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Immunology and Infection

जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों: आरएनए वायरस सकारात्मक-कतरा के अध्ययन के लिए एक कार्यात्मक जीनोमिक्स उपकरण

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53164
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

Introduction

आरएनए virologists के लिए, 1970 के दशक में पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी के आगमन के लिए यह संभव तो आरएनए वायरस की आनुवंशिक हेरफेर के लिए बैक्टीरिया में प्लास्मिडों के रूप में प्रचारित किया जा सकता है, जो सीडीएनए क्लोन, में वायरल आरएनए जीनोम परिवर्तित करने के लिए बनाया है। 1 पहले आरएनए वायरस होने की क्लोन किया molecularly जीवाणुभोजी Qβ, कोलाई को संक्रमित करता है कि एक सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस था। ई में पेश किया जब Qβ जीनोमिक शाही सेना की एक पूरी सीडीएनए प्रति युक्त एक प्लाज्मिड संक्रामक Qβ phages को जन्म दिया कोलाई। 2 शीघ्र ही, इस तकनीक, पोलियो वायरस के लिए आवेदन किया मनुष्यों और पशुओं के लिए एक सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस था। पोलियो वायरस जीनोमिक शाही सेना की एक पूरी लंबाई की सीडीएनए असर एक प्लाज्मिड संक्रामक स्तनधारी कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट और संक्रामक virions के उत्पादन में सक्षम था जब 3, क्लोन cDNAs वायरल शाही सेना प्रतिकृति आरंभ करने के लिए intracellularly लिखित होना चाहिए इस 'डीएनए का शुभारंभ "दृष्टिकोण में।प्रतिलेखन शुरू की है और कैसे टेप सही वायरल अनुक्रम को संसाधित कर रहे हैं कि कैसे हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है। यह चिंता का विषय एक विकल्प "शाही सेना का शुभारंभ" के विकास के लिए प्रेरित किया दृष्टिकोण, वायरल आरएनए जीनोम का एक पूरा सीडीएनए प्रतिलिपि एक ई द्वारा मान्यता प्राप्त एक प्रमोटर के तहत क्लोन है जिससे मेजबान कोशिकाओं में पेश किया है जब पूरा वायरल प्रतिकृति चक्र से गुजरना जो परिभाषित 5 'और' 3 Termini साथ इन विट्रो में सिंथेटिक आरएनए के उत्पादन के लिए कोलाई या फेज आरएनए पोलीमर्स। इस दृष्टिकोण के साथ पहली सफलता Brome मोज़ेक वायरस के लिए सूचित किया गया था, 4,5 , 6,7 पौधों की एक सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस। तब से, आरएनए का शुभारंभ दृष्टिकोण caliciviruses, alphaviruses, flaviviruses, arteriviruses, और coronaviruses सहित सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विकसित किया गया है। 1,4,5,8

डीएनए और दोनों में, एक ful के निर्माण रिवर्स आनुवंशिकी सिस्टम शाही सेना का शुभारंभ~ 10 एल लंबाई सीडीएनए क्लोन संक्रामक डीएनए या सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस की शाही सेना को पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह वायरल जीनोम का बढ़ता आकार के रूप में एक काफी तकनीकी चुनौती है। विशेष रूप से 9-17, की एक बड़ी आरएनए जीनोम हो जाता है -32 केबी एक पूर्ण लंबाई कार्यात्मक सीडीएनए की क्लोनिंग के लिए तीन प्रमुख बाधाओं को प्रस्तुत करता है। आरटी पीसीआर की निष्ठा वायरल शाही सेना की लंबाई के व्युत्क्रमानुपाती होती है के बाद से 18 प्रथम कठिनाई, प्रति एक वफादार सीडीएनए के संश्लेषण है। लंबे आरएनए अणुओं ई में अस्थिर प्लास्मिडों में सीडीएनए टुकड़ा बनाने में सक्षम अप्रत्याशित दृश्यों को शामिल करने की संभावना है, क्योंकि दूसरी बाधा, संभावित विषाक्त दृश्यों की उपस्थिति है कोलाई। यह> 10 केबी के एक वायरल सीडीएनए डालने घर कर सकते हैं कि एक क्लोनिंग वेक्टर खोजने के लिए मुश्किल है के बाद से तीसरा और सबसे महत्वपूर्ण मुद्दा है, एक उपयुक्त वेक्टर की उपलब्धता है। पिछले तीन दशकों में, इन बाधाओं एंजाइमिकी, कार्यप्रणाली, एक में कई प्रगति के द्वारा दूर किया गया हैडी vectorology। इनमें से 1,4,5,8, सबसे होनहार और अभिनव विकास बड़े सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस के रूप में संक्रामक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बेक्स) की क्लोनिंग है। बीएसी वेक्टर ई के आधार पर एक कम प्रतिलिपि क्लोनिंग प्लाज्मिड (1-2 प्रतियां / सेल) है औसत डीएनए डालने के आकार के साथ कोलाई उर्वरता कारक, ~ 120-350 केबी 19-21 एक डीएनए टुकड़ा सामान्य क्लोनिंग वैक्टर में क्लोनिंग के लिए एक समान फैशन में बीएसी वेक्टर में डाला जाता है। जिसके परिणामस्वरूप बीएसी क्लोन ई में कई पीढ़ियों से अधिक स्थिर रहे कोलाई। तिथि करने के लिए 22,23, बीएसी प्रौद्योगिकी यानी तीन सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस परिवारों, Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 और Coronaviridae की> 10 सदस्यों के लिए संक्रामक सीडीएनए क्लोन बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। 9,16,17 , 31,32

एक उदाहरण के रूप में जापानी इन्सेफेलाइटिस वायरस (जेईवी) का उपयोग करना, वर्तमान कार्य किया जा सकता है कि विस्तृत प्रक्रिया की रिपोर्टसकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस की एक किस्म के लिए एक आनुवंशिक रूप से स्थिर पूर्ण लंबाई संक्रामक बीएसी के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है। में होता है जो जेईवी, जेईवी संक्रमण गंभीर अक्सर घातक मस्तिष्क संबंधी बीमारी जापानी इन्सेफेलाइटिस पैदा कर सकता है मानव में एक जूनोटिक मच्छर वैक्टर द्वारा पक्षी, सूअर, और अन्य कशेरुकी मेजबान के बीच प्रकृति में फैलता है कि flavivirus 33। 34,35 है (जेई), 36 ~ 50,000-175,000 नैदानिक ​​मामलों की अनुमानित वार्षिक घटना के साथ एशिया और पश्चिमी प्रशांत, 37,38 के कुछ हिस्सों। 39,40 जेईवी के जीनोम एक ~ 11 KB, एकल असहाय, सकारात्मक भावना आरएनए अणु है और के होते हैं 5 'और 3' में दो गैर-कोडिंग क्षेत्रों (NCRs) से घिरे एक भी खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) समाप्त हो जाती है। 41,42 ओआरएफ नामित 10 व्यक्तिगत प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए मेजबान और वायरल प्रोटिएजों द्वारा cleaved है कि एक polyprotein, कूटबद्ध सी, पी आर एम, ई, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, और NS5 इसके अलावा सी टर्मिनल दिशा के लिए एन में। 34,43,44, एक ईNS1 (NS1 ') की xtended प्रपत्र कोडोन NS2A की 8-9 में से -1 राइबोसोमल frameshifting व्यक्त की है। इन 11 प्रोटीनों की 45,46, तीन संरचनात्मक प्रोटीन (सी, पी आर एम, और ई) संक्रामक के गठन के लिए आवश्यक हैं virions, 47,48 और शेष आठ nonstructural प्रोटीन (NS5 को NS1, और NS1 ') वायरल शाही सेना प्रतिकृति, 49-51 कण विधानसभा, 52-56 और सहज उन्मुक्ति चोरी के लिए महत्वपूर्ण हैं। 57-59 दोनों 5' और 3 'NCRs प्राथमिक दृश्यों और वायरल शाही सेना प्रतिकृति नियमन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं जो फार्म आरएनए माध्यमिक / तृतीयक संरचनाओं, 60-62 संरक्षित होते हैं। 63,64

इस प्रोटोकॉल एसए 14 -14-2 एक पूरी लंबाई की जेईवी के संक्रामक बीएसी पैदा करने के लिए उपकरण, विधियों, और रणनीतियों का वर्णन है। 28 यह कार्यात्मक बीएसी क्लोन एक प्रमोटर में शामिल होता है जो जेईवी जीनोमिक शाही सेना की एक पूरी सीडीएनए प्रतिलिपि, 65 में शामिल SP6 शाही सेना पोलीमर्स के लिए नदी के ऊपरवायरल 5'-अंत और इन विट्रो रन दूर प्रतिलेखन के लिए वायरल 3'अंत के बहाव के लिए एक अनूठा Xba मैं प्रतिबंध साइट की। इस बीएसी प्रौद्योगिकी सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस की एक सरणी के लिए एक पूरी तरह कार्यात्मक सीडीएनए आणविक क्लोन के निर्माण के लिए लागू है।

Protocol

नोट: चित्रा 1 एक बीएसी के रूप में एक पूरी लंबाई की संक्रामक जेईवी सीडीएनए के निर्माण के लिए एक रणनीति प्रस्तुत 28 तालिका 1 इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल oligonucleotides की एक सूची प्रदान करता है 28।।

1. सेल संस्कृति supernatants में जेईवी कण से वायरल शाही सेना निकालें

  1. जेईवी एसए 14 -14-2, जैव सुरक्षा स्तर 2 रोकथाम की आवश्यकता है कि एक जीवित जेई वैक्सीन वायरस युक्त सेल संस्कृति के माध्यम से शुरू करें।
    नोट: वायरल अनुमापांक लगभग 1-3 × 10 6 पट्टिका गठन इकाइयों / एमएल है।
  2. प्रायर जेईवी एसए 14 -14-2 के साथ काम करने के लिए सभी मानक सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रथाओं, सुरक्षा उपकरण, और प्रयोगशाला सुविधाओं के लिए आवश्यक जैव सुरक्षा प्रशिक्षण लेते हैं।
  3. फिनोल और guanidine आइसोथियोसाइनेट 66 (चित्रा 1 ए) के एक monophasic समाधान का उपयोग वायरस युक्त सेल संस्कृति के माध्यम से एक विभाज्य से वायरल शाही सेना शुद्ध।
    1. विज्ञापनघ एक 1.7 मिलीलीटर microtube में संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के 200 μl को monophasic अभिकर्मक के 600 μl। 30 सेकंड के लिए सख्ती ट्यूब हाथ मिलाते और आरटी पर 5 मिनट के लिए incubating द्वारा मिश्रण Homogenize।
    2. Homogenized नमूना क्लोरोफॉर्म के 160 μl जोड़ें। 15 सेकंड के लिए सख्ती ट्यूब हाथ मिलाते और आरटी पर 2-3 मिनट के लिए इसे छोड़ने के द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. यानी दो तरल चरणों की एक जुदाई, एक कम जैविक चरण और एक ऊपरी जलीय चरण में जो परिणाम 4 डिग्री सेल्सियस, पर 15 मिनट के लिए 13,400 × छ पर कुल lysate अपकेंद्रित्र। एक नया microtube के लिए शाही सेना युक्त ऊपरी जलीय चरण (कम से कम 200 μl) हस्तांतरण।
    4. 5 माइक्रोग्राम / μl ग्लाइकोजन के 1 μl और 100% isopropanol के 400 μl जोड़ने और आरटी पर 10 मिनट के लिए incubating द्वारा शाही सेना वेग।
    5. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,400 × छ पर मिश्रण। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पांच को पल्स-vortexing तीन से 75% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ शाही सेना गोली धोनेबार और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 13,400 × छ पर centrifuging।
    6. 10 मिनट के लिए शाही सेना गोली हवा शुष्क और DH 2 ओ के 40 μl में भंग उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर निकाले शाही सेना स्टोर।

2. चार ओवरलैपिंग सीडीएनए टुकड़े (F4 को एफ 1) रिवर्स प्रतिलेखन द्वारा पूरे वायरल जीनोमिक आरएनए (आरटी) फैले -PCR का एक सेट Synthesize

  1. एक टेम्पलेट के रूप में शुद्ध वायरल शाही सेना के एक 10 μl विभाज्य और Moloney murine ल्यूकेमिया वायरस का एक संशोधित रूप रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के साथ एक 20 μl आरटी प्रतिक्रिया प्रदर्शन करते हैं। 67
    1. 10 शुद्ध शाही सेना के μl, 1 μl 10 मिमी dNTP मिश्रण, 1 μl 4 pmol / μl प्राइमर, और 1 μl DH 2 ओ युक्त एक 13 μl मिश्रण सेट अप F4 के लिए F3 के लिए F1, 2RT F2 लिए, 3RT के लिए 1RT, और 4RT: प्रत्येक आरटी प्रतिक्रिया के लिए टुकड़ा विशिष्ट प्राइमर का प्रयोग करें।
    2. 1 मिनट के लिए, 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर जगह मिश्रण को सेते हैं, और फिर जल्दी स्पिन Conte इकट्ठा करने के लिएट्यूब के नीचे एनटीएस।
    3. Μl रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस / 4 μl 5 × आरटी बफर, 1 μl 0.1 एम डीटीटी, 1 μl 40 यू / μl RNase अवरोध करनेवाला, और 1 μl 200 यू जोड़ें। Pipetting और तीन से पांच गुना नीचे मिलाएं।
    4. प्रतिक्रिया तो 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर नमूना गर्मी निष्क्रिय, 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ना है। उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संश्लेषित पहली कतरा सीडीएनए स्टोर।
  2. एक टेम्पलेट और एक उच्च निष्ठा थर्मास्टाइबल डीएनए पोलीमरेज़ 68 (चित्रा 1 बी) के रूप में गर्मी निष्क्रिय आरटी प्रतिक्रिया का एक 5 μl विभाज्य के साथ एक 100 μl पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन करते हैं।
    1. आरटी प्रतिक्रिया के 5 μl, 20 μl 5 × पीसीआर बफर, 4 μl 10 मिमी dNTP मिश्रण, 5 μl 10 माइक्रोन आगे प्राइमर, 5 μl 10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर, 1 μl 2 यू युक्त, बर्फ पर एक 100 μl पीसीआर प्रतिक्रिया सेट अप / μl डीएनए पोलीमरेज़, और 60 μl DH 2 ओ प्रत्येक पीसीआर reactio के लिए टुकड़ा विशिष्ट प्राइमर जोड़ी का उपयोगN: एफ 1 (2573 बीपी) के लिए 1F + 1R, एफ 2 के लिए 2 एफ + 2R (4171 बीपी), F3 के लिए 3F + 3R (3922 बीपी), और F4 के लिए 4F + 4 आर (1798 बीपी)।
    2. तल पर इसकी सामग्री इकट्ठा करने के लिए उंगली flipping ट्यूब तीन से पांच गुना और सेंट्रीफ्यूज संक्षेप द्वारा धीरे मिलाएं।
    3. निम्नलिखित पीसीआर प्रोफाइल के साथ 25-30 चक्रों के बाद 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड की एक प्रारंभिक विकृतीकरण कदम है, साथ thermocycling शुरू: 98 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड, 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, और 1-2 मिनट (30 एस / 72 डिग्री सेल्सियस पर केबी)। विश्लेषण किया जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर उत्पादों की दुकान।
  3. 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल ethidium ब्रोमाइड (EtBr) (चित्रा 2) युक्त एक 0.8% agarose जेल पर प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया का एक 2-5 μl विभाज्य चलाएँ।
    चेतावनी: EtBr एक शक्तिशाली उत्परिवर्तजन है और इसके उपयोग, भंडारण, और निपटान के दौरान मनाया जा प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मा, और पहना जा करने के लिए दस्ताने और अत्यधिक सावधानी की आवश्यकता है।

3. Subclone एक बीएसी वेक्टर में चार सीडीएनए टुकड़े (F4 को एफ 1) के प्रत्येक pBAC / F4 बी को pBAC / एफ 1 बनाने के लिएY आणविक क्लोनिंग तकनीक

  1. इस प्रकार के रूप में, वेक्टर डाइजेस्ट और दो उचित प्रतिबंध endonucleases के साथ DNAs डालें:
    1. 60 μl (युक्त की कुल मात्रा ~ 500 एनजी डीएनए में, 30 Pme मैं के साथ pBeloBAC11 प्लाज्मिड (7507 बीपी, परिग्रहण नंबर U51113), के व्युत्पन्न और नहीं है कि मैं pBAC / PRRSV / फ्लोरिडा (वेक्टर) के एक अनुक्रमिक पाचन प्रदर्शन करना , 15,426 बी.पी. वेक्टर टुकड़ा जो पैदावार 12-15 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, पर 10 यू एंजाइम, 1x पाचन बफर, और 1 × बीएसए)।
    2. 25 में 60 μl की कुल मात्रा में एक अनुक्रमिक Sma मैं के साथ चार सीडीएनए amplicons (डालने) में से प्रत्येक के पाचन और नहीं है कि मैं प्रदर्शन करना (~ 1 ग्राम डीएनए, 20 यू एंजाइम, 1 * पाचन बफर युक्त, और 1 × बीएसए) डिग्री सेल्सियस (SMA मैं) या 12-15 वांछित आकार के निम्नलिखित डालने टुकड़े जो पैदावार मानव संसाधन, के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (नहीं है कि मैं): एफ 1 (2559 बीपी), एफ 2 (4157 बीपी), F3 (3908 बीपी), और F4 (1784 बीपी)।
  2. शुद्धवेक्टर वांछित और जेल निष्कर्षण द्वारा डीएनए टुकड़े डालें।
    1. युक्त एक 1% कम पिघलने बिंदु agarose जेल 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल EtBr पर दोगुना पचा उत्पादों से अलग करें। लंबी लहर पराबैंगनी प्रकाश के तहत agarose की एक न्यूनतम राशि (आमतौर पर ~ 200 μl) के साथ वांछित डीएनए टुकड़ा के एक बैंड काटें।
    2. एक 1.7 मिलीलीटर microtube में agarose excised करने के लिए एक समान मंदिर बफर की मात्रा (10 मिमी Tris सीएल, 1 मिमी EDTA, और 10 मिमी 2 MgCl) जोड़ें। Agarose पूरी तरह पिघल गया है जब तक हर 2-3 मिनट vortexing के साथ 10-15 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं।
    3. आरटी पर 10 मिनट के लिए 13,400 × छ पर 1 मिनट, और सेंट्रीफ्यूज के लिए सख्ती, भंवर पूर्व गर्म बफर संतृप्त फिनोल के एक बराबर मात्रा जोड़ें।
      नोट: मिश्रण एक कम जैविक चरण और एक ऊपरी जलीय चरण में अलग करती है। एक नया microtube करने के लिए डीएनए युक्त ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण।
    4. Isoamyl शराब (24: 1) क्लोरोफॉर्म की एक समान मात्रा में जोड़ें 13 में, 1 मिनट के लिए भंवर, और सेंट्रीफ्यूज,आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 × छ। एक नया microtube करने के लिए ऊपरी जलीय चरण स्थानांतरण।
    5. 10 माइक्रोग्राम / μl खमीर tRNA के 0.5 μl, 3 एम सोडियम एसीटेट के 1/10 मात्रा और 100% इथेनॉल के 2.5 मात्रा में जोड़ें। 20 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण रखें।
    6. आरटी पर 10 मिनट के लिए 13,400 × छ पर मिश्रण अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालें और तीन से पांच बार पल्स-vortexing और 10 मिनट के लिए 13,400 × छ पर centrifuging द्वारा 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ डीएनए गोली धोने।
    7. 10 मिनट के लिए डीएनए गोली हवा शुष्क और ते बफर के 20 μl (10 मिमी Tris सीएल और 1 मिमी EDTA [पीएच 7.6]) में इसे भंग।
  3. वांछित वेक्टर ligate और टी -4 डीएनए ligase का उपयोग करते हुए डीएनए टुकड़े डालें।
    1. वेक्टर डीएनए के 50-100 एनजी, डालने डीएनए के एक ~ 3 गुना दाढ़ अतिरिक्त, 400 यू टी -4 डीएनए ligase, और 1 × बंधाव बफर युक्त एक 20 μl बंधाव प्रतिक्रिया सेट करें। 12-15 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर बंधाव प्रतिक्रिया सेते हैं।
      नोट: एक नकारात्मक contr शामिलराजभाषा प्रतिक्रिया, यानी, केवल समानांतर में डालने, बिना वेक्टर।
    2. , प्रत्येक (एफ 1 के लिए) 2559-बीपी के साथ pBAC / PRRSV / फ्लोरिडा के 15,426 बी.पी. Pme मैं- नहीं है कि मैं टुकड़ा में शामिल होने, चार अलग ligations प्रदर्शन करना 4157 बी.पी., (एफ 2 के लिए) (F3 के लिए) 3908-बीपी, या (F4 के लिए) 1784-बीपी चार सीडीएनए amplicons में से एक की Sma मैं- नहीं है कि मैं टुकड़ा, subclones pBAC / F4 को pBAC / एफ 1 उत्पन्न करने के लिए।
  4. ई में ligated डीएनए रूपांतरण 2 CaCl -हीट सदमे विधि द्वारा कोलाई DH10B।
    1. 2 CaCl के 100 μl aliquots सक्षम DH10B कोशिकाओं -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 69 -treated ले लो और उन्हें बर्फ पर पिघलना।
      नोट: परिवर्तन प्रति कोशिकाओं के 100 μl का प्रयोग करें।
    2. एक 1.7 मिलीलीटर microtube में thawed कोशिकाओं के 100 μl के लिए डीएनए बंधाव प्रतिक्रिया की एक 10 μl विभाज्य जोड़ें ट्यूब दोहन से धीरे मिश्रण है, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर रहते हैं।
    3. हीट शॉक एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी में 45 सेकंड के लिए डीएनए सेल मिश्रणतो आतंकवाद स्नान, 2 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है, और लेग शोरबा के 900 μl आरटी के लिए पूर्व गरम जोड़ें।
    4. 225-250 rpm पर झटकों के साथ, 1 घंटे के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी हैरान कोशिकाओं को सेते हैं।
    5. 10 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol युक्त लेग अगर प्लेटों पर संवर्धित कोशिकाओं (CML) के 50 से 200 μl aliquots बिखरा हुआ है। वे सूख रहे हैं, जब तक ठीक ऊपर की ओर है, आरटी पर प्लेटों रखें।
    6. उल्टा प्लेटों की बारी है और 15 घंटे के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. एक स्तंभ आधारित शोधन विधि (चित्रा 1 सी) द्वारा मेजबान कोशिकाओं से क्लोन बीएसी डीएनए की वसूली।
    1. लेग CML अगर प्लेट से छह से आठ बैक्टीरियल कालोनियों उठाओ और 10 माइक्रोग्राम / एमएल CML युक्त 2xYT शोरबा के 3 मिलीलीटर में उन्हें टीका लगाना। जोरदार झटकों के (225-250 आरपीएम) के साथ 10 घंटे के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों सेते हैं।
    2. निर्माता द्वारा निर्देशित के रूप में, स्पिन स्तंभों का उपयोग बैक्टीरियल संस्कृतियों का 1-1.5 मिलीलीटर से पुनः संयोजक बीएसी DNAs अलग। 70 Elute निकाले डीएनए (typiते बफर के 20 μl में बड़ी सफाई 100-200 एनजी)।
    3. एक क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल एक ही एंजाइमों का उपयोग कर एक सही डालने के साथ वेक्टर की उपस्थिति की पहचान करने के लिए, 10 μl की कुल मात्रा में ~ 6 घंटे के लिए पृथक बेक्स के दो विश्लेषणात्मक प्रतिबंध एंजाइम पाचन प्रदर्शन करना (देखें प्रोटोकॉल 3.1), और अन्य एक अद्वितीय प्रतिबंध टुकड़ा पैटर्न पैदा करने, (जैसे, BGL द्वितीय, NCO मैं, या पीएसटी मैं) एक उचित एंजाइम के साथ क्लोन बेक्स की अखंडता का परीक्षण करने के लिए।
    4. 2xYT-CML माध्यम की 500 मिलीलीटर में (प्रोटोकॉल 3.5.1) से सकारात्मक बैक्टीरियल संस्कृतियों के 500 μl inoculating और 225-250 rpm पर मिलाते हुए, जबकि 35 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए inoculum की खेती से सही ढंग से क्लोन किया बेक्स प्रचार। निर्माता की सिफारिश के अनुसार, फिल्टर स्तंभों का उपयोग 500 मिलीलीटर संस्कृति से बीएसी डीएनए (आम तौर पर 10-20 ग्राम) शुद्ध। 71
      नोट: प्रारंभिक चार बीएसी subclones, जेईवी जीनोमिक शाही सेना के एक सीडीएनए टुकड़ा युक्त प्रत्येक, पर साबित हो सकता हैई या (एक संदर्भ दृश्य के रूप में कार्य करता है) वायरल जीनोम 42 की आम सहमति अनुक्रम की तुलना में जब अधिक अवांछित उत्परिवर्तन (एस)। ऐसी कोई भी उत्परिवर्तन एक पूरी लंबाई की जेईवी सीडीएनए की विधानसभा के लिए पहले पीसीआर आधारित साइट निर्देशित उत्परिवर्तजनन द्वारा सही करने की जरूरत है। 27

4. 5 'SP6 प्रमोटर और 3' रन-ऑफ साइट के साथ एक पूर्ण लंबाई जेईवी सीडीएनए बनाएं

  1. तीन आनुवंशिक संशोधन प्रामाणिक 5 'और 3' के साथ जीनोम लंबाई RNAs के इन विट्रो रन दूर प्रतिलेखन अनुमति देने के लिए क्लोन किया cDNAs में (4.1.1-4.1.3 प्रोटोकॉल नीचे देखें) बनाओ वायरल जीनोम के समाप्त होता है।
    1. ओवरलैप विस्तार पीसीआर (चित्रा -1, pBAC / एफ 1 SP6) द्वारा वायरल जीनोम के 5 'अंत के सीधे नदी के ऊपर एक SP6 प्रमोटर परिचय दें।
      1. उत्पाद (दो प्राइमर जोड़े SP6F + SP6R (उत्पाद का आकार, 173 बीपी) और F1F + F1R साथ pBAC / एफ 1 के पहले मानक पीसीआर के माध्यम से दो ओवरलैपिंग डीएनए टुकड़े बढ़ानाize, 676 बीपी), 1 μl टेम्पलेट डीएनए (~ 200 स्नातकोत्तर / μl) युक्त एक 50 μl प्रतिक्रिया में प्रत्येक 10 μl 5 × पीसीआर बफर, 2 μl 10 मिमी dNTPs, 2.5 μl आगे 10 माइक्रोन से प्रत्येक और रिवर्स प्राइमरों, 0.5 μl 2 यू / μl डीएनए पोलीमरेज़, 68 और 31.5 μl DH 2 ओ 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, और 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 20 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस: निम्नलिखित साइक्लिंग प्रोफ़ाइल का उपयोग पीसीआर प्रदर्शन।
      2. प्रोटोकॉल 3.2 में वर्णित के रूप में, एक 1.5% कम पिघलने बिंदु agarose जेल पर दो पीसीआर उत्पादों में से प्रत्येक चलाने के बाद दो पीसीआर प्रवर्धित डीएनए टुकड़े जेल शुद्ध।
      3. 1 μl दो शुद्ध डीएनए टुकड़े में से प्रत्येक (~ 100 स्नातकोत्तर / μl) सहित एक 100 μl प्रतिक्रिया में (उत्पाद का आकार, 821 बीपी) सबसे बाहरी प्राइमरों SP6F + F1R का उपयोग कर दूसरी संलयन पीसीआर के माध्यम से दो जेल शुद्ध डीएनए टुकड़े फ्यूज, 20 μl 5 × पीसीआर बफर, 4 μl 10 मिमी dNTPs, 5 μl आगे 10 माइक्रोन से प्रत्येक और रिवर्स प्राइमरों, 1 μl2 यू / μL डीएनए पोलीमरेज़, 68 और 63 μl DH 2 ओ 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, और 10 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्रों: निम्नलिखित थर्मल साइकिल प्रोफ़ाइल का प्रयोग करें।
      4. प्रोटोकॉल 3.2 में वर्णित के रूप में, एक 1% कम पिघलने बिंदु agarose जेल से जुड़े हुए पीसीआर amplicon जेल शुद्ध।
      5. उत्पन्न करने के लिए pBAC / एफ 1 9532 बी.पी. पीएसी मैं- बीएसआई WI टुकड़ा के साथ जेल शुद्ध जुड़े हुए पीसीआर amplicon की 760-बीपी पीएसी मैं- बीएसआई WI टुकड़ा ligate प्रोटोकॉल को 3.1-3.5 में वर्णित पांच कदम क्लोनिंग प्रक्रिया का प्रदर्शन pBAC / एफ 1 SP6।
    2. ओवरलैप विस्तार पीसीआर (चित्रा -1, pBAC / F3 को) के माध्यम से एक मूक बिंदु उत्परिवर्तन (टी → एक 9134) को शुरू करने से न्यूक्लियोटाइड 9131 में पहले से मौजूद है, आंतरिक Xba मैं साइट निकालें।
      1. दो प्राइमर जोड़े X1F + X1R साथ pBAC / F3 की पहली मानक पीसीआर द्वारा दो ओवरलैपिंग डीएनए टुकड़े बढ़ाना(उत्पाद आकार, 746 बीपी) और X2F + X2R प्रोटोकॉल 4.1.1.1 में वर्णित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत एक 50 μl प्रतिक्रिया में (उत्पाद का आकार, 316 बीपी)।
      2. प्रोटोकॉल 3.2 में विस्तृत रूप में 1.5% कम पिघलने बिंदु agarose जैल पर electrophoretic जुदाई के बाद दो पीसीआर प्रवर्धित डीएनए टुकड़े जेल शुद्ध।
      3. प्रोटोकॉल 4.1.1.3 में वर्णित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत एक 100 μl प्रतिक्रिया में सबसे बाहरी प्राइमरों X1F + X2R (उत्पाद का आकार, 1033 बीपी) का उपयोग कर दूसरी संलयन पीसीआर के माध्यम से दो जेल शुद्ध डीएनए टुकड़े फ्यूज।
      4. प्रोटोकॉल 3.2 में विस्तृत रूप में, एक 1% कम पिघलने बिंदु agarose जेल से जुड़े हुए पीसीआर amplicon जेल शुद्ध।
      5. 16,245 बी.पी. नहीं मैं- बीएसआई WI और 2141 बी.पी. बीएसआई डब्ल्यू मैं के साथ जेल शुद्ध जुड़े हुए पीसीआर amplicon की 949-बीपी Avr द्वितीय नहीं है कि मैं टुकड़ा ligate प्रोटोकॉल को 3.1-3.5 में वर्णित पांच कदम क्लोनिंग प्रक्रिया का प्रदर्शन - pBAC / F3 की Avr द्वितीय टुकड़े pBAC / F3 KO के उत्पादन के लिए।
      </ Li>
    3. पीसीआर आधारित साइट निर्देशित उत्परिवर्तजनन (चित्रा -1, pBAC / F4 आरओ) द्वारा वायरल जीनोम के 3 'के अंत का सिर्फ नीचे की ओर एक नया कृत्रिम Xba मैं रन दूर साइट इंजीनियर।
      1. 1 μl टेम्पलेट डीएनए युक्त एक 100 μl प्रतिक्रिया में प्राइमरों ROF + आतंक विरोधी (उत्पाद का आकार, 324 बीपी) (~ 200 स्नातकोत्तर / μl) के साथ pBAC की पीसीआर द्वारा एक डीएनए टुकड़ा उत्पन्न / F4, 20 μl 5 × पीसीआर बफर, 4 μl 10 मिमी dNTPs, 5 μl आगे 10 माइक्रोन से प्रत्येक और रिवर्स प्राइमरों, 1 μl 2 यू / μl डीएनए पोलीमरेज़, 68 और 64 μl DH 2 ओ 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, और 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस: निम्नलिखित साइक्लिंग प्रोफ़ाइल का उपयोग पीसीआर प्रदर्शन।
      2. प्रोटोकॉल 3.2 में विस्तृत रूप में, एक 1% कम पिघलने बिंदु agarose जेल से पीसीआर प्रवर्धित डीएनए टुकड़ा जेल शुद्ध।
      3. 283-बीपी एसएफआइ मैं- एन ligate प्रोटोकॉल को 3.1-3.5 में वर्णित पांच कदम क्लोनिंग प्रक्रिया का प्रदर्शनpBAC / F4 आरओ बनाने के लिए pBAC / F4 के 16933-बीपी एसएफआइ मैं- नहीं है कि मैं टुकड़ा के साथ जेल शुद्ध पीसीआर amplicon का ओ.टी. मैं टुकड़ा।
  2. (तीन प्राकृतिक प्रतिबंध साइटों पर बीएसआर सैनिक, बेम हाय, और शुक्रिया मैं शामिल होने से (pBAC / एसए 14 -14-2) एक पूर्ण लंबाई एसए 14 -14-2 बीएसी में cDNAs ओवरलैपिंग, संशोधित चार के एक सेट को इकट्ठा ) प्रोटोकॉल में विस्तृत प्रक्रिया क्लोनिंग पांच कदम का उपयोग कर एक अनुक्रमिक तरीके में 3.1-3.5 (चित्रा 1E): pBAC के साथ कि pBAC / एफ 1 SP6 की बीएसआर जी मैं- नहीं है कि मैं टुकड़ा जगह से एफ 1 SP6 → एफ 1 SP6 F2 (/ का शुक्रिया मैं- नहीं है कि मैं टुकड़ा जगह से (एफ 1 SP6 F2F3 KO के लिए F4 आरओ → pBAC / F3 को) के साथ कि pBAC / एफ 1 SP6 F2 की बैम एच मैं- नहीं है कि मैं टुकड़ा जगह से एफ 1 SP6 F2F3 KO → F2) ( pBAC / एफ 1 SP6 F2PBAC / F4 आरओ के साथ कि F3 को)।

5. पूर्ण लंबाई की एक उच्च शुद्धता मैक्सी प्रस्तुत एसए 14 -14-2 बीएसी तैयार

  1. ई की एक कॉलोनी बढ़ो तो 225-250 rpm पर मिलाते हुए, और के साथ 35 डिग्री सेल्सियस पर 10 घंटे के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल CML युक्त 2xYT शोरबा के pBAC / एसए 14 -14-2 3 में मिलीलीटर ले जाने कोलाई DH10B 10 घंटा के 500 μl inoculating द्वारा बड़े पैमाने अप 2xYT-CML मध्यम और जोरदार झटकों के साथ 35 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए inoculum की खेती की 500 मिलीलीटर में जीवाणु संस्कृति।
  2. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3107 × छ पर दो 250 मिलीलीटर की बोतल में जीवाणु संस्कृति। GTE समाधान (50 मिमी ग्लूकोज, 25 मिमी Tris सीएल, और 10 मिमी EDTA [पीएच 8.0]) की 30 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली resuspend, और फिर / एमएल लाइसोज़ाइम 60 मिलीग्राम के 500 μl जोड़ें। 10 मिनट के लिए बर्फ पर दो सेल निलंबन सेते हैं।
  3. प्रत्येक कक्ष के निलंबन के लिए ताजा बना lysis समाधान (0.2 एन NaOH और 1% एसडीएस) के 60 मिलीलीटर जोड़ें स्पष्ट जब तक मिश्रण अच्छी तरह से, और lysates रखना10 मिनट के लिए आरटी पर।
  4. प्रत्येक बोतल के लिए (60 मिलीलीटर 5 एम पोटेशियम एसीटेट, 11.5 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड, और 28.5 मिलीलीटर DH 2 ओ से मिलकर, 100 मिलीलीटर) निराकरण समाधान के 45 मिलीलीटर जोड़ें, बोतलें inverting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से, और बर्फ पर निष्प्रभावी lysates सेते 10 मिनट के लिए।
  5. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 18,566 × छ पर निष्प्रभावी lysates। दो नए 250 मिलीलीटर की बोतल में दोनों बोतलों की सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण; प्रत्येक के लिए 100% isopropanol के 0.6 मात्रा जोड़ने के लिए, और 20 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें रखने के लिए।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 18,566 × छ पर अवक्षेप स्पिन। , ते बफर के 5 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली भंग (10 मिलीलीटर कुल) एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में उन्हें गठबंधन है, और 5 एम लिथियम क्लोराइड के एक बराबर मात्रा जोड़कर शाही सेना वेग। 10 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं।
  7. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,636 × छ में शाही सेना के वेग। एक नया 250 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और 100% isopropanol के 2 संस्करणों जोड़कर डीएनए वेग।20 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 18,566 × छ पर डीएनए वेग स्पिन। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण ते बफर (पीएच 7.6) के 9.5 मिलीलीटर में डीएनए गोली resuspend, और सीज़ियम क्लोराइड (CsCl) के 10 ग्राम और / एमएल EtBr 10 मिलीग्राम के 390 μl जोड़ें।
  9. एक 18 जी सुई से लैस एक सिरिंज का उपयोग कर एक 16 × 76 मिमी sealable polypropylene ट्यूब में डीएनए CsCl-EtBr समाधान कर लेता है। 20 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3) पर 16 घंटे के लिए 401,700 × छ पर ultracentrifuge एक में बंद CsCl ढाल स्पिन।
  10. ढाल के शीर्ष पर एक एयर वेंट और ढाल की ओर से बीएसी डीएनए को पुनः प्राप्त करने के लिए एक 20 जी सुई सुसज्जित सिरिंज बनाने के लिए एक 18 जी सुई का उपयोग CsCl ढाल से बीएसी प्लाज्मिड के एक डीएनए बैंड लीजिए।
  11. DH 2 के 2.5 मात्रा में जोड़ें EtBr से सना हुआ बीएसी डीएनए नमूने लिए butanol हे संतृप्त और vortexing द्वारा मिश्रण। अपकेंद्रित्र 1 मिनट के लिए 13,400 × छ पर मिश्रण और एक नया 1.7 मिलीलीटर mic करने के लिए कम जलीय चरण हस्तांतरणrotube। इस प्रक्रिया में छह बार दोहराएँ।
  12. 3 एम सोडियम एसीटेट के 1/10 की मात्रा और butanol निकाले बीएसी डीएनए के लिए 100% इथेनॉल के 2.5 मात्रा जोड़ने और बर्फ पर 10 मिनट के लिए incubating द्वारा EtBr मुक्त बीएसी डीएनए वेग। अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 13,400 × छ पर वेग, 1 मिलीलीटर 70% इथेनॉल के साथ डीएनए गोली धोने, और centrifugation द्वारा यह फिर से गोली।
  13. 10 मिनट के लिए डीएनए गोली हवा शुष्क और ते बफर (पीएच 7.6) के 200 μl में भंग।
    नोट: चित्रा 4 जेईवी एसए 14 -14-2 के लिए रिवर्स आनुवंशिकी प्रणाली के अवलोकन से पता चलता।

6. एक linearized पूर्ण लंबाई जेईवी बीएसी डीएनए से इन विट्रो में सिंथेटिक आरएनए टाइप

  1. के एक बड़े पैमाने पर प्रतिबंध एंजाइम पाचन प्रदर्शन करना pBAC / एसए 14 37 डिग्री पर (3 ग्राम डीएनए, 60 यू एंजाइम, 1 * पाचन बफर, और 1 × बीएसए युक्त) 100 μl की कुल मात्रा में Xba मैं के साथ -14-2 12-15 घंटे के लिए सी। डी के एक 3 μl विभाज्य की जांच करना/ एमएल EtBr 0.5 ग्राम से युक्त एक 0.8% agarose जेल पर igestion प्रतिक्रिया।
  2. 2 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस (चित्रा -4 ए) पर मूंग nuclease के 25 यू (एमबीएन) के साथ आगे पाचन प्रतिक्रिया सेते हैं।
  3. DH 2 ओ के साथ 300 μl को Xba मैं पचा, एमबीएन इलाज के नमूने की मात्रा को लाओ 10 मिनट के लिए 13,400 × छ पर सख्ती 1 मिनट के लिए स्पिन पतला नमूना करने के लिए, भंवर, और फिर एक नया 1.7 मिलीलीटर करने के लिए ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण (1: 24 25) isoamyl शराब: क्लोरोफॉर्म: फिनोल के एक बराबर मात्रा जोड़ें microtube। क्लोरोफॉर्म के एक बराबर मात्रा जोड़ें और निष्कर्षण प्रक्रिया को दोहराने।
  4. इथेनॉल तेज़ी से फिनोल / क्लोरोफॉर्म निकाले, linearized बीएसी की वसूली: 3 एम सोडियम एसीटेट के 1/10 की मात्रा और 100% इथेनॉल के 2.5 मात्रा में जोड़ें, और 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 13,400 × छ पर वेग, 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ डीएनए गोली धोने, और फिर पुन: centrifugation द्वारा यह नीचे स्पिन।
  5. डीएनए पेले हवा शुष्क10 मिनट के लिए टी और DH 2 ओ के 30 μl में भंग 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल EtBr (चित्रा 5 ए) के साथ एक 0.8% agarose जेल पर बरामद बीएसी की 1 μl विभाज्य जांच करते हैं।
  6. ~ 200 एनजी टेम्पलेट डीएनए, 0.8 मिमी टोपी अनुरूप [एम 7 जी (5) पीपीपी (5) एक], 1 मिमी rNTPs युक्त 25 μl (की कुल मात्रा में linearized बीएसी डीएनए के एक रन से प्रतिलेखन प्रदर्शन करना, 40 यू RNase अवरोध करनेवाला, 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 4 बी) में 20 यू SP6 शाही सेना पोलीमर्स, 72 और 1 × प्रतिलेखन बफर)। शामिल 0.5 माइक्रोन [3 एच] डे-81 फिल्टर पेपर के लिए सोखना द्वारा निगरानी के रूप में [3 एच] UTP समावेश के आधार पर आरएनए मात्रा का ठहराव के लिए UTP,। 69
  7. 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल EtBr (चित्रा 5 ब) युक्त एक 0.6% agarose जेल पर रन ऑफ प्रतिलेखन प्रतिक्रिया का एक 1-2 μl विभाज्य चलाएँ।

7. आरएनए संक्रामकता और वायरस प्रतिलाभ निर्धारित

  1. खेती बीएचके -21 150 मिमी cultu में कोशिकाओं5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 3 × 10 6 कोशिकाओं / पकवान के घनत्व पर व्यंजन फिर से।
    नोट: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी glutamine, विटामिन, और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक अल्फा न्यूनतम आवश्यक मध्यम में BHK-21 कोशिकाओं को बनाए रखें।
  2. ठंड समाधान ए (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 8.1 मिमी ना 2 4 HPO, और 1.5 मिमी के.एच. 2 4 पीओ) के 10 मिलीलीटर के साथ सेल monolayer कुल्ला। Trypsin EDTA (0.25%) के 4 मिलीलीटर के साथ इलाज के द्वारा व्यंजन से कोशिकाओं को अलग, और 2 मिनट के लिए एक डेस्कटॉप सेंट्रीफ्यूज में 270 × छ पर centrifugation द्वारा उन्हें इकट्ठा।
  3. 2 मिनट के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 270 × छ पर सेल निलंबन ठंड समाधान एक की 50 मिलीलीटर के साथ सेल गोली Resuspend। इस धोने प्रक्रिया तीन बार दोहराएँ; पिछले धोने के बाद, सोल ए में 2 × 10 7 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर सेल गोली resuspend
  4. 2 μ के साथ सेल निलंबन की 400 μl विभाज्य मिक्स980 वी, 99 μsec पल्स लंबाई, और 5 दालों (चित्रा 4C): एक 2 मिमी अंतराल क्युवेट में सिंथेटिक शाही सेना के ग्राम, और तुरंत इष्टतम इलेक्ट्रोपोरेशन शर्तों के तहत एक electroporator के साथ मिश्रण electroporate।
    नोट: आगे की शुद्धि के बिना सीधे electroporation के लिए प्रोटोकॉल 6.5 में संश्लेषित 3 एच लेबल शाही सेना का प्रयोग करें।
  5. 10 मिनट के लिए आरटी पर electroporated कोशिकाओं छोड़ दो और पूर्ण संस्कृति के माध्यम से 600 μl युक्त एक 1.7 मिलीलीटर microtube के लिए स्थानांतरण।
  6. पूरी संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में electroporated कोशिकाओं की एक 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने को तैयार है और एक 6 अच्छी तरह से थाली में unelectroporated BHK-21 कोशिकाओं (5 × 10 5) के monolayers पर प्रत्येक कमजोर पड़ने की 100 μl विभाज्य थाली।
  7. ऊष्मायन के 4-6 घंटे के बाद, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त न्यूनतम आवश्यक माध्यम में 0.5% agarose के साथ कोशिकाओं उपरिशायी। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए प्लेटें सेते हैं।
  8. संक्रामक केंद्र कल्पनाएस 5% इथेनॉल 27 (चित्रा 6A) में 1% क्रिस्टल वायलेट के साथ 7% formaldehyde और धुंधला के साथ निर्धारण द्वारा (सजीले टुकड़े)।
    1. वैकल्पिक: immunofluorescence assays 27,73 (चित्रा 6B) द्वारा जेईवी प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए 18-20 घंटे बाद अभिकर्मक पर शाही सेना electroporated कोशिकाओं की जांच, और वायरस के लिए 22 और 40 घंटे बाद अभिकर्मक पर शाही सेना electroporated कोशिकाओं से supernatants फसल पट्टिका assays 27,63 (चित्रा 6C) द्वारा अनुमापन।

Representative Results

सभी सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस के लिए, एक रिवर्स आनुवंशिकी प्रणाली की विश्वसनीयता और क्षमता जिसका अनुक्रम वायरल जीनोमिक शाही सेना की आम सहमति अनुक्रम के बराबर है एक क्लोन पूर्ण लंबाई सीडीएनए के आनुवंशिक स्थिरता पर निर्भर करती है। 27 चित्रा 1 एक पांच से पता चलता है जेईवी एसए के लिए एक बीएसी के रूप में एक पूरी लंबाई की संक्रामक सीडीएनए के निर्माण के लिए कदम रणनीति 14 -14-2 28: चरण 1, जेईवी संक्रमित BHK-21 कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) के सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से वायरल शाही सेना की शुद्धि; चरण 2, पूरे वायरल जीनोम (चित्रा 1 बी) में फैले चार ओवरलैपिंग सीडीएनए amplicons (F4 को एफ 1) के संश्लेषण; PBAC / F4 (चित्रा 1 सी) के लिए pBAC / एफ 1 बनाने चरण 3, बीएसी वेक्टर में चार सन्निहित सीडीएनए टुकड़े में से प्रत्येक के subcloning; चरण 4, SP6 शाही सेना पोलीमर्स, यानी साथ इन विट्रो रन दूर प्रतिलेखन के लिए क्लोन किया cDNAs के संशोधन, एक SP6 रखकरप्रमोटर अनुक्रम एक मूक बिंदु उत्परिवर्तन शुरू करने से न्यूक्लियोटाइड 9131 में एक पूर्व मौजूदा आंतरिक Xba मैं साइट को नष्ट करने, वायरल 5'-अंत (pBAC / एफ 1 SP6) के तुरंत नदी के ऊपर, एक 9134 टी (pBAC / F3 को), और डालने → वायरल 3'अंत (pBAC / F4 आरओ) (चित्रा -1) के तुरंत नीचे की ओर एक नया कृत्रिम Xba मैं रन दूर साइट; और चरण 5, एक पूरी लंबाई की विधानसभा एसए 14 -14-2 सीडीएनए बीएसी, pBAC / एसए 14 -14-2 (चित्रा 1E)। तालिका को क्लोनिंग प्रक्रिया में इस्तेमाल किया oligonucleotides 1 सूचियों। 28

एक कार्यात्मक जेईवी सीडीएनए के निर्माण के लिए, पहला महत्वपूर्ण कदम आरटी पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में शुद्ध वायरल शाही सेना का उपयोग चार ओवरलैपिंग सीडीएनए टुकड़े के संश्लेषण है। 2 थे कि चार आरटी पीसीआर उत्पादों के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करता है चित्रा एक 0.8% पर electrophoresedagarose जेल। इस जेल में एक पूर्ण लंबाई जेईवी सीडीएनए चार ओवरलैपिंग सीडीएनए टुकड़ों में परिलक्षित होता है कि स्पष्ट रूप से दर्शाता है। कभी कभी, आरटी पीसीआर प्रतिक्रियाओं क्योंकि सीडीएनए संश्लेषण / प्रवर्धन दौरान प्राइमरों के अविशिष्ट annealing के, उम्मीद उत्पाद की तुलना में ज्यादातर छोटे होते हैं कि एक या एक से अधिक अतिरिक्त वायरस विशेष या अविशिष्ट उत्पादों उपज हो सकती है। दूसरी ओर, कम या कोई आरटी पीसीआर उत्पाद क्योंकि वायरल शाही सेना अलगाव या अनुचित आरटी पीसीआर प्रदर्शन के दौरान आकस्मिक RNase संदूषण की परिलक्षित हो जाएगा उम्मीद है।

अगले महत्वपूर्ण कदम एक partial- या पूर्ण लंबाई मानक पुनः संयोजक डीएनए तकनीक का उपयोग करता है कि एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है जो बीएसी में जेईवी सीडीएनए की क्लोनिंग और संशोधन है। 69 चित्रा 3 युक्त बीएसी क्लोन की शुद्धि के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करता है एक CsCl-EtBr ढाल में बैंडिंग द्वारा जेईवी एसए 14 -14-2 की एक पूरी लंबाई की सीडीएनए।इस प्रयोग में, 401,700 × छ पर 16 घंटे के लिए centrifugation के बाद, दो अलग-अलग बैंड, यानी, ई ऊपर कोलाई गुणसूत्र डीएनए और नीचे supercoiled बीएसी प्लास्मिड डीएनए, लंबी लहर पराबैंगनी प्रकाश के तहत ट्यूब के बीच में दिखाई दे रहे हैं। कम बीएसी डीएनए बैंड की एक न्यूनतम मात्रा (~ 400 μl) ध्यान से ट्यूब के किनारे पर एक सिरिंज के साथ एक छेद poking द्वारा एकत्र किया गया था। बाद में, EtBr butanol निष्कर्षण द्वारा बीएसी डीएनए से निकाला गया था, और EtBr मुक्त बीएसी डीएनए इथेनॉल तेज़ी से ध्यान केंद्रित किया गया था।

अंतिम चरण अनुमोदक कोशिकाओं में शाही सेना अभिकर्मक (चित्रा 4) के बाद पूर्ण लंबाई एसए 14 -14-2 बीएसी (pBAC / एसए 14 -14-2) से इन विट्रो में लिखित सिंथेटिक RNAs के विशिष्ट संक्रामकता का दृढ़ संकल्प है। 3 'में चरण 1, पूर्ण लंबाई के linearization एसए 14 -14-2 सीडीएनए: यह कदम तीन अनुक्रमिक कदम शामिलअंत वायरल जीनोम (चित्रा 4 ए) के; चरण 2, रन ऑफ प्रतिलेखन (चित्रा 4 बी) द्वारा linearized सीडीएनए से सिंथेटिक आरएनए का उत्पादन; और चरण 3, सिंथेटिक आरएनए (चित्रा 4C) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट BHK-21 कोशिकाओं में पुनः संयोजक वायरस का बचाव। प्रयोगात्मक, pBAC / एसए 14 -14-2 के दो स्वतंत्र क्लोन Xba मैं पाचन के साथ linearized और Xba मैं पाचन द्वारा उत्पन्न चार-बेस 5 'की अधिकता को दूर करने के एमबीएन के साथ इलाज किया गया। linearized बेक्स इथेनॉल के द्वारा पीछा किया, फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा साफ कर रहे थे। दो शुद्ध बेक्स के linearization एक 0.8% agarose जेल (चित्रा 5 ए) पर प्रदर्शन किया गया। फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण linearized बेक्स RNase मुक्त कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी से किया जाना चाहिए। दो linearized बेक्स की प्रत्येक मी 7 जी (5) पीपीपी की उपस्थिति में SP6 शाही सेना पोलीमरेज़ का उपयोग रन ऑफ प्रतिलेखन के लिए एक सीडीएनए टेम्पलेट के रूप में सेवा (5') एक टोपी अनुरूप। सिंथेटिक आरएनए की अखंडता के लिए एक संदर्भ 1 केबी डीएनए सीढ़ी (चित्रा 5 ब) के साथ-साथ, एक 0.6% agarose जेल पर दो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया मिश्रण की aliquots चलाकर दिखाया गया था। इस सरल परख में, प्रमुख प्रमुख शाही सेना बैंड हमेशा ही चले गए 3 KB नीचे डीएनए बैंड का संदर्भ और तेज हो दिखाई दिया। हालांकि, आरएनए ही जेल पर लिप्त उपस्थिति के लिए होता अपमानित।

एक संक्रामक केंद्र परख सिंथेटिक RNAs के विशिष्ट संक्रामकता का निर्धारण करने के लिए स्वर्ण मानक है। इस परख (3 × 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) भोले BHK-21 कोशिकाओं से युक्त 6 अच्छी तरह प्लेटों में 10 गुना क्रमानुसार पतला electroporated कोशिकाओं के बराबर aliquots बोने, शाही सेना के नमूनों के साथ BHK-21 कोशिकाओं electroporating, और agarose overlaying द्वारा किया गया था सेल monolayers पर। 4 दिनों के लिए ऊष्मायन के बाद, जीवित कोशिकाओं formaldehyde के साथ तय किया गया है और एक क्रिस्टल बैंगनी एस के साथ दागolution कोशिकाओं (चित्रा 6A) में कर दिया संक्रामक आरएनए अणुओं की संख्या से मेल खाती है, जो संक्रामक केन्द्रों (सजीले टुकड़े) की संख्या, जिसका अंदाजा लगाना। इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए इस्तेमाल किया सीडीएनए टेम्पलेट गैर-संक्रामक होना सिद्ध किया गया है, प्रतिलेखन प्रतिक्रिया मिश्रण की 27 एक विभाज्य सीधे electroporation के लिए इस्तेमाल किया गया था। Electroporation आरएनए अभिकर्मक के लिए पसंदीदा तरीका है; वैकल्पिक रूप से, आरएनए DEAE-dextran और धनायनित लिपिड का उपयोग अन्य तरीकों से ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता। आरएनए इलेक्ट्रोपोरेशन बहुत प्रभावी है, लेकिन बिजली नाड़ी की "arcing" लवण इलेक्ट्रोपोरेशन प्रतिक्रिया में या electroporation क्युवेट पुन: उपयोग किया जाता है, तो मौजूद हैं, शायद ही कभी अगर होता है। शाही सेना कोशिकाओं में वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक विरोधी NS1 खरगोश सीरमरोधी (चित्रा 6B) का उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस संसाधनों द्वारा जांच की गई थी। शाही सेना कोशिकाओं की supernatants में संचित वायरल कणों का उत्पादन किया गया था एकपट्टिका assays (चित्रा 6C) द्वारा alyzed। इन प्रयोगों के परिणामों सीडीएनए व्युत्पन्न सिंथेटिक आरएनए पुनः संयोजक वायरस का एक उच्च अनुमापांक पैदा करने, अनुमोदक BHK-21 कोशिकाओं में संक्रामक हैं कि स्पष्ट रूप से दिखा।

प्रोटोकॉल अनुक्रम एक (5 'से 3') स्थिति ख Polarity
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578-2603 Antisense
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		1-22 समझ
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532-2553 Antisense
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 चींटीमुझे समझ है
2 एफ aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800-1821 समझ
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 Antisense
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 Antisense
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 समझ
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 Antisense
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10,952-10,977 Antisense
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 समझ
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10,956-10,977 Antisense
SP6F cataccccgcgtattcccac
टा 		समझ
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		1-14 Antisense
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		1-17 समझ
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638-662 Antisense
X1F CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 समझ
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 Antisense
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 समझ
X2R cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		Antisense
ROF CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10,670-10,694 समझ
आतंक विरोधी agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10,954-10,977 Antisense
एक जेईवी दृश्यों बड़े अक्षरों में ही दिखाए जाते हैं, और बीएसी दृश्यों छोटे अक्षरों में संकेत कर रहे हैं।
ख Nucleotide स्थिति जेईवी एसए 14 -14-2 (परिग्रहण नंबर JN604986) का पूरा जीनोम अनुक्रम को दर्शाता है।

तालिका 1: सीडीएनए संश्लेषण, पीसीआर प्रवर्धन, और बीएसी उत्परिवर्तजनन के लिए इस्तेमाल किया oligonucleotides।

आकृति 1
आकृति 1।0; रणनीति एक बीएसी के रूप में जेईवी एसए 14 -14-2 की एक पूरी लंबाई की सीडीएनए के निर्माण के लिए जेईवी कणों से वायरल शाही सेना के (ए) अलगाव।। जेईवी एसए 14 -14-2 के जीनोमिक शाही सेना के एक योजनाबद्ध चित्र दिखाया गया है। पूरे वायरल जीनोम को कवर (बी) के चार ओवरलैपिंग सीडीएनए टुकड़े के संश्लेषण (F4 को एफ 1)। PBAC / F4 को pBAC / एफ 1 बनाने बीएसी वेक्टर में चार ओवरलैपिंग सीडीएनए टुकड़े (सी) subcloning। इन विट्रो में रन ऑफ प्रतिलेखन के लिए क्लोन किया cDNAs (डी) संशोधन। pBAC / एफ 1 SP6 वायरल 5'-अंत के अपस्ट्रीम SP6 प्रमोटर अनुक्रम होता है कि pBAC / एफ 1 के व्युत्पन्न है। pBAC / F3 को एक मूक बिंदु उत्परिवर्तन (टी → एक 9134, तारांकन) में शामिल है कि pBAC / F3 के व्युत्पन्न है। pBAC / F4 आरओ वायरल 3'अंत के बहाव के लिए एक कृत्रिम Xba मैं रन से साइट में शामिल है कि pBAC / F4 के व्युत्पन्न है। (ई strong>) एक पूर्ण लंबाई एसए 14 -14-2 बीएसी की सभा (pBAC / एसए 14 -14-2)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
जेईवी एसए 14 -14-2 की पूरी लंबाई जीनोमिक शाही सेना में फैले चित्रा चार ओवरलैपिंग सीडीएनए टुकड़े 2. संश्लेषण (F4 को एफ 1)। चार आरटी पीसीआर उत्पादों को एक 0.8% agarose जेल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं। एम, 1 केबी डीएनए सीढ़ी। चार सीडीएनए टुकड़े की उम्मीद आकार जेल छवि के नीचे संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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जेईवी की एक पूरी लंबाई की सीडीएनए एसए 14 -14-2 युक्त बीएसी की चित्रा 3. शोधन। बीएसी प्लाज्मिड ई से अलग है एसडीएस क्षारीय सेल विधि द्वारा कोलाई DH10B और आगे एक CsCl-EtBr ढाल में बैंडिंग द्वारा शुद्ध। एक 16 × 76 मिमी sealable polypropylene ट्यूब का उपयोग कर CsCl-EtBr ढाल का एक उदाहरण है प्रस्तुत किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
जेईवी एसए 14 -14-2 सीडीएनए एक बीएसी में इकट्ठे एक पूर्ण लंबाई से संक्रामक वायरस की वसूली की चित्रा 4. अवलोकन। सीडीएनए टेम्पलेट (ए) Linearization। जेईवी बीएसी के साथ कट जाता है पूर्ण लंबाईXba मैं और एमबीएन साथ इलाज किया। शाही सेना टेप (बी) संश्लेषण। linearized सीडीएनए मीटर 7 जी (5) पीपीपी (5 ') एक टोपी अनुरूप की उपस्थिति में SP6 शाही सेना पोलीमर्स द्वारा लिखित है। सिंथेटिक JEVs (सी) वसूली। इन विट्रो लिखित आरएनए सिंथेटिक वायरस के एक उच्च अनुमापांक उत्पन्न करता है जो इलेक्ट्रोपोरेशन, द्वारा BHK-21 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
एक सीडीएनए टेम्पलेट के रूप में एक पूरी लंबाई की जेईवी बीएसी का उपयोग करने में इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा चित्रा RNAs के 5. संश्लेषण। Linearized पूर्ण लंबाई जेईवी बीएसी, pBAC / एसए 14 -14-2 (ए) जनरेशन। PBAC के दो स्वतंत्र क्लोन/ एसए 14 -14-2 (Cl.1 और Cl.2) एमबीएन साथ Xba मैं साथ पाचन और बाद में इलाज के द्वारा linearized कर रहे हैं। linearized बेक्स एक 0.8% agarose जेल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा जांच कर रहे हैं। रन ऑफ प्रतिलेखन द्वारा सिंथेटिक आरएनए (बी) उत्पादन। दो linearized बेक्स से प्रत्येक SP6 शाही सेना पोलीमर्स रन दूर प्रतिलेखन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है। दो प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं की aliquots एक 0.6% agarose जेल पर चलाए जा रहे हैं। एम, 1 केबी डीएनए सीढ़ी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
एक पूरी लंबाई की जेईवी बीएसी और सिंथेटिक वायरस की वसूली से लिखित सिंथेटिक RNAs के चित्रा 6 विशिष्ट संक्रामकता। BHK-21 कोशिकाओं मंगलवार निकाली गई शाही सेना टेप के साथ (नकली) electroporated-नकली या electroporated हैंपूर्ण लंबाई जेईवी बीएसी (Cl.1 और Cl.2) के दो स्वतंत्र क्लोन के प्रत्येक ओम। (ए) आरएनए संक्रामकता। कोशिकाओं agarose के साथ मढ़ा और बाद अभिकर्मक 4 दिनों में क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग रहे हैं। आरएनए संक्रामकता कोशिकाओं (बाएं पैनल) में electroporated संक्रामक शाही सेना की राशि का अनुमान लगाने के संक्रामक केंद्र संसाधनों द्वारा निर्धारित किया जाता है। इसके अलावा, संक्रामक केन्द्रों के प्रतिनिधि छवियों (सही पैनल) दिखाए जाते हैं। (बी) प्रोटीन अभिव्यक्ति। कोशिकाओं 4 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स में सुसंस्कृत हैं। 20 घंटे बाद अभिकर्मक (एचपीटी) पर शाही सेना electroporated कोशिकाओं में वायरल प्रोटीन अभिव्यक्ति एक प्राथमिक विरोधी NS1 खरगोश सीरमरोधी और एक माध्यमिक Cy3 संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (लाल) का उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस संसाधनों द्वारा विश्लेषण किया है। नाभिक 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (नीला) के साथ counterstained कर रहे हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों उनके इसी अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवियों पर मढ़ा जाता है। (सी) वायरस उपज। 1 कोशिकाओं में सुसंस्कृत हैं50 मिमी संस्कृति व्यंजन। 22 और 40 एचपीटी पर शाही सेना electroporated कोशिकाओं की संस्कृति supernatants में संचित संक्रामक virions के उत्पादन पट्टिका assays के द्वारा जांच की है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक दो विभिन्न प्रकारों (CNU / LP2 27 और एसए 14 -14-2 28) जेईवी, जिसका कार्यात्मक सीडीएनए साबित कर दिया है निर्माण करने के लिए स्वाभाविक रूप से कठिन होने के लिए एक flavivirus की और के लिए पूर्ण लंबाई संक्रामक सीडीएनए क्लोन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है क्योंकि मेजबान सेल विषाक्तता और क्लोन सीडीएनए के आनुवंशिक अस्थिरता का प्रचार 8,74-76 इस प्रोटोकॉल के तीन प्रमुख घटक शामिल है:। उच्च निष्ठा रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग कर वायरल शाही सेना के एक वफादार सीडीएनए प्रतिलिपि के संश्लेषण / प्रवर्धन अधिकतम पहले / डीएनए पोलीमरेज़; दूसरा, अंतिम पूर्ण लंबाई सीडीएनए विधानसभा कदम को subcloning प्रारंभिक सीडीएनए से एक बहुत ही कम प्रतिलिपि संख्या वेक्टर बीएसी में (अप्रकाशित डेटा) विषाक्त दृश्यों से युक्त वायरल पी आर एम ई कोडिंग क्षेत्र 74,77,78 क्लोनिंग; और तीसरे, जाहिरा तौर पर बड़ा डीएनए Inse बर्दाश्त जो 120-350 केबी, 19-21 के एक औसत आकार के साथ एक विदेशी डीएनए समायोजित कर सकते हैं कि एक क्लोनिंग वेक्टर बीएसी का उपयोगसे RTS अन्य क्लोनिंग वैक्टर करते हैं। यह क्लोनिंग दृष्टिकोण कई अन्य सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस, ~ 10-32 केबी की एक बड़ी आरएनए जीनोम के साथ विशेष रूप से उन लोगों के लिए आम तौर पर लागू हो जाएगा। इसके जीनोम मेजबान सेल राइबोसोम से प्रोटीन में अनुवाद किया है कि के रूप में वायरल mRNA कार्य करता है क्योंकि एक संक्रामक सीडीएनए क्लोन की पीढ़ी, विशेष रूप से सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस के लिए, आरएनए वायरस के लिए एक रिवर्स आनुवंशिकी प्रणाली विकसित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। इस प्रकार, वायरल प्रतिकृति एक अतिसंवेदनशील मेजबान सेल में एक सीडीएनए व्युत्पन्न जीनोम लंबाई आरएनए अणु के लागू होने से शुरू किया जा सकता है। एक संक्रामक जेईवी सीडीएनए क्लोन की उपलब्धता, पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी के साथ संयुक्त, इस तरह के जीन अभिव्यक्ति 73,79 और जीनोम प्रतिकृति के रूप में, आणविक स्तर पर वायरल जीवन चक्र के विभिन्न पहलुओं के बारे में हमारी समझ में वृद्धि हुई है। 63,64 इसके अलावा, एक पूर्ण लंबाई जेईवी सीडीएनए क्लोन एंटीवायरल टीके 28 और जीन डिलीवरी वैक्टर के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो गया है। <समर्थन> 80,81

सभी सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस के रूप में, अत्यधिक संक्रामक आरएनए इन विट्रो में संश्लेषित किया जा सकता है जिसमें से जेईवी के लिए एक विश्वसनीय कार्यात्मक सीडीएनए के निर्माण में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। आदर्श रूप में, पूर्ण लंबाई सीडीएनए का क्लोन से लिखित सिंथेटिक RNAs के अनुक्रम वायरल जीनोमिक शाही सेना, वायरल शाही सेना प्रतिकृति की दीक्षा के लिए आवश्यक हैं कि विशेष रूप से 5'- और 3'-टर्मिनल दृश्यों के लिए समान होना चाहिए । 60-62 मौजूदा प्रोटोकॉल में, प्रामाणिक 5'- और 3'-सिरों आखिरी के बहाव वायरल जीनोम की पहली एडिनाइन न्यूक्लियोटाइड के अपस्ट्रीम SP6 प्रमोटर अनुक्रम रखने और एक अद्वितीय कृत्रिम Xba मैं प्रतिबंध साइट स्थिति से यह सुनिश्चित कर रहे थे क्रमश: वायरल जीनोम की थाइमिन न्यूक्लियोटाइड,। एक Xba मैं-linearized और एमबीएन इलाज सीडीएनए ते की रन ऑफ प्रतिलेखन द्वारा तैयार किए गए प्रामाणिक 5 'और 3' के साथ समाप्त होता सिंथेटिक आरएनए छायाmplate मीटर 7 जी (5) के साथ primed SP6 शाही सेना पोलीमर्स पीपीपी (5 ') एक टोपी अनुरूप इस्तेमाल करते हैं। इस प्रोटोकॉल कई मायनों में संशोधित किया जा सकता है। उस में मौजूद नहीं है इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए, एक और जीवाणुभोजी आरएनए पोलीमर्स (जैसे, T3 या T7) अपनी अच्छी तरह से परिभाषित प्रमोटर अनुक्रम के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। 27 रन ऑफ साइट के रूप में, एक अलग प्रतिबंध साइट उपयोग किया जा सकता linearized सीडीएनए से वायरल जीनोम और अगर सिंथेटिक आरएनए प्रामाणिक 3 'अंत के साथ समाप्त होता है। एक सिंथेटिक आरएनए अपनी 3 'के अंत में तीन या चार वायरस से असंबंधित न्यूक्लियोटाइड होता है जब 3'अंत न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का महत्व आरएनए संक्रामकता में एक ~ 10 गुना कमी से प्रदर्शित किया गया है। इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में 27, दोनों मी 7 जी (5) पीपीपी (5 ') ए और एम 7 जी (5) पीपीपी (5') जी टोपी अनुरूप 5 वायरल के उत्तरार्द्ध स्थानों हालांकि एक असंबंधित अतिरिक्त जी न्यूक्लियोटाइड नदी के ऊपर, अच्छी तरह से समान रूप से इस्तेमाल किया जा सकता 'अंत, लेकिन लगता है किइसके अलावा संक्रामकता या सिंथेटिक आरएनए की प्रतिकृति को बदल नहीं है। 27 इसके अलावा, DNase मैं पाचन द्वारा शाही सेना टेप से सीडीएनए टेम्पलेट को हटाने के आरएनए संक्रामकता परीक्षण के लिए आवश्यक नहीं है, सीडीएनए टेम्पलेट में ही संक्रामक नहीं है। 27

बीएसी तकनीक अब सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस, अर्थात्, दो JEVs, CNU / LP2 27 और एसए 14 -14-2 28 (जीनोम आकार, ~ 11 KB) के एक मुट्ठी भर के लिए संक्रामक सीडीएनए क्लोन का निर्माण करने के लिए लागू किया गया है; दो डेंगू वायरस, बीआर / 90 26 और NGC 29 (~ 11 KB); गोजातीय वायरल डायरिया वायरस, SD1 (~ 12 केबी), 25 दो शास्त्रीय सूअर ज्वर वायरस, सी और पाडेरबोर्न (~ 12 केबी), 24 सीमा रोग वायरस, Gifhorn (~ 12 केबी), 24 सुअर प्रजनन और रेस्पिरेटरी सिंड्रोम वायरस , PL97-1 / LP1 (~ 15 केबी), 30 से संक्रामक आंत्रशोथ वायरस, PUR46 पागल (~ 29 KB), 16 बिल्ली के समान संक्रामक पेरिटोनिटिस वायरस,डीएफ -2 (~ 29 केबी), 32 सीवियर एक्यूट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनावायरस, Urbani (~ 30 केबी), 9 मध्य पूर्व रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनावायरस, ईएमसी / 2012 (~ 30 केबी), 17 और मानव कोरोनावायरस, OC43 (~ 31 केबी) 31 सीडीएनए निर्माण के लिए बेक्स उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि बड़े, 1- या 2-प्रतिलिपि बीएसी plasmids के उच्च आनुवंशिक स्थिरता है। हालांकि, इसकी बेहद कम प्रतिलिपि संख्या का स्वभाव क्योंकि बीएसी डीएनए और गुणसूत्र डीएनए की मेजबानी के संबंध में बीएसी डीएनए की शुद्धता में परिणामी कमी की बहुत कम पैदावार की, यह भी एक बड़ा नुकसान है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, बीएसी डीएनए की उपज ई बढ़ती द्वारा अधिकतम है कोलाई DH10B एक पोषक तत्व युक्त मध्यम, 2xYT में / संक्रामक बीएसी pBAC साथ एसए 14 -14-2 बदल दिया। इस प्रयास के बावजूद, औसत उपज केवल ~ 15 माइक्रोग्राम 2xYT शोरबा की 500 मिलीलीटर से बीएसी डीएनए की है। इसके अलावा, बीएसी डीएनए की शुद्धता सबसे अच्छा शुद्धि के लिए CsCl-EtBr घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग करके हासिल की है, बल्कि आमतौर पर इस्तेमाल स्तंभ आधारित प्लाज्मिड अलगाव से। हालांकि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि बीएसी तब्दील ई इसे क्लोन सीडीएनए के आनुवंशिक स्थिरता को खतरे में डाल सकता है, क्योंकि कोलाई ऊंचा हो जाना नहीं होना चाहिए, और उच्च विकास के लिए जरूरी अधिक पैदावार या उच्च शुद्धता बीएसी डीएनए के लिए नेतृत्व नहीं करता है।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल जेईवी के लिए एक बीएसी के रूप में एक आनुवंशिक रूप से स्थिर पूर्ण लंबाई संक्रामक सीडीएनए क्लोन के निर्माण और प्रचार के लिए एक अनुकूलित, कुशल, और सुव्यवस्थित विधि है, एक प्रक्रिया एक बार व्यावहारिक रूप से असंभव सोचा। यह वही क्लोनिंग रणनीति भी कई अन्य सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस के लिए लागू किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, संक्रामक सीडीएनए क्लोन वायरल प्रतिकृति और रोगजनन में उनके जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक वायरल आरएनए जीनोम में म्यूटेशन (जैसे, विलोपन, सम्मिलन, और बिंदु उत्परिवर्तन) की एक किस्म को पेश करने के लिए सक्षम। इस सीडीएनए आधारित रिवर्स आनुवंशिकी प्रणाली इसे विकसित करने के लिए संभव है और टीईएस बनाता हैटी टीका और ब्याज की एक विशेष सकारात्मक-कतरा आरएनए वायरस का एक विषैलापन कारक (ओं) को निशाना चिकित्सकीय उम्मीदवारों। इसके अलावा, इस संक्रामक सीडीएनए तकनीक भी जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में कई अनुप्रयोगों के लिए ब्याज की एक विदेशी (ओं) जीन व्यक्त करने में सक्षम एक वायरल वेक्टर, के रूप में उपयोग किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Molecular Cloning
2xYT Broth Sigma-Aldrich Y2377
[3H]UTP PerkinElmer NET380250UC Radioactive
50 ml Tube Thermo Scientific (Nalgene) 3114-0050
250 ml Bottle Beckman Coulter 356011
Agarose Lonza 50004
Agarose (Low Melting Point) Life Technologies (Invitrogen) 16520-100
AvaI New England BioLabs R0152S
AvrII New England BioLabs R0174S
BamHI New England BioLabs R0136S
BsiWI New England BioLabs R0553S
BsrGI New England BioLabs R0575S
Butanol Fisher Scientific A399-1 
Cesium Chloride Fisher Scientific BP1595-1
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Carcinogenic
DE-81 Filter Paper GE Healthcare Life Sciences 3658-023
dNTP mix Life Technologies (Invitrogen) 18427-088
E. coli DH10B  Life Technologies (Invitrogen) 18297-010
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Ethanol  Sigma-Aldrich E7023
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 Toxic and highly mutagenic
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-26
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283 Irritating
Glucose Sigma-Aldrich G5400
Glycogen  Roche 10901393001
High-fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491S
Isoamyl Alcohol Sigma-Aldrich I9392 Flammable
Isopropanol  Amresco 0918 Flammable
LB Broth Life Technologies (Invitrogen) 12795-027
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650
Lysozyme Amresco 0663
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
M-MLV Reverse Transcriptase Life Technologies (Invitrogen) 18080-044
Mung Bean Nuclease New England BioLabs M0250S
Needle (18G, 20G) BD 305196, 305175 Biohazardous (Sharps waste)
NotI New England BioLabs R0189S
Oligonucleotide Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide Synthesis
PacI New England BioLabs R0547S
pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Phenol (Buffer-Saturated) Life Technologies (Invitrogen) 15513-039 Toxic and highly corrosive
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Life Technologies (Invitrogen) 15593-031 Toxic and highly corrosive
Phenol:Guanidine Isothiocyanate Life Technologies (Ambion) 10296-010 Toxic, corrosive, and irritating
Pme I New England BioLabs R0560S
Potassium Acetate Amresco 0698
RNase Inhibitor Life Technologies (Invitrogen) 10777-019
rNTP Set GE Healthcare Life Sciences 27-2025-01
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm)  Beckman Coulter 342413
SfiI New England BioLabs R0123S
Sma I New England BioLabs R0141S
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Dodecyl Sulfate Amresco 0227
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
SP6 RNA Polymerase New England BioLabs M0207S
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-11
Syringe HSW NORM-JECT 4200.000V0
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
Tris Amresco 0826
tRNA (yeast) Life Technologies (Invitrogen) 15401-011
XbaI  New England BioLabs R0145S
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell Culture
Alpha Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 12561-049
Conical Tube (50 mL) VWR 21008-242
Crystal Violet  Sigma-Aldrich C0775
Culture Dish (150 mm)  TPP 93150 
Cuvette (2-mm Gap) Harvard Apparatus 450125 
Fetal Bovine Serum  Life Technologies (Gibco) 16000-044
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Toxic and carcinogenic
Glutamine Life Technologies (Gibco) 25030-081
Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 61100-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies (Gibco) 15070-063
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791
Six-Well Plate TPP 92006
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich S3264
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies (Gibco) 25200-056
Vitamins Sigma-Aldrich M6895
Name Company Catalog Number Comments
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Mupid MPDEXU-01
CO2 Incubator Thermo Scientific Heracell 150i
Desktop Centrifuge  Thermo Scientific ST16R
Electroporator Harvard Apparatus ECM 830
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) UVP UVGL-58
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 368826
Thermocycler Life Technologies (Applied Biosystems) GeneAmp PCR System 9700
Vortexer Scientific Industries G-560
Water Bath Jeio Tech WB-10E

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References

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Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., Lee, Y. M. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (106), e53164, doi:10.3791/53164 (2015).

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