvis), Målestokken = 10 um; (B) med lille diameter PLGA + 10% PLA-PGC 18 (90:10) (2,5-3,5 um) microfiber og stor diameter (6,5-7,5 um) Microfiber masker (venstre og højre, henholdsvis målestok = 10 um); (C) electrosprayed partikler bestående af ren PCL (til venstre), PCL + 50% PCL-PGC 18 (til højre), skala bar = 20 pm; (D) electrosprayed PCL + 30% PCL-PGC 18 partikler af små (til venstre) og store (til højre) radier (skala bar = 2 um). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. In vitro og in vivo cellelevedygtighed / biokompatibilitet elektrospundne superhydrophobic masker (A) In vitro-assay af celle NIH / 3T3 fibroblast levedygtighed på 24-timers inkubation med PCL, PLGA og doterede masker.; (B og C) histologiske (H & E) enheder af in vivo fremmedlegeme reaktion på superhydrofobe PLGA + 30 vægt% PLA-PGC 18 (60:40) elektrospundet masker efter 4 ugers subkutan implantation i C57BL / 6 mus ved 10X (B) og 40X (C) forstørrelse; (D og E) reaktion på implanterede ren PLGA elektrospundet masker på 10X (D) og 40X (E) forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. kontrast-forstærket MikroCT tomografi (μCT) karakterisering af størstedelen befugtning af superhydrophobic masker. Den ioderede CT kontrastmiddel ioxaglat (80 mg I / ml) i wateR fungerer som en non-invasiv markør for vand infiltrerer (A) ikke-superhydrophobic PCL masker og (B) superhydrophobic PCL + 30% PCL-PGC 18 masker. Farve kort indikerer ikke-fugtet mesh som rød og overgang fra gul til grøn til blå / lilla som befugtning skrider frem. Klik her for at se en større version af dette tal.

Elektrospundne syntetiske polymerer: Reference (r):
Poly (lactid-co-glycolid) 27,36,43,48-52
Polyglycolid 52,53
Poly (lactid-co-caprolacton) 54-57
Polycaprolacton 13,58-66
Polylactid 52,67
Poly (vinylalkohol) 68-71 </ td>
Poly (ethylenglycol) / blokcopolymerer 72,73
Poly (ester urethane) s 74-78
Poly (trimethylencarbonat) 79
Poly (dimethylsiloxan) 80,81
Poly (ethylen-co-vinylacetat) 82
Polyvinylpyrrolidon 83
Polyamid (er) 84-86
Polyhydroxybutryate 87,88
Polyphosphazen (s) 89,90
Poly (propylencarbonat) 91-93
Polyethylenimin 94,95
Poly (γ-glutaminsyre) 96
Silikat 97,98

Tabel 1: Eksempler på syntetiske polymerer, biomedicinskehar været elektrospindes til biomedicinske anvendelser, med tilhørende referencer.

Copolymer Konvertering (%) Lactid en Glycerol en Mn (g / mol) b Mw / Mn Tg (° C) c Tm (° C) T c (° C) AH f (J / g)
PLA-PGC 18 (90:10) 92 89 11 12.512 1.5 28 - - -
PLA-PGC 18 (80:20) 96 78 23 10.979 1.5 17 33 11 3
PLA-PGC 18 (70:30) 90 66 34 17.305 1.5 * 40 17 23
PLA-PGC 18 (60:40) 86 54 47 13.226 1.6 * 43 27 32
PCL-PGC 18 (80:20) 99 (caprolacton) 81 19 21.100 1.7 -53 31 19 55

Tabel 2: Karakterisering af syntetiserede copolymerer en muldvarp%; b Som bestemt ved gelpermeationschromatografi (THF, 1,0 ml / min); M n = antal gennemsnitlig molekylvægt, Mw / Mn = dispersitet c Tg = glas.. overgangstemperatur; Tm = smeltepunkttemperatur T c = krystallisationstemperatur; Δ Hf = smeltevarme. D Ingen Tg blev observeret for disse semikrystallinske polymerer i temperaturområdet fra -75 ° C til 225 ° C.

Mesh Sammensætning Elasticitetsmodul (E) (MPa) Trækbrudstyrke (MPa)
PCL et 15.3 1.5
+ 10% PCL-PGC 18 10.8 1.5
+ 30% PCL-PGC 18 3,5 0,8
PLGA b 84,9 2.6
+ 10% PLA-PGC 18 (60:40) 40.3 0,8
+ 30% PLA-PGC <sub> 18 (60:40) 10.1 0,3

Tabel 3:.. Repræsentative strækegenskaber elektrospundne masker en fiberstørrelse for PCL og PCL-baserede masker ≈ 7 um b fiberstørrelse for PLGA og PLGA-baserede masker ≈ 7 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vores tilgang til at konstruere superhydrophobic materialer fra biomedicinske polymerer kombinerer syntetisk polymer kemi med polymer forarbejdning teknikker til elektrospinding og electrospraying. Disse teknikker giver enten fibre eller partikler, hhv. Specifikt er polycaprolacton og poly (lactid-co-glycolid) baseret superhydrophobic materialer fremstillet ved anvendelse af denne strategi. Ved at variere den hydrofobe copolymersammensætning, procent copolymer i den endelige polymerblanding, fiber / partikelstørrelse, generelt polymer vægtprocent og fabrikation betingelser, befugtningsevne de resulterende elektrospundne / electrosprayed materialer styres. Materialerne fremstillet i dette arbejde er fra ikke-giftige og biokompatible polymerer og har en metastabile luft barriere i nærvær af vand.

De kritiske skridt i denne protokol omfatter 1) syntese copolymerer hjælp ringåbningspolymerisation, 2) elektrospinding eller elektrosprøjtning disse copolymerer med en tilsvarende biomedicinsk polymer, såsom PCL eller PLGA; og 3) karakterisering deres morfologi, ikke-befugtende adfærd / hydrofobicitet, mekaniske egenskaber og in vitro / in vivo biokompatibilitet. Hvis der stødt på vanskeligheder med polymersyntese, ændring og / eller elektrospinning vil følgende teknikker hjælpe med at identificere og fejlfinding af disse problemer.

Det er vigtigt at sikre renheden af ​​monomererne, og at de ikke indeholder spor vand, som den fra atmosfæren. Tilstedeværelsen af ​​vand kan forhindre eller ophæve polymerisation, resulterer i polymerer med lav molekylvægt, eller ydelse polymerer med meget brede molekylvægtsfordelinger. Altid evakuere indholdet af polymerisering skibe og re-fylde med tør nitrogen eller argon, og udføre alle tilføjelser (monomerer og katalysatorer) under tør, inert atmosfære. Hvis polymerisering forekommer ufuldstændig eller mislykket, kan det være nødvendigt at tørrereagenserne ved destillation, eller re-krystallisere monomerene at forbedre renheden. Hvis de-benzylering af den resulterende copolymer forekommer mislykket (som observeret ved efterfølgende 1H NMR-analyse), kan det være nødvendigt at tilføje mere katalysator eller bruge en anden katalysator reagens. Vi specifikt bemærke her, at mislykket afbeskyttelse er blevet observeret med visse Pd / C-katalysatorer, og det er bedst at bruge den, der er anført i tabellen i Materials.

Kan opstå flere tekniske vanskeligheder under elektrospinding og electrospraying proces. Hvis opløsningen på nålens spids er sagging, øge spændingen. Hvis flere dyser danner, mindske spændingen. Ud over disse justeringer, kan det være nødvendigt at justere tip-to-opsamlerafstanden hvis fibrene / partikler vises våd (i dette tilfælde øge indsamlingen afstand), eller hvis justere spændingen ikke tilstrækkeligt løse en trække dråbe på nålespidsen, reducere indsamling distance. Hvis fibrene ikke danner, kan det være nødvendigt at forøge viskositeten af ​​opløsningen ved at øge koncentrationen af ​​polymer; det samme er tilfældet, hvis fibrene synes at have en perle-on-string morfologi. Hvis forbliver de vanskeligheder, kan det være nødvendigt at skifte til en anden elektrospinning opløsningsmiddel. For mere fejlfinding, Leach og kolleger 47 give en omfattende fejlsøgning vejledning til elektrospinning.

Mens elektrospinning og electrospraying er nyttige teknikker til opdigte biomedicinske materialer, de har begrænsninger. Først disse teknikker afhængige af en jordet mål at indsamle fibre eller partikler, så elektrisk ledningsevne er en vigtig parameter til at overveje. Det kan være vanskeligt at electrospin eller elektrospray materialer, der er særligt gode elektriske isolatorer, idet polymeren jet kan mere tiltrukket områder omkring disse substrater. En mulig løsning indebærer sikring mindre ledende materialer til conductive kobberbånd. Derudover, mens vi har haft succes med elektrospinning masker op til 1 mm tykke, kan fremstillingen af ​​ekstremt tykke masker hindres på grund af den isolerende karakter af polymerovertræk på kollektoren. På dette tidspunkt, kan masker arealforhøjelsen uden megen forøgelse af den samlede tykkelse. For det andet, afhængigt af størrelsen af ​​den ønskede mesh, er en betydelig mængde materiale, der kræves for at opnå tilstrækkelig opløsningsviskositet (som er nødvendig for elektrospinning, som kæden sammenfiltringer er nødvendige for fiberdannelse). Derfor kan elektrospinning ikke være en egnet løsning for ædle materialer; electrospraying anvender generelt lavere koncentrationer og dermed er mindre krævende med hensyn til den nødvendige mængde materiale. Hvis mængden af ​​prøven er meget begrænset, kan det være muligt at reducere materialetab ved at udelade forbindelsesslangen (som ellers tilføjer til den samlede dødvolumen). Endelig fastlæggelse af kritiske overfladespænding er afhængig afanvendelsen af ​​forskellige probing væsker, som også besidder forskellige viskositeter. Som sådan er denne fremgangsmåde har en potentiel begrænsning i denne viskositet er også en medvirkende faktor til disse resultater.

Superhydrophobic materialer er en spændende klasse af biomaterialer, som er at finde øget brug for en række anvendelser i lægemiddelafgivelse, vævsmanipulering, sårheling og anti-fouling. Flere teknikker eksisterer for at øge overfladeruheden til materialer til biomimetiske og ikke-befugtende applikationer, såsom lag-på-lag samlingen 15, micropatterning / microtexturing 102, elektrospinding 1,5,13 og electrospraying 32. Af disse tilgange, elektrospinding og electrospraying er særligt attraktive metoder på grund af deres skalerbarhed og generel kompatibilitet med underliggende substrater. Afslutningsvis denne strategi kombinerer polymer kemi og procesteknik, er en alsidig og generel en, der vil gøre det muligt for andreforskere til at forberede, karakterisere, og studere nye biomaterialer, hvor befugtelighed af materialerne er et centralt design funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone oil Sigma-Aldrich 85409
Cis-2-Phenyl-1,3-dioxan-5-ol Sigma-Aldrich 13468
Benzyl bromide Sigma-Aldrich B17905 Toxic, lacrymator/eye irritant, use in chemical fume hood
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473 Corrosive
Rotary evaporator Buchi R-124
High-vacuum pump Welch 8907
Nitrogen, ultra high purity Airgas NI UHP300 Compressed gas
Tetrahydrofuran, stabilized with BHT Pharmaco-Aaper 346000 Flammable. Dried through column of XXX
Dichloromethane Pharmaco-Aaper 313000 Flammable, toxic.
Separatory funnel (1 L) Fisher Scientific 13-678-606
Sodium sulfate Sigma-Aldrich 239313
Ethanol, absolute Pharmaco-Aaper 111USP200 Flammable, toxic.
Buchner funnel Fisher Scientific FB-966-F
Methanol Pharmaco-Aaper 339000ACS Flammable, toxic.
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 320331 Corrosive. Diluted to 2N in distilled water.
Ethyl chloroformate, 97% Sigma-Aldrich 185892 Toxic, flammable, harmful to environment
Triethylamine (anhydrous) Sigma-Aldrich 471283 Toxic, flammable, harmful to environment
Diethyl ether Pharmaco-Aaper 373ANHACS Highly flammable. Purified through XXX column.
3,6-Dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dione (D,L-lactide) Sigma-Aldrich 303143
Tin (II) ethylhexanoate Sigma-Aldrich S3252 Toxic.
ε-caprolactone (97%) Sigma-Aldrich 704067
Toluene, anhydrous Sigma-Aldrich 244511 Flammable, toxic.
Glass syringe Hamilton Company 1700-series
Deuterated chloroform Cambridge Isotopes Laboratories, Inc. DLM-29-10 Toxic
Nuclear magnetic resonance instrument Varian V400
Palladium on carbon catalyst Strem Chemicals, Inc. 46-1707
Hydrogenator unit Parr 3911
Hydrogenator shaker vessel Parr 66CA
Hydrogen Airgas HY HP300 Highly flammable.
Diatomaceous earth Sigma-Aldrich 22140
2H,2H,3H,3H-perflurononanoic acid Oakwood Products, Inc. 10519 Toxic.
Stearic acid Sigma-Aldrich S4751
N,N’-dicyclohexylcarbodiimide Sigma-Aldrich D80002 Toxic, irritant.
4-(dimethylamino) pyridine Sigma-Aldrich 107700 Toxic.
Hexanes Pharmaco-Aaper 359000ACS Toxic, flammable.
Gel permeation chromatography (GPC) system Rainin
GPC column Waters WAT044228
Differential scanning calorimeter TA Instruments Q100
Chloroform Pharmaco-Aaper 309000ACS Toxic.
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 227056 Toxic, flammable.
Polycaprolactone, MW 70-90 kg/mol Sigma-Aldrich 440744
Poly(lactide-co-glycolide), MW 136 kg/mol Evonik Industries LP-712
10 ml glass syringe Hamilton Company 81620
18 AWG blunt needle BRICO Medical Supplies BN1815
Electrospinner enclosure box Custom-built N/A Made of acrylic panels
High voltage DC supply Glassman High Voltage, Inc. PS/EL30R01.5 High voltages, electrocution hazard
Linear (translating) stage Servo Systems Co. LPS-12-20-0.2 Optional
Programmable motor & power supply Intelligent Motion Systems, Inc. MDrive23 Plus Optional
24V DC motor & power supply McMaster-Carr 6331K32 Optional
Aluminum collector drum Custom-built Optional
Syringe pump Fisher Scientific 78-0100I
Inverted optical microscope Olympus IX70
Scanning electron microscope Carl Zeiss Supra V55
Conductive copper tape 3M 16072
Aluminum SEM stubs Electron Microscopy Sciences 75200
Contact angle goniometer Kruss DSA100
Propylene glycol Sigma-Aldrich W294004 Toxic.
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558 Toxic.
Ioxaglate Guerbet
Fetal bovine serum American Type Culture Collection 30-2020
Micro-computed tomography instrument Scanco
Image analysis software (Analyze) Mayo Clinic
Tensile tester Instron 5848
Micrometer Multitoyo 293-340
Calipers Fisher Scientific 14-648-17

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, X. M., Reinhoudt, D., Crego-Calama, M. What do we need for a superhydrophobic surface? A review on the recent progress in the preparation of superhydrophobic surfaces. Chem. Soc. Rev. 36, 1350-1368 (2007).
  2. Crick, C. R., Parkin, I. P. Preparation and characterisation of super-hydrophobic surfaces. Chem. - Eur. J. 16, 3568-3588 (2010).
  3. Genzer, J., Efimenko, K. Recent developments in superhydrophobic surfaces and their relevance to marine fouling: a review. Biofouling. 22, 339-360 (2006).
  4. Marmur, A. Super-hydrophobicity fundamentals: implications to biofouling prevention. Biofouling. 22, 107-115 (2006).
  5. Sas, I., Gorga, R. E., Joines, J. A., Thoney, K. A. Literature review on superhydrophobic self-cleaning surfaces produced by electrospinning. J. Polym. Sci., Part B: Polym. Phys. 50, 824-845 (2012).
  6. Zhang, X., Shi, F., Niu, J., Jiang, Y., Wang, Z. Superhydrophobic surfaces: from structural control to functional application. J. Mat. Chem. 18, 621-633 (2008).
  7. Xue, C. -H., Li, Y. -R., Zhang, P., Ma, J. -Z., Jia, S. -T. Washable and wear-resistant superhydrophobic surfaces with self-cleaning property by chemical etching of fibers and hydrophobization. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6, 10153-10161 (2014).
  8. Ou, J., Perot, B., Rothstein, J. P. Laminar drag reduction in microchannels using ultrahydrophobic surfaces. Phys. Fluids. 16, 4635-4643 (2004).
  9. Ko, T. -J., et al. Adhesion behavior of mouse liver cancer cells on nanostructured superhydrophobic and superhydrophilic surfaces. Soft Matter. , (2013).
  10. Lourenco, B. N., et al. Wettability influences cell behavior on superhydrophobic surfaces with different topographies. Biointerphases. 7, (2012).
  11. Srinivasan, S., et al. Drag reduction for viscous laminar flow on spray-coated non-wetting surfaces. Soft Matter. 9, 5691-5702 (2013).
  12. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  13. Yohe, S. T., Herrera, V. L. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. 3D superhydrophobic electrospun meshes as reinforcement materials for sustained local drug delivery against colorectal cancer cells. J. Control. Release. 162, 92-101 (2012).
  14. Yohe, S. T., Kopechek, J. A., Porter, T. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Triggered drug release from superhydrophobic meshes using high-intensity focused ultrasound. Adv. Healthcare Mater. 2, 1204-1208 (2013).
  15. Manna, U., Kratochvil, M. J., Lynn, D. M. Superhydrophobic polymer multilayers that promote the extended, long-term release of embedded water-soluble agents. Adv. Mater. 25, 6405-6409 (2013).
  16. Ju, G., Cheng, M., Shi, F. A pH-responsive smart surface for the continuous separation of oil/water/oil ternary mixtures. NPG Asia Mater. 6, e111 (2014).
  17. Lim, H. S., Han, J. T., Kwak, D., Jin, M., Cho, K. Photoreversibly switchable superhydrophobic surface with erasable and rewritable pattern. J. Am. Chem. Soc. 128, 14458-14459 (2006).
  18. Macias-Montero, M., Borras, A., Alvarez, R., Gonzalez-Elipe, A. R. Following the wetting of one-dimensional photoactive surfaces. Langmuir. 28, 15047-15055 (2012).
  19. Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 357-360 (2004).
  20. Verplanck, N., Coffinier, Y., Thomy, V., Boukherroub, R. Wettability switching techniques on superhydrophobic surfaces. Nanoscale Res. Lett. 2, 577-596 (2007).
  21. Deng, D., et al. Hydrophobic meshes for oil spill recovery devices. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 774-781 (2013).
  22. Ebrahimi, A., et al. Nanotextured superhydrophobic electrodes enable detection of attomolar-scale DNA concentration within a droplet by non-faradaic impedance spectroscopy. Lab Chip. 13, 4248-4256 (2013).
  23. Guix, M., et al. Superhydrophobic alkanethiol-coated microsubmarines for effective removal of oil. ACS Nano. 6, 4445-4451 (2012).
  24. Korhonen, J. T., Kettunen, M., Ras, R. H. A., Ikkala, O. Hydrophobic nanocellulose aerogels as floating, sustainable, reusable, and recyclable oil absorbents. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3, 1813-1816 (2011).
  25. Wu, Y., Hang, T., Komadina, J., Ling, H., Li, M. High-adhesive superhydrophobic 3D nanostructured silver films applied as sensitive, long-lived, reproducible and recyclable SERS substrates. Nanoscale. 6, 9720-9726 (2014).
  26. Waterproofing treatment of materials. US Patent. Norton, F. J. , 2386259 A (1945).
  27. Kaplan, J. A., et al. Imparting superhydrophobicity to biodegradable poly(lactide-co-glycolide) electrospun meshes. Biomacromolecules. 15, 2548-2554 (2014).
  28. Ray, W. C., Grinstaff, M. W. Polycarbonate and poly(carbonate−ester)s synthesized from biocompatible building blocks of glycerol and lactic acid. Macromolecules. 36, 3557-3562 (2003).
  29. Wolinsky, J. B., Ray, W. C., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Poly(carbonate ester)s based on units of 6-hydroxyhexanoic acid and glycerol. Macromolecules. 40, 7065-7068 (2007).
  30. Wolinsky, J. B., Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Functionalized hydrophobic poly(glycerol-co-ε-caprolactone) depots for controlled drug release. Biomacromolecules. 13, (2012).
  31. Yohe, S. T., Freedman, J. D., Falde, E. J., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. A mechanistic study of wetting superhydrophobic porous 3D meshes. Adv. Funct. Mater. 23, 3628-3637 (2013).
  32. Yohe, S. T., Grinstaff, M. W. A facile approach to robust superhydrophobic 3D coatings via connective-particle formation using the electrospraying process. Chem. Commun. 49, 804-806 (2013).
  33. Tian, H. Y., Tang, Z. H., Zhuang, X. L., Chen, X. S., Jing, X. B. Biodegradable synthetic polymers: Preparation, functionalization and biomedical application. Prog. Polym. Sci. 37, 237-280 (2012).
  34. Surgical sutures. US Patent. Emil, S. E., Albert, P. R. , 3297033 A (1967).
  35. Greenberg, J. A., Clark, R. M. Advances in suture material for obstetric and gynecologic surgery. Rev. Obstet. Gynecol. 2, 146-158 (2009).
  36. Weldon, C. B., et al. Electrospun drug-eluting sutures for local anesthesia. J. Control. Release. 161, 903-909 (2012).
  37. Wright, J., Hoffman, A. Chapter 2. Long Acting Injections and Implants. Advances in Delivery Science and Technology. Wright, J. C., Burgess, D. J. , Springer. 11-24 (2012).
  38. Wischke, C., Schwendeman, S. P. Principles of encapsulating hydrophobic drugs in PLA/PLGA microparticles. Int. J. Pharm. 364, 298-327 (2008).
  39. Xie, J. W., Tan, R. S., Wang, C. H. Biodegradable microparticles and fiber fabrics for sustained delivery of cisplatin to treat C6 glioma in vitro. J. Biomed. Mater. Res., Part A. 85A, 897-908 (2008).
  40. Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: An overview of biomedical applications. J. Control. Release. 161, 505-522 (2012).
  41. Korin, N., et al. Shear-activated nanotherapeutics for drug targeting to obstructed blood vessels. Science. 337, 738-742 (2012).
  42. Lee, J. S., et al. Evaluation of in vitro and in vivo antitumor activity of BCNU-Ioaded PLGA wafer against 9L gliosarcoma. Eur. J. Pharm. Biopharm. 59, 169-175 (2005).
  43. Liu, H., Wang, S. D., Qi, N. Controllable structure, properties, and degradation of the electrospun PLGA/PLA-blended nanofibrous scaffolds. J. Appl. Polym. Sci. 125, E468-E476 (2012).
  44. Ong, B. Y. S., et al. Paclitaxel delivery from PLGA foams for controlled release in post-surgical chemotherapy against glioblastoma multiforme. Biomaterials. 30, 3189-3196 (2009).
  45. Paun, I. A., Moldovan, A., Luculescu, C. R., Staicu, A., Dinescu, M. M. A. P. L. E. deposition of PLGA:PEG films for controlled drug delivery: Influence of PEG molecular weight. Appl. Surf. Sci. 258, 9302-9308 (2012).
  46. Reneker, D. H., Yarin, A. L., Zussman, E., Xu, H. Electrospinning of nanofibers from polymer solutions and melts. Advances in Applied Mechanics. Aref, H., Van der Giessen, E. 41, 43-195 (2007).
  47. Leach, M. K., Feng, Z. -Q., Tuck, S. J., Corey, J. M. Electrospinning fundamentals: optimizing solution and apparatus parameters. J. Vis. Exp. (2494), (2011).
  48. Oh, J. H., Park, K. M., Lee, J. S., Moon, H. T., Park, K. D. Electrospun microfibrous PLGA meshes coated with in situ cross-linkable gelatin hydrogels for tissue regeneration. Curr. Appl. Phys. 12, S144-S149 (2012).
  49. Kim, T. G., Park, T. G. Biomimicking extracellular matrix: cell adhesive RGD peptide modified electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) nanofiber mesh. Tissue Eng. 12, 221-233 (2006).
  50. Stitzel, J., et al. Controlled fabrication of a biological vascular substitute. Biomaterials. 27, 1088-1094 (2006).
  51. Liang, D., et al. In vitro non-viral gene delivery with nanofibrous scaffolds. Nucleic Acids Res. 33, e170 (2005).
  52. You, Y., Min, B. -M., Lee, S. J., Lee, T. S., Park, W. H. In vitro degradation behavior of electrospun polyglycolide, polylactide, and poly(lactide-co-glycolide). J. Appl. Polym. Sci. 95, 193-200 (2005).
  53. Boland, E. D., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Pawlowski, K. J., Bowlin, G. L. Tailoring tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques: a study of poly(glycolic acid) electrospinning. J. Macromol. Sci., Part A: Pure Appl. Chem. 38, 1231-1243 (2001).
  54. Inoguchi, H., Tanaka, T., Maehara, Y., Matsuda, T. The effect of gradually graded shear stress on the morphological integrity of a huvec-seeded compliant small-diameter vascular graft. Biomaterials. 28, 486-495 (2007).
  55. Xu, C. Y., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Aligned biodegradable nanofibrous structure: a potential scaffold for blood vessel engineering. Biomaterials. 25, 877-886 (2004).
  56. Mun, C. H., et al. Three-dimensional electrospun poly(lactide-co-varepsilon-caprolactone) for small-diameter vascular grafts. Tissue Eng. Part A. 18, 1608-1616 (2012).
  57. Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Deformation behavior of electrospun poly(L-lactide-co-ε-caprolactone) nonwoven membranes under uniaxial tensile loading. J. Polym. Sci., Part B: Polym. Phys. 43, 3205-3212 (2005).
  58. Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction. J. Biomed.Mater.Res.,PartA.. 93A, 1151-1159 (2010).
  59. Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7, 2796-2805 (2006).
  60. Jiang, H., Zhao, P., Zhu, K. Fabrication and characterization of zein-based nanofibrous scaffolds by an electrospinning method. Macromol. Biosci. 7, 517-525 (2007).
  61. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  62. Jiang, H., Hu, Y., Zhao, P., Li, Y., Zhu, K. Modulation of protein release from biodegradable core-shell structured fibers prepared by coaxial electrospinning. J. Biomed. Mater. Res., Part B: Appl. Biomat. 79, 50-57 (2006).
  63. Jiang, H., et al. A facile technique to prepare biodegradable coaxial electrospun nanofibers for controlled release of bioactive agents. J. Control. Release. 108, 237-243 (2005).
  64. Zhang, Y. Z., et al. Coaxial electrospinning of (fluorescein isothiocyanate-conjugated bovine serum albumin)-encapsulated poly(epsilon-caprolactone) nanofibers for sustained release. Biomacromolecules. 7, 1049-1057 (2006).
  65. Schnell, E., et al. Guidance of glial cell migration and axonal growth on electrospun nanofibers of poly-epsilon-caprolactone and a collagen/poly-epsilon-caprolactone blend. Biomaterials. 28, 3012-3025 (2007).
  66. Ma, Z., He, W., Yong, T., Ramakrishna, S. Grafting of gelatin on electrospun poly(caprolactone) nanofibers to improve endothelial cell spreading and proliferation and to control cell Orientation. Tissue Eng. 11, 1149-1158 (2005).
  67. Peesan, M., Rujiravanit, R., Supaphol, P. Electrospinning of hexanoyl chitosan/polylactide blends. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 17, 547-565 (2006).
  68. Jia, Y. -T., et al. Fabrication and characterization of poly (vinyl alcohol)/chitosan blend nanofibers produced by electrospinning method. Carbohydr. Polym. 67, 403-409 (2007).
  69. Kenawy, E. -R., Abdel-Hay, F. I., El-Newehy, M. H., Wnek, G. E. Controlled release of ketoprofen from electrospun poly(vinyl alcohol) nanofibers. Mater. Sci. Eng., A. 459, 390-396 (2007).
  70. Zhang, C., Yuan, X., Wu, L., Han, Y., Sheng, J. Study on morphology of electrospun poly(vinyl alcohol) mats. Eur. Polym. J. 41, 423-432 (2005).
  71. Hong, K. H. Preparation and properties of electrospun poly(vinyl alcohol)/silver fiber web as wound dressings. Polym. Eng. Sci. 47, 43-49 (2007).
  72. Bhattarai, S. R., et al. Novel biodegradable electrospun membrane: scaffold for tissue engineering. Biomaterials. 25, 2595-2602 (2004).
  73. Grafahrend, D., et al. Biofunctionalized poly(ethylene glycol)-block-poly(ε-caprolactone) nanofibers for tissue engineering. J. Mater. Sci.: Mater. Med. 19, 1479-1484 (2008).
  74. Riboldi, S. A., Sampaolesi, M., Neuenschwander, P., Cossu, G., Mantero, S. Electrospun degradable polyesterurethane membranes: potential scaffolds for skeletal muscle tissue engineering. Biomaterials. 26, 4606-4615 (2005).
  75. Gugerell, A., et al. Electrospun poly(ester-urethane)- and poly(ester-urethane-urea) fleeces as promising tissue engineering scaffolds for adipose-derived stem cells. PLoS ONE. 9, e90676 (2014).
  76. Nair, P. A., Ramesh, P. Electrospun biodegradable calcium containing poly(ester-urethane)urea: synthesis, fabrication, in vitro degradation, and biocompatibility evaluation. J. Biomed. Mater. Res., Part A. 101, 1876-1887 (2013).
  77. Caracciolo, P., Thomas, V., Vohra, Y., Buffa, F., Abraham, G. Electrospinning of novel biodegradable poly(ester urethane)s and poly(ester urethane urea)s for soft tissue-engineering applications. J. Mater. Sci.: Mater. Med. 20, 2129-2137 (2009).
  78. Hong, Y., et al. A small diameter, fibrous vascular conduit generated from a poly(ester urethane)urea and phospholipid polymer blend. Biomaterials. 30, 2457-2467 (2009).
  79. Pego, A. P., et al. Preparation of degradable porous structures based on 1,3-trimethylene carbonate and D,L-lactide (co)polymers for heart tissue engineering. Tissue Eng. 9, 981-994 (2003).
  80. Niu, H., Wang, H., Zhou, H., Lin, T. Ultrafine PDMS fibers: preparation from in situ curing-electrospinning and mechanical characterization. RSC Adv. 4, 11782-11787 (2014).
  81. Kim, Y. B., Cho, D., Park, W. H. Electrospinning of poly(dimethyl siloxane) by sol–gel method. J. Appl. Polym. Sci. 114, 3870-3874 (2009).
  82. Kenawy, E. -R., et al. Release of tetracycline hydrochloride from electrospun poly(ethylene-co-vinylacetate), poly(lactic acid), and a blend. J. Control. Release. 81, 57-64 (2002).
  83. Uykun, N., et al. Electrospun antibacterial nanofibrous polyvinylpyrrolidone/cetyltrimethylammonium bromide membranes for biomedical applications. J. Bioact. Compat. Polym. 29, 382-397 (2014).
  84. Panthi, G., et al. Preparation and characterization of nylon-6/gelatin composite nanofibers via electrospinning for biomedical applications. Fibers Polym. 14, 718-723 (2013).
  85. Pant, H. R., et al. Chitin butyrate coated electrospun nylon-6 fibers for biomedical applications. Appl. Surf. Sci., Part B. 285, 538-544 (2013).
  86. Pant, H. R., Kim, C. S. Electrospun gelatin/nylon-6 composite nanofibers for biomedical applications. Polym. Int. 62, 1008-1013 (2013).
  87. Correia, D. M., et al. Influence of electrospinning parameters on poly(hydroxybutyrate) electrospun membranes fiber size and distribution. Polym. Eng. Sci. 54, 1608-1617 (2014).
  88. Tong, H. -W., Wang, M. Electrospinning of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibrous tissue engineering scaffolds in two different electric fields. Polym. Eng. Sci. 51, 1325-1338 (2011).
  89. Carampin, P., et al. Electrospun polyphosphazene nanofibers for in vitro rat endothelial cells proliferation. J. Biomed. Mater. Res., Part A. 80, 661-668 (2007).
  90. Lin, Y. -J., et al. Effect of solvent on surface wettability of electrospun polyphosphazene nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 115, 3393-3400 (2010).
  91. Zhang, J., et al. Engineering of vascular grafts with genetically modified bone marrow mesenchymal stem cells on poly (propylene carbonate) graft. Artif. Organs. 30, 898-905 (2006).
  92. Nagiah, N., Sivagnanam, U. T., Mohan, R., Srinivasan, N. T., Sehgal, P. K. Development and characterization of electropsun poly(propylene carbonate) ultrathin fibers as tissue engineering scaffolds. Adv. Eng. Mater. 14, B138-B148 (2012).
  93. Welle, A., et al. Electrospun aliphatic polycarbonates as tailored tissue scaffold materials. Biomaterials. 28, 2211-2219 (2007).
  94. Khanam, N., Mikoryak, C., Draper, R. K., Balkus, K. J. Electrospun linear polyethyleneimine scaffolds for cell growth. Acta Biomater. 3, 1050-1059 (2007).
  95. Xu, X., Zhang, J. -F., Fan, Y. Fabrication of cross-linked polyethyleneimine microfibers by reactive electrospinning with in situ photo-cross-linking by UV radiation. Biomacromolecules. 11, 2283-2289 (2010).
  96. Wang, S., et al. Fabrication and morphology control of electrospun poly(Γ-glutamic acid) nanofibers for biomedical applications. Colloids Surf. B. 89, 254-264 (2012).
  97. Sakai, S., Yamada, Y., Yamaguchi, T., Kawakami, K. Prospective use of electrospun ultra-fine silicate fibers for bone tissue engineering. Biotechnol. J. 1, 958-962 (2006).
  98. Yamaguchi, T., Sakai, S., Kawakami, K. Application of silicate electrospun nanofibers for cell culture. J. Sol-Gel Sci. Technol. 48, 350-355 (2008).
  99. Vazquez, G., Alvarez, E., Navaza, J. M. Surface-tension of alcohol plus water from 20-degrees C to 50-degrees. C. J. Chem. Eng. Data. 40, 611-614 (1995).
  100. Hoke, B. C., Patton, E. F. Surface tensions of propylene glycol water. J. Chem. Eng. Data. 37, 331-333 (1992).
  101. Azizian, S., Hemmati, M. Surface tension of binary mixtures of ethanol + ethylene glycol from 20 to 50. C. J. Chem. Eng. Data. 48, 662-663 (2003).
  102. Nayak, B. K., Caffrey, P. O., Speck, C. R., Gupta, M. C. Superhydrophobic surfaces by replication of micro/nano-structures fabricated by ultrafast-laser-microtexturing. Appl. Surf. Sci. 266, 27-32 (2013).

Tags

Bioengineering Electrospinning electrospraying polycaprolacton poly (lactid microfiber nanofiber mikropartikler superhydrophobic biomaterialer drug delivery biologisk nedbrydelige overfladebelægninger.
Opdigte superhydrofobe Polymere materialer til biomedicinske anvendelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kaplan, J., Grinstaff, M.… More

Kaplan, J., Grinstaff, M. Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (102), e53117, doi:10.3791/53117 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter