Introduction
Forståelse af de mekanismer, som membranproteiner opfylder deres cellulære funktion kan ofte være en udfordrende opgave, fordi deres virkemåder ofte defineres af lav affinitet interaktioner, som er vanskelige at påvise og vurdere ved konventionelle biokemiske metoder. Membranproteiner kan endvidere være stærkt beriget i specifikke membrandomæner 5,6 eller danner dynamiske strukturer af højere orden, som kan principielt ændrer deres biologiske aktivitet 7.
Ikke-invasiv laser-assisteret enkelt molekyle fluorescens mikroskopi er dermed blevet den metode valg til at studere protein adfærd i komplekse cellulære miljøer. Dette er især tilfældet for biokemiske processer, der foregår på plasmamembranen, da disse kan i princippet blive overvåget i støj-reduceret total intern refleksion (TIRF) tilstand. Her prøvebelysning er begrænset til en op til 200 nm-tynd skive i umiddelbar nærhed af et glas surface, hvilket resulterer i et betydeligt tab i cellulær baggrund og på grund af de særlige kendetegn ved den kortvarige excitationslys, også i en betydelig stigning i fluorescens signalintensitet 8,9. Begge dele er vigtige, når der sigtes efter høj positionelle og tidsmæssig opløsning i enkelt molekyle detektion.
Plane SLBs er ikke kun kompatibel med TIRF mikroskopi. Når funktionaliserede med passende ligander de giver også direkte adgang til at studere de molekylære dynamik celle-celle genkendelse som de forekommer i immunceller eller andre celler. De kan også simpelthen anvendes til at positionere bevægelige og ellers ikke-adhærente celler tæt nok på objektglasset, således at sådanne celler kan afbildes i TIRF belysning, hvilket er meget ønskeligt, når ledningsforstyrrelser forsøg med enkelt molekyle sporing eller enkelt molekyle-baserede superresolution. Med henblik herpå proteiner skal læsses på en meget mobil SLB. En iboende fordel ved den anvendte li PID'er er, at der ikke er nogen uspecifik binding af proteiner overhovedet. Desuden kan SLBs betragtes som todimensionale væsker med en iboende evne til at helbrede sig selv; uregelmæssigheder i understøtningen glas kompenseres op til en vis grad. En trin-for trin-protokollen er fastsat til at generere meget mobile dobbeltlag ladede med proteiner af interesse. Dannelsen af plane SLBs er beskrevet, som indeholder 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) som hovedingrediens (90-99%) og de syntetiske og funktionaliserede lipid 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3 - {[N (5-amino-1-carboxypentyl) -iminodieddikesyre] succinyl} nikkel salt (DGS NTA-Ni) i lav tæthed (1-10%). POPC bærer en mættet fedtsyre og en mono-umættet fedtsyre og danner lipiddobbeltlag med høj fluiditet, selv ved stuetemperatur. DGS NTA-Ni binder med sin hovedgruppe til poly-histidin haler og tjener som anker for poly-histidin-mærkede proteiner af valg (figur 1).
"> Det er vigtigt, skal mikroskopi hardware omfatte en række eksterne enheder, som er beskrevet nedenfor. Med de oplysninger, og nogle grundlæggende viden i optik og laser fysik, bør enhver biolog kunne bygge et enkelt molekyle billeddannelse setup. Sample magnetisering bør ideelt set være udført på et inverteret mikroskop i total intern refleksion (TIRF) tilstand, da dette regime reducerer falsk lys og overdreven baggrund ved ellers af cellulær autofluorescens 9. Til dette en særlig TIRF-stand mål (se nedenfor) og laserbelysning er nødvendige. Nogle forsøg vil kræve belysning gange inden for millisekunder og drives i hurtig rækkefølge. For at spare belysningstiden eller for at undgå unødig blegning forårsaget af repetitive belysning er det ofte nyttigt at opdele det udsendte lys i to eller flere spektrale kanaler. Dette giver mulighed for samtidig udlæsning af to eller flere emissionsprofiler, som kan blive en væsentlig faktor, når conducTing forsøg med Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Her emissionen som følge af enkelt excitationslys puls kan optages både fra FRET donor og FRET acceptor (som sensibiliserede emission). Kameraet skal fange nok fotoner med tilstrækkelig lav baggrund at visualisere enkelte fluoroforer løbet belysningen tid. Computer software vil være op til opgaven at synkronisere excitation lukke og billedoptagelse. En omfattende oversigt er givet nedenfor og i figur 2:TIRF-stand mål: Til objektiv-baserede TIRF belysning den numeriske apertur (NA) af målet skal være lig med eller større end 1,4 ved hjælp af standard objektglas (n = 1.515) 9. Forstørrelsen kan variere mellem 60x til 150x. Målet bør være kromatisk korrigeres for at muliggøre confocality når billeddannelse forskellige fluoroforer.
Lasere: Antallet af tilgængelige laser optioner er steget betydeligt i de seneste år. Moderne elektronisk modulerbar kontinuert bølge diode lasere er omkostningseffektive og kan betjenes med hidtil uset frekvens og hastighed. Dyrere gas ionlasere udmærke sig i laserstrålen kvalitet, men kræver ekstern lukke (se nedenfor) og ofte omfattende (vand-) afkøling.
Excitation skodder: akustisk-optiske modulatorer (AOM) giver hurtig lukke hurtigt efter hinanden 10. Anbefales til stram lukke kombinationen af en AOM med mekaniske skodder. På denne måde omfattende opvarmning af AOM grundet konstant lys eksponering undgås og lys lækker fra AOM i off-positionen er annulleret ud.
Linser bruges til at udvide laserstråler og koncentrere dem på bagsiden brændplan af målet. På denne måde excitationslyset forlader formål som en parallel stråle (figur 3), som er nødvendig for TIRF belysning afprøven. Flytning omdrejningspunktet i ryggen brændplan fra centrum til periferien af mål vil ændre den vinkel, hvor strålen forlader mål, men ikke placeringen af laserpunktet ved prøven (figur 3), som er en funktion af den samlede stråle geometri. TIRF belysning ensues på et kritisk vinkel, der kan justeres ved hjælp af et sæt spejle fungerer som et periskop at oversætte omdrejningspunktet for laseren inden brændplanet af målet. Linserne skal kromatisk korrigerede og kan anvendes i et sæt af to eller tre linser. En tre-linsesystem består af to linser, der fungerer som et teleskop at udvide laserstrålen (og dermed belysningen stedet på modellen) og en tredje linse til at fokusere den udvidede stråle ind i bagsiden brændplan af målet (figur 4). Begge funktioner (teleskop og fokusering) kan også opnås ved en kombination af kun to linser (se figur 4).
Spejle bør være mindst 95% reflekterende for at undgå tab af laserlys. For hver bjælke justering et sæt af to spejle anvendes sædvanligvis som sådan arrangement er tilstrækkelig til præcist at indstille enhver vinkel og position af en laserstråle.
Dikroiske overlejringer reflektere og transmittere lys forskellige specificerede bølgelængder, og er vant til at overlejre eller splitte bjælker af to lasere.
Polychroic filtre er mere komplekse end dichroic filtre og der er behov for at reflektere indkommende excitationslys og transmittere spændende emission lys fra prøven. De er placeret i filteret terningen mellem objektiv og mikroskop rør linse.
Ryd op filtre: Afhængig af type laser employe d laser rense filtre med en smal transmissionsbåndbredde skal placeres ind i laserstrålen lige efter den forlader laseren.
Notchfiltreer designet til effektivt at absorbere laserlys med en smal båndbredde og transmittere alle andre lys. De er placeret inden emissionen vej at bortfiltrere enhver falske laser excitation lys. Men notch filtre fungerer kun ved 0 ° indgående vinkel. Hvis båndbredden af båndstopfilteret er meget skarp, kan de forskellige indkommende vinkler ikke afspejles mere. Blokering af kollimeret laser laserlys er ikke påvirket, men tilbagekastet lys muligvis ikke effektivt hindres i at nå kameraet.
Motoriserede filterhjul udstyret med passende filtre hjul let kan placeres i excitation og emission pathway og tillade simpel omskiftning mellem forskellige lysintensiteter (når udstyret med ND-filtre) eller fluorescerende kanaler (når det anbringes foran en xenon eller kviksølvbuelampe for ratiometrisk calcium billeddannelse eller foran kameraet til at vælge for at udsende fluorophor).
50:50 cube stråledeler cen bruges til at spalte laserstråler i to separate excitationsstrålen stier og også at kombinere dem foran periskop.
Stråledeler (emission sti): Til hurtig billedoptagelse uden behov for fysisk filter ændringer er udledningen strålen opdeles i et blåt forskudt og rødforskudt kanal. I princippet kan stråledelere bygges ved anvendelse af en dikroisk kile eller et sæt af spejle og et dikroisk spejl til at adskille emission bjælke i en bølgelængde-afhængig måde. To emissionsfiltre er nødvendige for at rense de udsendte kanaler.
Spatialfilteret: rumlig filtrering af excitationsstrålen kræves undertiden for at fjerne ikke-parallelle lysstråler, der udsendes fra lav kvalitet laserstråler. En rumlig filter består af et to-linse teleskop med en lille pinhole placeret præcis på omdrejningspunktet for begge linser. På denne måde falske lys som følge af manglende parallelle dele af laserstrålen bliver effektivt blokeret. Such betingelser skal være opfyldt, når oprettelse TIRF-baserede mikroskopi. Rumlige filtrering stiger med mindre porer, som er sværere at placere i det omdrejningspunkt, og med mindre brændvidder af den første linse. For at reducere virkninger forårsaget af linseaberrationer er det fordelagtigt at anvende i stedet for simple linser høj kvalitet og uendeligt korrigeret mikroskop mål med lav forstørrelse (10x 20x) eller.
Periscope: et periskop opsætning er nødvendigt at oversætte den fokuserede laserstråle i ryggen fokalplan af målet, en forudsætning for TIRF billeddannelse. Det kan let bygges af to to-tommers spejle, en translationel fase for at justere det første spejl og en stilling til at placere det andet spejl til at reflektere det udvidede og fokuseret excitationsstråle i mikroskopet (figur 5).
Kamera: Back-belyst Electron-Multiplying Charge Coupled Devices (EMCCD) anvendes rutinemæssigt tilregistrering af enkelt molekyle signaler. Dette er på grund af deres høje kvanteudbytte (op til 95%), høj erhvervelse hastighed (op til 30 MHz) og forholdsvis lav støj. Nedkøling til -80 ° C reducerer termisk støj og støttes af en række aktuelt tilgængelige EMCCD kameraer. En begrænsning af EMCCD teknologi er, at kameraet støj stiger lineært med både kameraet forstærkning og signalet blive fanget. Dette er ikke tilfældet med videnskabelige CMOS (sCMOS) kameraer, som er betydeligt billigere og opererer på grund af den særlige arkitektur sCMOS chippen også meget hurtigere end EMCCD kameraer. Men et problem forbundet med CMOS-teknologi er, at billedoptagelse mangler stadig en vis grad af en kvantitativ udlæsning på et enkelt molekyle niveau, fordi hver pixel har forskellige detekteringsfølsomhed. I princippet kan dette blive kompenseret gennem pixel normalisering, men denne procedure er på ingen måde trivielle 11. Det er derfor, vi stadig tøver med at rerose sCMOS kameraer til enkelt molekyle mikroskopi, men i betragtning af den hurtige udvikling af denne teknologi, kan sCMOS kameraer snart blive kameraet valg. Langsomme scan CCD-kameraer kameraer undgår forstærkning-relaterede støj og pixel varians alle sammen og støtte hurtigste erhvervelse satser, hvis de kan betjenes i en såkaldt 'kinetic' mode. I denne tilstand hele kamerachippen bortset fra et område af interesse (ROI) er maskeret, hvilket gør det muligt at anvende selve chippen som en lagringsenhed. Efter ROI udsættes for første gang, er de resulterende afgifter flyttet ind den maskerede område af chippen pixellinje pixel linje, hvor billedet er beskyttet mod yderligere udsættelse for lys. Når flytning af rør til ROI i den maskerede regionen er afsluttet (i sub-millisekunder), ROI selv er klar til næste eksponering. Denne cyklus gentages, indtil alle pixellinjer af CCD-chip bliver opkrævet. Chippen aflæses derefter langsomt ud med markant Reduced udlæsning støj. For eksempel på en 1000 x 1300 pixel chip, kan der optages 20 ROI'er af 50x50 pixel i hurtig rækkefølge. Fordi billederne forbliver på chippen i lang tid, før de udlæses, er det vigtigt at sikre høj kvalitet maskering og til nedkøling af kameraet (fx med flydende nitrogen) som et middel til at reducere overdreven termisk støj. Nogle EMCCD kameraer understøtter også den kinetiske tilstand.
Software: Timing af lasere, skodder, AOMS og kamera eksponering samt ordentlig billede opbevaring er en integreret enhver succesfuld billeddannelse eksperiment. I princippet kan programmeres mange definerede operationer med tilgængelige softwarepakker, der følger med kameraet. Kommercielle softwarepakker understøtter et stort antal hardware periferiudstyr, som kan gennemføres med lidt teknisk knowhow.
Puls generator dataopsamling (DAQ) bord (med analoge og digitale output kanaler) og oscilloskop: En puls generator er enfremragende valg til at konvertere triggerimpulser til impulser med defineret tid og spænding. Denne måde lasere kan styres præcist for udgangseffekt og timet i millisekund til sub-millisekunder. DAQ brædder med analoge udgange opnå samme og er let integreret i computerens bundkort via PCI slots. Pulse varighed, amplitude og frekvens kontrolleres med et oscilloskop.
Kabinet af hele excitation strålegangen: For at undgå udsving i excitation profilen grund af luft Konvektionsriste hele excitation strålegangen bør lukkede fra dets laboratorium miljø. Denne foranstaltning er især vigtigt, når der udføres TIRF mikroskopi. Optiske komponenter er også beskyttet mod støv og det menneskelige øje fra laserlys eksponering. Anlæggene kan være nemt bygge fra sort kort bord, som kan købes i kunst levering butikker.
Til bestemmelse af viskositeten af SLB Fluorescens Recovery Efter Photobleaching (FRAP) målinger 12 udføres. Er eksistensen af to excitation strålebaner for FRAP tilrådeligt (se figur 3). Den første strålebane er designet til at afbilde fluorescens af dobbeltlaget. Dette kan gøres i TIRF konfiguration og med en lav lysintensitet. Den anden strålegang bør give mulighed for en kort, men intens blegemiddel puls og skal konfigureres i ikke-TIRF tilstand, således at den forlader mål langs den optiske akse. En rund blænde kan placeres i excitationsstrålen sti (se figur 8) at projicere et perfekt rund blegemiddel profil med definerede kanter. For at billedet denne åbning på objektplanet, ville dens optimale position være i brændplanet af linsen 3 (se figur 3). Men på grund af den lange brændvidde på denne linse, en åbning, der er tilstrækkelig kvalitet kan også genereres, når åbningen er placeret ved lidt forskudt positioner.
Efter at have udført than billedbehandling eksperiment de rå data skal analyseres korrekt. Flere trin-for-trin-protokoller tilbydes, som dækker tilpasningen af de vigtigste indstillinger (f.eks belysning magt og tid, TIRF vinkel), erhverve og analysere dataene.
Protocol
1. Generation og Funktionalisering af Planar SLBs
- Blanding af lipiderne
- For at nå frem til en 10% DGS NTA-Ni / 90% POPC lipidsammensætning opløses 45 mg af POPC og 6,9 mg DGS NTA-Ni i chloroform i en 250 ml rundbundet kolbe. Hold lydstyrken chloroform lav (kun nogle ml) til at fordampe det i det næste trin. For en 1% DGS NTA-Ni / 99% POPC lipidsammensætningen bruge 49,5 mg POPC og 0,69 mg DGS NTA-Ni.
- Fjern chloroform under anvendelse af en rotationsfordamper langsomt - en stigning over omgivelsernes temperatur er ikke nødvendigt. Alternativt, blæse den ud i en kemisk hætte i en strøm af inert gas såsom nitrogen eller argon. Mens dette konstant vende kolben for at tillade lige aflejring af tørring lipid på den nederste halvdel af den rundbundede kolbe.
- Når størstedelen af chloroform inddampes, fastgøre kolben til vakuum O / N for at fjerne chloroform kvantitativt.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at undgå forureningaf proteiner og celler med giftige kloroform på senere stadier og sikre lipiddobbeltlag flydende.
- Generering af små unilamellare vesikler (SUV) fra tørrede lipider
BEMÆRK: Små unilamellare vesikler (SUV'er) er mellem 20 nm og 100 nm i diameter og kan let fremstilles ved badsonikering. Lipid ekstrudering, en alternativ fremgangsmåde kan give anledning til SUV'er og afhængig af porestørrelsen af filteret anvendes til ekstrudering, også store unilamellare vesikler (LUV'er), der er 100 nm til 1000 nm i størrelse. Men SUV'er er bedst egnet til at danne SLBs.- SUV'er gennem bad lydbehandling (vist i videoen):
- Degass PBS. Suspendere den tørrede lipidblanding med 250 ml rundbundet kolbe i 10 ml afgasset PBS.
- Fyld kolben med inaktiv gas, såsom nitrogen eller argon, lukke den med en prop og forsegle kolben med autoklaven tape.
- Placer forseglet kolbe i et bad-sonikator og sonikeres lipidsuspensionen ent 120-170 W, indtil det er blevet klart. Det tager mellem 30 og 60 minutter.
- Overvåge status for vesikeldannelse spektrofotometrisk: sådan måde, at absorptionen af ufortyndet emulsion sammenlignet med PBS forbliver konstant ved 234 nm (som en omtrentlig indikator for lipidkoncentration) Endnu bør falde betydeligt ved 550 nm (som følge af reduceret lysspredning via større partikler).
- At pelletere tunge ikke-unilamellare vesikler, som interfererer med dannelsen af en sammenhængende SLB pelletere vehikelsuspension ved centrifugering ved 150.000 x g i 1 time ved 25 ° C og derefter i 8 timer ved 288.000 xg, 4 ° C.
- Filtrer supernatanten gennem et sprøjtefilter med en porediameter på 0,2 um.
- Måle OD ved 234 nm og 550 nm til at overvåge klarhed Vehikelpræparationen og mængden af lipid venstre.
- Opbevar vesiklerne ved 4 ° C under argon eller nitrogen. Eventuelt bruge vehikelsuspension for dobbeltlaget præparati flere måneder.
- SUV'er gennem lipid ekstrudering:
- Kort sagt, passerer lipidsuspensionen flere gange gennem et filter med en porestørrelse på 0,1 um. Uanset hvilken fremstillingsmetode, centrifugeres vehikelsuspension to gange (1H, 150.000 g, 25 ° C og derefter 8 timer, 4 ° C, 288.000 g) for at pelletere ikke-unilamellare vesikler som er tungere.
BEMÆRK: Når opbevaret ved 4 ° C under inert gas, kan vesikler anvendes til fremstilling dobbeltlag i flere måneder.
- Kort sagt, passerer lipidsuspensionen flere gange gennem et filter med en porestørrelse på 0,1 um. Uanset hvilken fremstillingsmetode, centrifugeres vehikelsuspension to gange (1H, 150.000 g, 25 ° C og derefter 8 timer, 4 ° C, 288.000 g) for at pelletere ikke-unilamellare vesikler som er tungere.
- SUV'er gennem bad lydbehandling (vist i videoen):
- Dannelse af en SLB og opladning med protein
- Behandl 24 x 50 mm # 1.5 objektglas med en 3: 1 blanding af koncentreret svovlsyre og 30% hydrogenperoxid i 30 min.
BEMÆRK: På grund af den aggressive karakter af blandingen tage særlig pleje, dvs bære en laboratoriekittel og beskyttelsesbriller, som vist i videoen! - Skyl objektglas under en strøm af Hedeselskabet 2 O ud af en sprøjteflaske. Læg dem på en Teflon stativ og lad dem tørrei 10 til 30 min.
- Fjern den nederste glasplade på 8 eller 16 vel kamre, fylde bunden med epoxy lim og omhyggeligt placere en ren og tør glasplade på lim-dækket kammer bund. Lad limen hærde i ca. 10 minutter. Fjern overskydende lim fra bunden.
BEMÆRK: En stram tætning mellem objektglasset og kammeret kan også let opnås ved anvendelse af en dental to-komponent silikone modellering pasta, som hærder inden for 10 til 30 min. Denne forsegling er ikke så fast som epoxylim, men tåler regelmæssig fysisk belastning. Efter forsøget den let kan fjernes fra kammeret, som derefter kan genbruges i fremtidige forsøg. - Pipette 120 pi (60μl) af en 10-fold PBS-fortyndet lipid suspensionen i hver brønd på en 8 (16) - godt kammer (fremstillet som beskrevet ovenfor) og lad dobbeltlaget form til 20 min. Skyl grundigt dobbeltlaget to gange med 15 ml PBS. Når dobbeltlaget er dannet, skal det altid nedsænket i puffer og aldrig udsættes for luft. Fyld hver brønd hele vejen med PBS, derefter tage ud 330μl (8-brønd kammer) eller 165μl (16-brønd kammer). Der er 350μl (175μl) tilbage i brønden. Tilføj 50 pi (25 pi) cocktail indeholdende His-mærkede proteiner fortyndet i PBS til hver brønd (400 eller 200 pi endelig) og inkuberes ved stuetemperatur i 60 minutter i mørke. Overfladeproteinet densitet kan justeres ved at variere proteinkoncentrationen under denne inkubering trin.
- Skyl hver brønd to gange med 15 ml PBS.
BEMÆRK: Typisk skal SLBs skal anvendes i forsøg ikke længere end 6 timer efter deres opladning med protein. I denne periode, fluorofor bedring efter fotoblegning fortsat op til 95% og kan påvises noget tab i dobbeltlag-associeret protein. Proteinet tæthed skal bestemmes inden forsøget (se nedenfor). - Valgfrit trin: For at teste for ikke-specifik binding af proteinet DGS NTA-Ni indeholdende SLB vaske SLB gang med PBS indeholdende 300 mM imidazol. ProTEIN skulle komme helt af.
- Behandl 24 x 50 mm # 1.5 objektglas med en 3: 1 blanding af koncentreret svovlsyre og 30% hydrogenperoxid i 30 min.
2. Mikroskop Opsætning
- For at opbygge et mikroskopisystem stand til at detektere fluorescens af enkelte fluorochromer henvises til anbefalingerne nævnt i indledningen.
3. Power Målinger
BEMÆRK: Fluoroforer kan let mættet med overskydende excitationslys. Dette accelererer fotoblegning uden yderligere gevinst i emission og bør derfor undgås. For at optimere prøve belysning excitation effekttæthed bør måles direkte på prøven. Sådanne målinger kan også tjene som en reference for fremtidige eksperimenter. Endvidere kende forholdet mellem input og output lasereffekt er nyttig ved vurderingen hvor lyset er tabt i billeddannende system.
- Flyt excitationsstrålen i opretstående stilling, så det forlader mål i en 90 ° vinkel.
- Placer lederen af power meter på toppen of strålen og måle kraften af strålen (= P). Dokument resultatet.
- Ved hjælp af periskop, drej bjælken i TIRF position og image en intakt homogen fluorescerende dobbeltlag. For at undgå blegning og CCD signalmætning sted en neutral tæthed (ND) filter med en optisk densitet (OD) på 2 til 3 til excitation strålegangen.
- Mål de integrerede tællinger af hele det oplyste felt (= Jeg alt). Også måle størrelsen af det belyste område (= alt). Mål de integrerede tællinger (= I midten) på maksimalt belyst center stedet samt størrelsen af stedet (= A center).
- Mål baggrundssignalet per pixel (= B) enten uden det belyste område eller uden prøve belysning.
- Trække baggrundssignalet fra resultaterne målt i 3.). Gør dette ved at gange antallet af pixels i det pågældende område (hele belyste område eller center spot) med baggrundentællinger per pixel. (= Jeg alt - alt .B og jeg Center - Et center .B).
- Opdele integreres og baggrundskorrigeret signal af centret stedet af den integrerede og baggrunden korrigeret signal for hele området for belysning.
BEMÆRK: Resultatet angiver den del af den samlede effekt ligger i centrum stedet (= (I midten - Et center .B) / (jeg alt - alt .B)). Multiplikation af dette resultat med magt P målt i 2.) resulterer i magt lys lysende center stedet. - Bestemme størrelsen af stedet Et center i μm². Til dette opdele kamera pixelstørrelsen i um ved forstørrelse af det mål, tage kvadratet på resultatet som μm² per pixel.
- Alternativt måler pixelstørrelsen i billedet med anvendelse af en mikrometer slide placeret på mikroskopet og tage kvadratet af resultatet som areal pr pixel. Multiply denne værdi med antallet af pixels placeret i centrum stedet at nå frem til det oplyste pletareal.
- Opdele effekt P lysende centrum stedet af størrelsen af centret plet A center, μm² at beregne belysningsintensiteten pr pm2. Et eksempel er givet i figur 6.
- Effekttæthed målt i ikke-TIRF belysning er typisk lavere end de er til stede i TIRF illumination 13, som også afhænger af den nøjagtige vinkel, ved hvilken laserlyset reflekteres totalt. For at nå frem effekttætheder stede under TIRF belysning, billede, kalibreret fluorescerende perler af 0,1 um diameter, både i ikke-TIRF og TIRF. Forholdet mellem perle fluorescensintensiteter målt i TIRF og ikke-TIRF tilstand udgør omregningsfaktoren C, hvilket giver mulighed for konvertering af målte effekt tæthedsværdier i dem effektive under TIRF belysning (ligning 1).
effekttæthed TIRF = C • effekttæthed ikke-TIRF (ligning 1)
med C = bead intensitet T IRF / perle intensitet ikke-TIRF
4. densitetsmålinger
- Bestem den gennemsnitlige signal af individuelle fluoroforer placeret på en dobbeltlaget. Dobbeltlag-bundet MHC-molekyler fyldt med fluorescerende peptider er ideelle til dette formål, eftersom proteinet: label støkiometrien er netop en. Hvis det er nødvendigt blegemiddel alle etiketter på dobbeltlaget i synsfeltet og lad fluorescens komme til at visualisere enkelte fluoroforer.
- Optag billeder i hurtig rækkefølge (f.eks anvende en erhvervelse streaming protokol) og overvåge enkelte molekyler mobilitet over flere rammer. For yderligere information henvises til figur 7.
- Bestem enkelt molekyle og bulk fluorescens kun under denne ROI. Integrere signalet på en ROI, som er stort nok til at fange 99% eller mere af det indre emitter s punktspredningsfunktion. Når der anvendes et kamera med en pixelstørrelse på 16-20 um (angivet i fabrikantens specifikationer kamera), et objektiv med 100-gange forstørrelse og en numerisk apertur er lig med eller større end 1,45, læs region 7 med 7 pixels med intensitet højdepunkt beliggende i centrum af pladsen.
- For at bestemme baggrunden signal integrere tællinger af en tilstødende 7 med 7 pixel kvadrat, som ikke indeholder et fluorescenssignal. Træk baggrunden fra enkelt molekyle-signalet til at bestemme den korrigerede værdi for enkelt molekyle fluorescence. Vælg kun signaler, som stadig er synlige i det følgende ramme.
5. Test af integritet dobbeltlagets
- Forbered en fluorescerende dobbeltlag og placere den på mikroskopbordet som beskrevet ovenfor.
- Juster fokus og tage et billede af dobbeltlaget i TIRF tilstand. Anvend en kort, men intens blegemiddel puls i ikke-TIRF tilstand til ablatere fluorescens inden for en lille skiveformet ROI.
- Tag et billede af dobbeltlaget i lav intensitet TIRF umiddelbart efter blegning og derefter hver 5-10 sek at overvåge hastigheden af fluorescens opsving.
- Move til et andet område på dobbeltlaget og følge trin 2 og 3. Tag et andet billede i lav intensitet TIRF tilstand 5 minutter efter blegemiddel puls. Bestem intensiteten I skrive blegemiddel i blegemiddel område og sammenligne det med intensiteten før blegning I 0 ved begyndelsen af eksperimentet (ingen blegning skulle have fundet sted) for at beregne immobile fraktion (IF) som følger:
Immobile Fraktion IF (%) = (I 0 - jeg sender blegemiddel) / (I 0 - baggrunden) x 100,
med baggrund = målt intensitet inden for ROI uden excitationslys anvendes
IF bør være mindre end 10% (ideelt mindre end 5%).
Representative Results
Arkitekturen i enkelt molekyle fluorescensmikroskopi systemet er beskrevet meget detaljeret i figur 2. Individuelle dele såsom optiske komponenter og andre hardwarekomponenter er forklaret i indledningen. De optiske excitationsstråle stier, som giver anledning i en defineret måde TIRF og ikke-TIRF belysning, er vist og forklaret i figur 3 til 5. Bemærk placeringen af 50:50 stråledeler foran den første periskop spejl anbragt på et mikrometer translaterbar trin (figur 5). Denne stråledeler overlejrer den TIRF stråle anvendes til billeddannelse (angivet med grønt) og den ikke-TIRF bjælke (vist med rødt) anvendes til blegning eller blænde definerede lys-medieret aktivering prøve lokale (som beskrevet i figur 3). De kombinerede lys stier (figur 5, der er angivet i orange) afspejles via den anden periskop spejl ind bag porten på den omvendte MICRoscope. Som forklaret i figur 4 og skitseret i figur 2, gennemførelsen af to eller tre konvekse linser udvider laserstrålen profiler og fokuserer laserstrålerne på bagsiden fokalplan af målet at give anledning til to kollimerede stråler lysende prøven i TIRF og henholdsvis i ikke-TIRF.
Et eksempel på målte intensitetsværdier der er nødvendige for beregningen af effekttæthed på prøven er vist i figur 6. Den gennemsnitlige baggrund signal, der skal subtraheres fra lysstyrker målt i det oplyste og centralt område (til billeddannelse), bestemmes i en region i synsfelt, som ikke er belyst af laserstrålen (her 7089 tællinger). Baggrunden-korrigeret gennemsnitlige intensiteter af de belyste (1684 tæller) og det centrale område (4830 tæller) er derefter ganget med den tilsvarende region størrelser til at give anledning til integrerede intensiteter (1,471x 10 8 tæller for det belyste område og 3.424 x 10 7 tæller for det centrale område). Forholdet mellem de integrerede intensiteter inden for de centrale og belyste områder giver den del af den samlede effekt lysende det centrale område (0,23 eller 23%). Som vist i filmen, den samlede effekt skal bestemmes på målet med brug af et powermeter i ikke-TIRF belysning tilstand. I vores eksempel er det indstillet til 5 mW, hvilket giver anledning til en effekt på 5 mW x 0,23 = 1,15 mW i det centrale område. Siden 41,5 pixels mængde i vores eksempel 1 um 2, det centrale område har en størrelse på 7089 pixels /41.5 pixels x um 2 = 170,8 um 2. Dividere kraften i lyset lysende det centrale område (1,15 mW) ved dette område (170,8 um 2) giver en gennemsnitlig effektdensitet på 0,7 kW / cm2 inden for det centrale område.
Figur 7 er udstyret med billeder og tilsvarende intensitet resultater af enkelte fluoroforer erhvervet i hurtig rækkefølge (100 billeder per sekund, dvs. med en tidsramme på 10 ms). For intensitet kvantificering den gennemsnitlige signal af et rektangulært område af syv af syv (= 49) pixels, som dækker fluorescenssignalet, bestemmes. Endvidere gennemsnitlige signal af baggrunden bestemmes inden for et rektangulært område af syv af syv pixel i umiddelbar nærhed af enkelt molekyle signal. Baggrunden-korrigerede gennemsnitlige signal multipliceres med antallet af pixels inden for regionen (= 49), hvilket gav anledning til enkelt molekyle signal (markeret med fed).
Et repræsentativt eksperiment FRAP designet til at vurdere mobilitet SLB-associerede fluorescensmærkede proteiner er vist i figur 8. Bemærk i figur 8A den impulsfrekvenstive anvendelse af et udvidet lav intensitet imagografistrålen og engangsbrug af en anden mere snæver og blænde-definerede høj intensitet stråle for hurtig fluorochrom ablation på nul andet tidspunkt. Baggrund-korrigeret gennemsnitlige intensiteter inden den gule cirkel, som er blevet normaliseret af den oprindelige gennemsnitlige intensitet værdi forud for blegemiddel puls, er plottet i figur 8B mod tiden for at optage den hastighed og i hvilket omfang fluorescens har inddrevet. Som vist, har mere end 90% (angivet ved den grønne linje) af den oprindelige dobbeltlag intensitet inddrives inden 75 sek following fluorokrom ablation. Som følge heraf mindre end 10% af proteinerne indlejret i den viste SLB er immobile.
Figur 1. Skematisk oversigt over et SLB system. (A) SLBs er lavet af POPC (90-99%) og den syntetiske lipid DGS NTA-NI (1-10%). De danner spontant, når rene glasflader er anklaget for SUV'er, der består af de tilsvarende lipider. (B) Når dannet, disse SLBs kan let dekoreret med opløselige proteiner forlænget enten med én C- eller N-terminale tag indeholder tolv histidiner (12H, for eksempel co-stimulerende molekyle B7-1 og vedhæftningen molekyle ICAM-1) eller protein dimerer udvidet med to mærker, der indeholder seks histidiner hver (2x6H, for eksempel en αβMHC klasse II-dimer). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Oversigt over excitations- og emission strålebaner. Gas ionlasere (f.eks Ar + eller Kr +) kan drives til hurtig lukning med brug af akustisk optisk mo dulators. Lasere dioder er i dag tilgængelige i mange bølgelængder og udgør et fremragende alternativ, da de kan elektronisk moduleret i mikrosekund-vrede. Bemærk, at laserstråler kan nemt justeres med to (dichroic) spejle og split og kombineret med brugen af simple stråledelere at give anledning til to eller flere strålebaner. I dette eksempel en TIRF imagografistrålen (for at overvåge hændelser) og en blegemiddel bjælke (til enten blegemiddel fluorophorer eller foto-aktivering bur molekyler i en åbning defineret måde) anvendes. Begge excitation stier kan betjenes uafhængigt af hinanden ved hjælp af yderligere skodder. Periskopet giver mulighed for at oversætte de fokuserede laserstråler inden bagsiden fokalplan af målet for at generere TIRF belysning af prøven. Den fluorescerende billede kan spektralt opdeles ved brug af en emission stråledeler før overtagelsen med anvendelse af en ultra-følsomme kamera (f.eks EM-CCD eller videnskabelig CMOS kamera)..com / filer / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Justering af TIRF belysning ved at oversætte den fokuserede stråle i ryggen fokalplan af målet Som vist omdrejningspunktet for laserstrålen. Forskydes i ryggen fokalplan af målet fra centrum til periferien gennem translokation af bjælken (ved anvendelse af et periskop spejl arrangement). Som et resultat en parallel stråle forlader mål i en skrå belysning, indtil en kritisk vinkel nås hvilket sker total intern refleksion. Den kortvarige felt genereres ved glas-media interface, hvor total refleksion opstår. Klik her for at se en større version af denne fi gur.
Figur 4. Enkle optiske systemer til at fokusere laserstrålen ind i bagsiden brændplan af målet. Tre eller to linser er nødvendige for at udvide laserstrålen og fokusere den på bagsiden brændplan TIRF mål. To linse systemer indeholder færre linse-associerede fejl end tre-linse systemer og kan være bedre egnet til at generere TIRF billedbehandling stråle. Tre linser ville være at foretrække, når der sigtes for definerede stråle udvidelse og en belysning plet med skarpe kanter, som vil være behov for undersøgelser, der beskæftiger foto-aktivering eller -bleaching. Klik her for at se en større version af dette tal.
/53158fig5.jpg "/>
Figur 5. Oversigt fotografi af strålegangen på bagsiden af fluorescensmikroskop. Som allerede skitseret i figur 2 en stok nemt implementere to excitation bjælker, en i TIRF (angivet med grøn) den anden i ikke-TIRF tilstand (angivet i rød). Disse bliver overlejret med anvendelse af en 50:50 stråledeler (BS). Konveks linse (L1 og L2) er anbragt i de respektive stråler til at fokusere dem på bagsiden brændplan af målet (ikke vist). Et periskop bestående af to spejle (M1 og M2) guider både stråler gennem havnen i indrejse i mikroskopet. Det første spejl (M1) kan bevæges ved brug af en oversættelse trin (TS) (ved at dreje et mikrometer skrue som angivet) til at flytte en af bjælker i TIRF position. Når TIRF er blevet etableret, kan den anden stråle (bruges til foto-blegning eller -activation, her angivet med rødt) indstilles uafhængigt af TIRF strålen til at forlade målet i ikke-TIRFtilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Måling af strøm inden det centrale område af belysningen stedet. Som anført valgte passende områder af interesse, som afspejler baggrund, hele belyste område (IA) og det centrale område (CA), hvor begivenheder vil senere blive registreret. Fratræk baggrundsværdier fra dem registreret for IA og CA og integrere de intensiteter ved at gange korrigerede gennemsnitlige intensiteter med antallet af pixels til stede i hvert område (= integreret intensiteter). Opdel integrerede intensitet af denne CA IA at nå frem til den andel af strålen effekt lysflade CA (i dette eksempel: 23%). Bestem magt lys, der belyser CA ved at multiplicere det samlede stråle strøm (her: 5 mW) med andelen lysende CA (her: 0,23). For at bestemme størrelsen af det centrale område formere området (her: 7089 pixel) med en pixel-til-arealstørrelse omregningsfaktor (her: 1 / 41,5 um 2 pixel -1). For at nå frem til den gennemsnitlige effekt tæthed excitationslyset lysende CA, opdele effekt (her: 1,15 mW) af størrelsen af CA. (Her: 170,8 um 2) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Kvantificering af enkelt molekyle signaler. (A) Tidsforløb af enkelte fluoroforer på en SLB. En 7 x 7 pixel størrelse region af interesse (ROI, gul) er placeret rundt signalet for kvantificering. Baggrund bestemmes ud fra en nærliggende 7 x 7 pixelROI (grøn). (B) Kvantificeret gennemsnitlige pixel intensiteter er angivet. For at bestemme den enkelt molekyle-signalet, er baggrundsværdier (grøn ROI) trækkes fra signalværdier (gul ROI) og ganget med 49. (C) enkelt molekyle intensiteter af en fluorophor afbildes mod tiden. Bemærk, at de 90 msek tidspunkt er udeladt, da fluoroforen er i færd med blegning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Fluorescens Recovery Efter Fotoblegning (FRAP) analyse for at bestemme integriteten af SLB. (A) FRAP blev udført på et dobbeltlag bærer IEK / MCC-Alexa Fluor 647. Hver 10. Billede af forsøget er vist. (B) FRAP kvantificering af forsøget er vist i (A). Værdier indikerer gennemsnitlige intensiteter (I) inden for det gule ROI vist i (A) divideret med den oprindelige intensitet (I o) før blegning. Rød datapunkter vises i (A), den grønne linje angiver 0,9 genvinding af originale intensiteter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Enkelt molekyle mikroskopi giver en enestående mulighed for at studere opførslen af proteiner i deres oprindelige cellulære miljø. Molekylær billeddannelse bliver derfor mere og mere attraktiv for en bred videnskabelige samfund, men mange liv forskerne stadig vige tilbage fra den oprindelige investering i teknologi og ekspertise. Den vigtigste fordel ved montage ens eget imaging system er, at det let kan tilpasses til alle specifikke behov.
Som foreslået heri en ikke-TIRF excitation stråle kan let gennemføres ud over en eksisterende TIRF strålegang, hvis hurtig og defineret foto-blegning (eller -activation) af fluoroforer og ligander ønskes, f.eks når du udfører FRAP eller ligand uncaging eksperimenter 14 . Indførelsen af en emission stråledeler muliggør samtidig optagelse af mindst to og i nogle tilfælde op til fire fluorescerende kanaler. Listen over udvidelser er i det væsentlige kun begrænset afens egen fantasi.
For eksempel, at gennemføre en motoriseret emission filterhjulet i emissionen vej muliggør hurtig skift mellem op til ti forskellige fluorescerende kanaler. Når man kombinerer to motoriserede emission filter hjul (hver er udstyret med 10 filter slots) i serie, op til 18 fluorescerende kanaler kan udlæses. TIRF-baserede imaging kan suppleres med calcium mobilisering målinger og Interferens Reflection Microscopy (IRM) efter integration af en Xenon eller Mercury excitation lampe sti. IRM er den foretrukne metode til at visualisere i hvilken grad celler er bundet til glasoverfladen eller SLB og kan dermed give vigtig information, når TIRF-baserede billeddata tolkning. Etablering af en udvidet excitationsstråle med brug af en simpel dikroisk spejl og en yderligere laser på 405 nm tillader udførelse fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk mikroskopi genopbygning (storm), dvs. to superresolution metoder med en positionsnøjagtighed under diffraktionsgrænsen af synligt lys 15,16.
Men eksperimentel succes er ikke kun et spørgsmål om passende hardware. For at få fuldt udbytte af støj-reduceret TIRF-baserede imaging, bør celler tage kontakt til en overflade på en måde, der ikke pålægger begrænsninger på celleoverfladen eller der forstyrrer fysiologi deres plasmamembranen. SLBs funktionaliseret med passende proteiner til celleadhæsion overskrider velegnet til dette formål, fordi alle SLB-indlejrede ligander er sideværts mobile og justere deres laterale position inden dobbeltlaget i respons på receptorbinding og segregation dynamik.
At fremstille SLBs på en reproducerbar måde, er det bedst at starte ud med SUV'er med høj renhed. Som beskrevet heri, er det således afgørende at fjerne multilamellare vesikler, der også fremstilles under lydbehandling i to trin ultracentrifugering som disse interfere med dannelsen af sammenhængende SLBs featuring høj flydeevne. SLBs formelle høj kvalitet kun på rene glasflader. Når renset objektglas bør anvendes straks eller opbevares i vakuum. Vigtigt er det, skal SLBs aldrig udsættes for luft, da dette ville føre til deres forstyrrelser. SLB vask indebærer, som vist, puffer skylning med anvendelse af en serologisk pipette, da dette er ikke kun en, men også sparer tidsbesparende procedure.
Under høst og oprensning af SLB-hjemmehørende proteiner bør undgås brugen af rengøringsmidler. Dette skyldes detergent vil reducere protein mobilitet væsentligt, selv når de findes i spormængder. For at omgå behovet for detergent alle sammen, er opløselig ekspression af secerneret polyhistidinmærke udstyret ligander anbefales i mammale celler eller insektceller. Hvis genfoldning fra E.coli inklusionslegemer er påkrævet, skal der udvises forsigtighed anvendes til at fjerne vaskemidler effektivt fra inklusionslegemerne forud for deres un- og genfoldning.
En væsentlig fordel ved anvendelse af SLBs resultater fra deres modulære og reconstitutive karakter, som gør det muligt at specifikt dissekere rollen som en given receptor-ligand interaktion for celleaktivering og celleadhæsion. I denne forbindelse er det vigtigt at nævne, at DGS NTA-Ni bør være til stede ved 10% inden for SLB med henblik på at forhindre proteiner konkurrerer om NTA-Ni bindingssteder. Når der anvendes SLBs huser kun 1% eller 2% DGS NTA-Ni, en reduktion i sammenslutningen af de en given polyhistidin-mærkede protein arter kan blive bemærket, især ved samtidig inkubation stigende mængder af et andet polyhistidin-mærket proteinarter (upubliceret observation). Dette fænomen er ikke observeret, når du arbejder med SLBs featuring 10% DGS NTA-Ni.
Mens vi aldrig har observeret uspecifik binding af en hvilken som helst testet til SLBs indeholder DGS NTA-Ni polyhistidin-mærkede protein, bør denne mulighed skal testes, når der indføres et protein for første gang,Til dette formål anbefaler vi brug af SLBs blottet for DGS NTA-Ni (proteinet skal ikke binde). For det andet, når der anvendes et SLB indeholder DGS NTA-Ni, bør proteinet kommer ud helt efter vask SLB med PBS indeholdende 300 mM imidazol.
En anden væsentlig fordel ved at ansætte SLBs er, at forbigående interaktioner, signalpaneler begivenheder kan overvåges med forbedret Spatiotemporal opløsning 17-19. Dette er i det mindste delvis, fordi en tredimensional bindingsprocessen væsentlige er reduceret til to billeddannende dimensioner, især ved optagelse i støj-svækket TIRF tilstand. Brugen af SLBs er forenelig med detektion enkelt molekyle signal, en forudsætning for foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk mikroskopi genopbygning (storm), dvs. superresolution mikroskopi med en opløsning under diffraktionsgrænsen 15,16. Disse særlige billeddiagnostiske metoder gør det muligt enkelt molekyle Förster Resonance Energy Transfer eksperimenter designet til at visualisere individuelle protein-protein interaktioner i et synaptisk miljø 20. Denne fremgangsmåde er forklaret meget detaljeret i en publikation JOVE betegnet "Måling TCR-pMHC binding under anvendelse et FRET-baseret assay mikroskopi" 21.
Ved fortolkning SLB-baserede eksperimenter bør man altid huske på, at ikke alle egenskaber ved et plasma membran af en levende celle er featured af SLBs, og at nogle af de manglende kvaliteter kan påvirke fysiologi under efterforskning. Efter alt, er SLB-indlejrede proteiner frit diffundere og ikke organiseret i membran mikrodomæner som de fleste af deres cellulære modstykker er 5,6,22. Immobiliseret plasmamembran-ark afledt af adhærente celler, som bevare plasmamembranen arkitektur levende celler til en vis grad, er blevet succesfuldt anvendt til at undersøge optagelsen fra membran-indlejrede antigener ved B-lymfocytter 23. Men selv sådannemembraner ikke interagerer med en meget dynamisk cytoskelet og har ingen fleksibilitet, da de understøttes af en stiv glasoverflade. I betragtning af disse uoverensstemmelser er der et klart behov for Engineering SLBs, som tilbyder midler til at inddeler proteiner i en defineret måde, og som understøttes af overflader af justerbar fleksibilitet eller ved overflader, der ændrer deres stivhed som reaktion på lokalt anvendte lysimpulser.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
MA blev understøttet af en Schrödinger fællesskab af Austrian Science Fund (FWF, J3086-B11) og tak Max-Planck-Society for finansiel og administrativ støtte. GS blev støttet af Wien Videnskab og Teknologi Fund (WWTF, LS13-030). JH blev støttet af Wien Videnskab og Teknologi Fund (WWTF, LS14-031).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
| 250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
| 50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
| Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | - | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
| Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
| Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
| Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
| autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
| Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
| bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
| beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
| Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
| camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
| concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
| concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
| epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
| filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
| LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
| laser | Toptica | - | different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available |
| lens | Thorlabs, Newport | - | |
| DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
| POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
| microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | - | |
| mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
| optical filters | AHF, Chroma, Semrock | - | filter sets are available for many different combinations of dyes |
| oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
| periscope | Thorlabs | RS99/M | |
| picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
| power meter Lasermate-Q | Coherent | - | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
| pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
| spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
| syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
| TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
| trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
| tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
| Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
| ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
| UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | - | |
| vacuum pump | VWR | 181-0248 |
References
- Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nat Methods. 5, 475-489 (2008).
- Sahl, S. J., Moerner, W. E. Super-resolution fluorescence imaging with single molecules. Current opinion in structural biology. 23, 778-787 (2013).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 104, 20296-20301 (2007).
- Wilson, B. S., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Gaudet, E. A., Oliver, J. M. High resolution mapping of mast cell membranes reveals primary and secondary domains of Fc(epsilon)RI and LAT. The Journal of cell biology. 154, 645-658 (2001).
- Lillemeier, B. F. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11, 90-96 (2010).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature reviews. Immunology. 4, 89-99 (2004).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in cell biology. 89, 169-221 (2008).
- Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schutz, G. J. (Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophys J. 92, 3719-3728 (2007).
- Huang, F. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys J. 16, 1055-1069 (1976).
- Axelrod, D., Burghardt, T. P., Thompson, N. L.
- Huse, M., Quann, E. J., Shouts Davis, M. M. Whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nat Immunol. 9, 1105-1111 (2008).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158, 1263-1275 (2002).
- Sherman, E. Functional nanoscale organization of signaling molecules downstream of the T cell antigen receptor. Immunity. 35, 705-720 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
- Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. Measuring TCR-pMHC binding using a FRET-based microscopy assay. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Lillemeier, B. F., Schuetz, G. J., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 103, 18992-18997 (2006).
- Natkanski, E., et al. B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities. Science. 340, 1587-1590 (2013).
