Summary
Kanaler til transport af vandmolekyler i enzymer indflydelse aktivt sted solvatisering og katalyse. Heri præsenterer vi en protokol for engineering af disse yderligere katalytiske motiver baseret på in silico computermodeller og eksperimenter. Dette vil øge vores forståelse af den indflydelse, opløsningsmidler dynamik på enzym katalyse.
Introduction
Vand udgør en hjørnesten for kemien i livet 1. Vand mønstre og solvatisering af enzym aktive sites påvirker både enthalpi og entropi ligandbinding 1,2 og katalyse 3 i en meget kompleks måde strækker sig ud over den hydrofobe virkning 2,3. NMR 4, har kalorimetri 2 og molekylær modellering af opløste proteiner blevet brugt til at kaste lys over den rolle, som eksplicitte vandmolekyler i at yde en drivkraft for ligand forening 5-8, specificitet og aktivitet 2,9,10. Heri præsenterer vi en unik metode til eksperimentel vurdering af termodynamiske virkninger af opløsningsmiddel forskydning på enzym katalyse (figur 1). Vores kombinerede strategi er baseret på brug af computersimuleringer i koncert med enzym teknik og termodynamisk analyse (figur 1). Dette giver mulighed for at kaste yderligere lys over konsekvenserne af opløsningsmidler dynamik på catalysis, som i øjeblikket er dårligt forstået.
Stabiliserende enthalpic interaktioner, der leveres af vand-medieret hydrogenbindinger i solvateret enzym aktive steder, kan opvejes af entropiske sanktioner 1. Disse entropiske omkostninger er forbundet med faldet i antallet af frihedsgrader, der vises af vandmolekyler begrænset inden protein hulrum, sammenlignet med vand i bulk 5. Frigivelsen af bestilte vandmolekyler kan således give en entropisk drivkraft for ligand forening 1 og katalyse 3. Et centralt aspekt af opløsningsmidler dynamik er forskydningen af vandmolekyler mellem det indre af proteiner, og det ydre opløsningsmiddel 4. De ledsagende ændringer i aktiveringsenergien, enthalpi og entropi 11 ikke er fuldstændig forstået på det molekylære niveau. Ved at blokere enkelte tunneller er ansvarlige for transport af vand i enzymer, betydningen af opløsningsmidler dynamik og dets bidrag til aktiveringenergi kan evalueres (figur 1). Desuden ved at udføre ettrinssystemer kinetiske forsøg ved forskellige temperaturer, den relative termodynamiske aktiveringsparametre flere substrater kan ekstraheres fra et reduceret antal forsøg (figur 1, højre). Vores tværfaglige metode er valideret til komplekse membranbundne triterpen cyclase enzymer, der genererer polycykliske terpener af stor betydning for livet 12. Protokollen giver mulighed for inddrivelse af høje mængder af membranprotein (10-20 mg / l) ved hjælp af en standard centrifuge.
Selv om enzymer udviklet i vand, er den rolle af opløsningsmidlet i fremme katalyse normalt forsømt. Ud over protein dynamik 13,14 denne form pre-organiserede aktive sites med elektrostatisk komplementaritet til overgangen stand 15, kunne vand dynamik være af stor betydning for en effektiv enzym katalyse. Ved smedning flere tværfaglige teknikker, voresMålet er at lette den meget komplicerede undersøgelse af vanddynamik og termodynamik. At gøre disse redskaber mere tilgængelige for det videnskabelige samfund vil føre til udvikling af nye strategier i enzym-ingeniør og protein design til ændrede aktiviteter og særlige.
Protocol
1. simulation computermodellering
- Download en FBF struktur af proteinet af interesse fra Protein Data Bank (FBF). Forbered strukturen ved at fjerne overskydende underenheder og derefter tilføje forsvundne brintatomer og eksplicitte opløsningsmiddel ved hjælp af "Cell Neutralisering og p K en forudsigelse" eksperiment i YASARA 16. Til membranbundne triterpene cyclaser, egnede dimensioner af vandbeholderen er 91x67x77 Å. Juster protonering tilstand katalytisk aktive aminosyrer manuelt.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, kan et substrat analog i FBF-filen ændres til en rigtig substrat ved at bruge "Rediger | Swap | Atom" kommando. - Minimer strukturen af kommandoen "Energi Minimering" ved hjælp af AMBER kraftfelt suite 17. Brug partikel mesh Ewald tilgang (PME) 18 at tage højde for langtrækkende elektrostatiske interaktioner. Indstil cut-off for van der Waals interaktioner i henholdtil standard indstillinger.
Bemærk: Kommandoen "Energi Minimering" fjerner konformationel stress ved en kort stejleste nedkørsel minimering, derefter en simuleret udglødning (tidsskridt 2 fsec, atom hastigheder skaleret ned med 0,9 hver 10. trin) udføres indtil konvergens er nået (dvs. forbedring af energi med mindre end 0,012 kcal / mol pr atom i 200 trin).
2. Model af aktive site solvatisering og adgang til vand
- Efter den simulerede udglødning, køre en 20 NSEC molekylær dynamik (MD) bane og generere mindst 10 øjebliksbilleder af "File | Simulation Snapshot | Gem som" kommando efterfulgt af "Simulering On". Kør simuleringer på en standard computer med periodiske randbetingelser under den kanoniske ensemble. Holde temperaturen på 298 K ved hjælp af en Berendsen termostat.
- Forbered snapshots opnået fra 2,1 ved at slette alle vandmolekyler og eventuelle ligander / substrater ved hjælp af4, Rediger | Slet | Rest "kommando superpose hvert snapshot individuelt på den oprindelige FBF-struktur ved." Superpose | kommandoen Objekt "for at sikre, at alle strukturer deler den samme rumlige position Gem hvert snapshot forberedt på denne måde som en ny FBF. -fil (ved hjælp af "Filer | Gem som | FBF" kommando).
Bemærk: For erfarne modelers: Skriv et script til at automatisere denne proces i henhold til skabelonen givet i Supplerende kodeks File 1. - Brug de forberedte snapshots (FBF) fra 2,2, som er blevet justeret i 3D-rum som input til softwaren caver 3,0 19. Til analysen af et begrænset antal snapshots, køre caver på en standard computer. Brug en probe radius på 0,7 Å 19 for at sikre påvisning af tunneler, der er specifikke for transport af vandmolekyler.
- Visualisere tunnellerne genereret af caver 3,0 i en molekylær grafik software. For let visualisering af tunneler, bruge makroen vist i supplerende kodeks File 2.
3. I Silico Enzyme Engineering til Ændre Vand Mønstre og vand Dynamics
- Identificere de højest rangerende tunneler ifølge overskriften "ID" opført i output filen "Summary.txt" genereret fra caver 3,0 software.
- Identificer aminosyrer foring højest rangerende tunneler (3.1), og at skærmen en lille side kæde peger mod kanalen interiør ved visuel inspektion (ved hjælp af fås fra 2,4 modellen). Identificere enkelte aminosyresubstitutioner, der vil blokere tunnelen ved øget sterisk hindring ved hjælp af kommandoen "Swap Rest". Kontroller, at tunnelen er blokeret ved visuel inspektion, og derefter ved at gentage trin 1,2-3,1 af protokollen.
4. Angivelse af muterede gener
- Indføre mutationer i vildtypegenet ved mutagenese PCR under anvendelse af ikke-overlappende primere 20.
- Tilføj plasmid DNA indeholdende genet af interesse til rørets med kompetente celler af en egnet stamme kloning og inkuberes på is i 30 minutter. Udfør en varmechok transformation i 45 sekunder i et vandbad med temperaturen indstillet til 42 ° C. Der tilsættes 500 pi af en frisk rigt medium (2YT, 16 g / L trypton, 10 g / l gærekstrakt, 5 g / l NaCl), og der inkuberes ved 37 ° C, 200 rpm i 45 min. Foretag et valg ved udpladning af de transformerede celler på agarplader suppleret med passende antibiotika.
- Efter at have kontrolleret DNA-sekvensen af det muterede gen, transformere plasmid-DNA'et i en ekspressionsvektor stamme under anvendelse varmechok som beskrevet ovenfor. Til ekspression af membranbundne triterpene cyclaser, bruge BL21 (DE3).
- Start et 5 ml O / N-kulturen ved 37 ° C i ekspressionsstammen i 2YT-medium suppleret med de passende antibiotika.
- Inokulere en 2 L forvirret rystekolbe indeholdende 300 ml 2YT-medium suppleret med passende antibiotika, til en endelig OD på 0,05 til 0,09 (målt ved 600 nm). Efter induktion ved en OD på 0,6-0.8 og proteinekspression, fryse cellepelleten og opbevares ved -80 ° C.
- For membranbundne triterpene cyclaser i en pD861 vektor, inducere med 0,5 til 2 mM rhamnose og 4 timer af ekspression ved 37 ° C for at opnå høje udbytter af protein 21.
5. Membrane Ekstraktion Ved hjælp af en normal Centrifuge og Protein Purification
- Forbered følgende buffere: resuspensionsbuffer (100 mM kaliumphosphat, pH 7,5 suppleret med proteasehæmmer tabletter), detergentbuffer (1% (v / v) Triton X-100, 50 mM kaliumphosphat, pH 7,5) og Reaction buffer (0,2 % Triton X-100, 50 mM kaliumphosphat, pH 7,5).
- For squalen-hopene cyclaser eller andre membranbundne enzymer med en lavere pH-optimum, udskifte kaliumphosphat i resuspenderingsbufferen med citrat. For sådanne enzymer bruge følgende buffere: Vaskemiddel buffer (1% Triton X-100, 60 mM citrat, pH 6,0) og Reaction buffer (0,2% Triton-X 100, 60 mM citrat, pH 6,0).
Bemærk: Hvis et His-tag bruges til oprensning, supplere resuspenderingsbufferen med 20 mM imidazol (slutkoncentration).
- For squalen-hopene cyclaser eller andre membranbundne enzymer med en lavere pH-optimum, udskifte kaliumphosphat i resuspenderingsbufferen med citrat. For sådanne enzymer bruge følgende buffere: Vaskemiddel buffer (1% Triton X-100, 60 mM citrat, pH 6,0) og Reaction buffer (0,2% Triton-X 100, 60 mM citrat, pH 6,0).
- En frossen cellepelleten i et bægerglas vejes. Resuspender cellerne i genopslæmningspuffer anvendelse af en homogenisator til en slutkoncentration på 0,3 g celler / ml. Lyserer de resuspenderede celler ved ultralydsbehandling med en amplitude på 80% og en puls af 1 sek på og 1 sek off. Bruge tre gentagne cykler af 50 sek hver.
- Tilføj detergentbuffer til en slutkoncentration på 0,2% (v / v) detergent. Ækvilibrere ved ende-over-ende blanding ved 4 ° C i 1 time. Opsaml membranfraktion protein ved at gemme supernatanten efter en enkelt centrifugeringstrin ved 39.000 xg i 50 minutter ved 4 ° C.
Bemærk: Hvis der anvendes His-tag oprensning tilsættes ca. 1,5 ml Ni-NTA agarose / g-celler og inkuberes i 1 time. - Udfør en første rensningtrin ved enten ionbytning eller His-tag rensning 21. Supplement ækvilibrerings- og elueringsbuffere med 0,2% Triton X-100. Koncentrer det oprensede protein fem gange ved anvendelse af centrifugalfilter Enheder med en afskæring på 10 kDa.
Bemærk: Størrelsen af Triton X-100 miceller resulterer i en koncentration af detergent til en slutkoncentration på ca. 1%. - Afslut oprensning ved gelfiltrering med poleringstrin hjælp af koncentreret protein og en matrix forenelig med en fraktioneringsområde for kugleformede proteiner på 2 x 10 4 -8 × 10 6. Brug reaktionspuffer som løbebuffer. Måle mængden af oprenset protein ved hjælp af Bradford Ultra kit ifølge producentens protokol.
6. Kinetik
- Lav en frisk 5 mM stamopløsning af substrat i reaktionspuffer. Opnå en homogen emulsion ved ultralydbehandling ved 30% amplitude i 2-5 min.
- Ækvilibrer en termomikserved den ønskede reaktionstemperatur. Kontroller temperaturen inden et hætteglas indeholdende vand ved en ekstern termometer.
- For single-substrat kinetik, fortyndes det emulgerede substrat i mindst fem hætteglas til den samme endelige substratkoncentration.
- For ettrinssystemer relative kinetik med flere substrater fremstilles mindst fem identiske hætteglas ved at blande alle underlag i hvert hætteglas. For hydrofobe triterpener, bruge endelige substratkoncentrationer i området 10-200 uM.
- Præinkubere glasvialerne i termomikser i 10 minutter. Start reaktionen ved tilsætning af enzymet. En totalt reaktionsvolumen på 1 ml er egnet. Brug en rystende hastighed på mindst 1.200 rpm.
- Stop reaktionerne ved forskellige tidspunkter ved tilsætning af 500 pi ethylacetat tilsat 100 uM decanol som en integration standard.
7. Ekstraktion og Termodynamiske analyse
- Uddrag reaktionsblandingerne eftervortexing og manuelt at ryste hætteglas kraftigt i 1 min. Centrifuger hætteglas på 9.600 xg i en bordcentrifuge i 10 minutter ved stuetemperatur. Overfør det øverste lag (organisk fase) til et tomt rør. Tilføje en ekstra 500 pi ekstraktionsopløsningsmiddel til reaktionsrørene og ekstraktionen gentages proceduren.
- Tør de udtrukne reaktionsblandingerne med Na 2 SO 4. Vortex for 5 sek og lad rørene hvile i 10 minutter. Udfør en endelig centrifugeringstrin ved 9.600 x g i 1 min ved stuetemperatur under anvendelse af en bordcentrifuge. Overfør ekstraherede prøver gaschromatografi (GC) hætteglas.
- Gentag trinene under 6,1-7,2 for hvert enzym variant af interesse, under anvendelse af mindst fire forskellige oprindelige koncentration af substrat (for enkelt substrat kinetik) og fire forskellige temperaturer (for både enkelt substrat og konkurrencedygtige kinetik).
- Udfør GC-analyse som tidligere beskrevet 3. Anvende et ikke-polære søjler til analyse af hydrophobic pentacyclic produkter. Sæt den indledende ovntemperaturen til 120 ° C og bruge en temperaturgradient på 5 ° C / min, afhængig af de produkter og søjlen.
- Integrere toparealerne af produktet (r) og omdanne produktet toparealer i de tilsvarende produktkoncentrationer ved at udnytte arealet af integrationen standard (svarende til 100 uM). Plot koncentrationen af hvert produkt ([P]) versus reaktionstiden (t). Udfør lineær regression af datapunkter, der svarer til mindre end 10% omdannelse. Den indledende reaktionshastighed (V 0) er givet ved hældningen af den tilpassede linje i henhold til:
Bemærk: For ettrinssystemer relative kinetik med flere substrater, V 0 er den indledende hastighed af et særligt substrat under påvirkning af andre substrater. - For enlige substrat kinetik, plot V 0 kcat / KM-værdi er givet ved hældningen af den lineære del af grafen ifølge:
[S] er koncentrationen af substrat og [E] er koncentrationen af enzym, der anvendes i omdannelsen. Kcat / M svarer til den katalytiske konstant over Michaelis konstant. Gentag analysen for hver temperatur og hver enzymvariant. - For enlige substrat kinetik, udføre en termodynamisk analyse ifølge transition state teori 22
Kb er Boltzmann konstant, h Plancks konstant, T temperaturen i Kelvin, og R gaskonstanten. Udfør en lineær regressionsanalyse af afbildning af ln ((k
Bemærk: På samme måde kan en analyse under mættende substratkoncentration udføres ved hjælp af k kat som hastighedskonstanten i ligning 3. - For én-pot relative kinetik med flere substrater, opnå den relative tilsyneladende
kcat / M værdier fra 23:
(Kcat / KM) A / (kcat / KM) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [A] (4)
for hvilke V 0, A henviser til den første pris på substrat A i konkurrence med substrat B. - For one-pot relative kikokinetik med flere substrater, opnå de relative termodynamiske parametre for aktivering for B, sammenlignet med A som reference, ved ikke-lineær regression:
- Beregn de absolutte aktivering parametre for substrat B fra aktiveringen enthalpi og entropi henvisning forbindelse A:
Representative Results
Betydningen af vand dynamik i enzymatisk polycyclization katalyse er impliceret med i silico analyse og efterfølgende visualisering af fundne tunneler (ved hjælp af script i Supplerende kodeks File 2). Efter § 3 i protokollen, er S168 fundet at være et "hot spot" aminosyrerest foring en af tunneler i det triterpen cyclase enzym fra Alicyclobacillus acidocaldarius (figur 1, midterste venstre). Ved at indføre mutationen S168F simulation, er tunnelen blokeret som ses ved visuel inspektion (figur 1, nederst til venstre).
Reaktionshastigheden til dannelse af polycykliske produkter, der udstilles af triterpene cyclase enzymet er yderst følsomme over for temperatur (figur 2A). Ved at følge protokollen (afsnit 4-7), er det konstateret, at den tilsyneladende kcat /
Fra eksperimentelt bestemte kinetiske parametre, er lineære termodynamiske plots genereret af ligning 3 og ved at følge punkt 6-7 i protokollen for enkelt substrat kinetik (figur 2B). De meget store ændringer i aktivering entropi og enthalpi observeret for varianter huser blokerede tunneler indebærer en central rolle for vand dynamik i at fremme polycyclization kaskade (figur 2C, beregninger baseret på figur 2B). Desuden, Varianter med ændrede vand tunneler vise en ændret Gibbs fri energi for aktivering (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡, figur 2B-C). For eksempel, ved 303 K i S168F tunnelen variant viser en Gibbs fri energi for aktivering af 14 kcal / mol i forhold til 16 kcal / mol for vildtype-enzymet.
Efter protokollen i § 7, ligning 4 giver mulighed for beregning af tilsyneladende k cat / K M værdier for yderligere substrater fra en-pot kinetiske eksperimenter (figur 3A). Desuden kan en lineær termodynamisk plot (figur 3B) konstrueres ved at køre konkurrencen essay ved forskellige temperaturer (ligning 5). Analogt med enkelt substrat kinetik, den relative aktivering enthalpi og entropi for yderligere substrater sammenlignet med en referenceforbindelse er readily tilgængelig fra skæringspunkt og hældning af den lineære passer til de eksperimentelle data. Absolutte værdier af termodynamiske parametre for aktivering kan vurderes ud fra aritmetiske tilsætning ved hjælp af termodynamiske data i forbindelse med referenceforbindelsen (ligning 6). Under anvendelse af protokollen heri genereret Resultaterne viser klart, enzymmembran varianter med blokerede Vandtunneler vise fundamentalt forskellige termodynamiske parametre for aktivering for substrater af forskellige størrelser (figur 3C).
Figur 1. Protokol resumé:. I silico computermodeller i koncert med eksperimenterende protein design og termodynamisk analyse giver mulighed for en øget forståelse af den betydning af opløsningsmidler dynamik på enzymkatalyse Klikher for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Termodynamiske parametre for aktivering af vildtype og tunnel varianter fra enkelt substrat kinetik. (A) Tilsyneladende kcat / M værdier opnået fra eksperimentelle data og ved anvendelse af ligningerne 1 og 2. (B) termodynamiske analyse under anvendelse transition state teori og lineær tilpasning af de eksperimentelle data til ligning 3. (C) Termodynamiske parametre for aktivering beregnet ud fra de parceller i (B). Den er foldet på forhånd squalen substrat er vist med obligationer dannet / brudt som stiplede linjer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Termodynamiske parametre for aktivering af vildtype og tunnel varianter til forskellige substrater. (A) Relativ kcat / M værdier opnået fra ettrinssystemer kinetik ved anvendelse af ligning 4. (B) Termodynamiske afbildninger af kinetiske data på forskellige temperaturer hjælp af ligning 5. (C) absolutte termodynamiske parametre for aktivering beregnet ved ligning 6 og ved anvendelse af substratet squalen i figur 2 som reference. Obligationer dannet / brudt i substrater er vist som stiplede linier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
De mest kritiske trin i at opnå en høj kvalitet eksperimentelle termodynamiske data for vildtype-enzym og tunnel membran varianter er: 1) generering af computermodellen; 2) homogent oprensede proteiner; 3) emulgerede substrat lagre; 4) styring af temperatur under kinetik; 5) udvinding af reaktionsblandinger hjælp intern standard.
Den generation af computermodellen er stærkt lettes ved anvendelse af en software med en brugervenlig grænseflade, der understøtter en række forskellige platforme. Derfor er denne protokol bygger på den YASARA modellering pakken 16 at gøre vores strategi tilgængelig, selv at modellere ikke-eksperter. En computermodel til identifikation vandtunnel bør ideelt være baseret på en krystalstruktur af enzymet af interesse 24. Til dette formål, det væld af krystalstrukturer rådighed i Protein Data Bank er meget gavnligt. Det er vores erfaring, et centralt aspekt i vellykket forberedelse af templader til identifikation tunnel er at holde krystallografiske farvande. Det er lige så vigtigt at bruge en solvateret enzym kasse, når du udfører molekylære simuleringer, som kan køre på en normal computer. Triterpenen cyclase fra Alicyclobacillus acidocaldarius er stabilt i vand under MD simuleringer 3. Men holde krystallografiske detergenter og / eller ved hjælp af cellemembran efterligner måske ville være behov for potentielt ustabile enzymer for at muliggøre udvidede MD simuleringer. Det forudses, at den minimerede krystalstrukturen af meget vanskelige mål kunne give vigtig mekanistisk indsigt under anvendelse af protokollen, skønt dette ikke ville fange dynamiske aspekter af tunnelen organisation.
Caver 19 i den grundlæggende tilstand, med en enkelt eller et begrænset antal snapshots som input, kan bruges af ikke-eksperter på en standard bærbar computer. Baseret på vores erfaring 3, tunneler med en flaskehals radius (dvs. radiuspå det mest snævre punkt) er mindre end 1 Å kan være yderst relevante for vand, især hvis krystallografiske vandmolekyler opholde sig forudsagte tunnel (figur 1, midterste venstre). På den anden side kunne en større flaskehals radius medfører en tunnel til transport af substratet i og ud af det aktive sted 10. Scriptet i supplerende kodeks File 2 kan anvendes af ikke-eksperter til visualisering af forudsagte tunneler. Fremtidige eksperimenter vil afsløre, om homologi modeller vil være tilstrækkeligt høj opløsning for at tillade atomistiske undersøgelse af vandnet og dynamik. Kaste lys over, hvordan du udfører molekylære simuleringer, med og uden en ligand til stede i det aktive site, påvirker processen med identifikation tunnel vil også være af betydning.
Kinetik af membranproteiner kan udgøre en formidabel udfordring 25. Protokollen heri er baseret på en simpel membranekstraktion protokolat opnå enzym membranen uden brug af dyrt udstyr, såsom en ultracentrifuge. Anvendelsen af gelfiltrering som en endelig polering trin fjerner potentielle tilbageværende membran partikler og giver mulighed for at definere et passende detergent miljø 25.
Et centralt aspekt i at opnå reproducerbare kinetiske følge af protokollen er at emulgere underlaget stamopløsningen ved ultralydsbehandling. Enkel vortexing af hydrofobe substrater fortyndet i reaktionspuffer giver inhomogene substrat-detergent-blandinger. Den pipettering af ikke-emulgerede substratopløsninger fører til reproducerbare koncentrationer (bekræftet ved kvantitativ GC), hvilket forhindrer nøjagtig bestemmelse af de oprindelige satser. Derimod bør den afpipettering af korrekt emulgerede stamopløsninger resultere i lineær regressionsanalyse af de oprindelige satser med R2 i intervallet 0,98-0,99. Et andet vigtigt aspekt af hydrofobe substrater er den tilsyneladende substrat opløselighedog tilgængelighed i substrat-vaskemiddel blandinger. Faktisk var det ikke muligt at mætte triterpene cyclase med henvisning substrat squalen. Af denne grund tilsyneladende kcat / er K M værdier præsenteret heri, som kan indeholde bidrag fra både bindende og kemi. Det har imidlertid vist sig, at kemien er hastighedsbegrænsende for kcat / KM for polycyclization kaskade udført af triterpene cyclaser 3.
Det er af stor betydning for at kontrollere den aktuelle temperatur inde i en hætteglas reaktion glas med en ekstern termometer. Alligevel kan lineære passer være dårligere for varianter med essentiel konstante tilsyneladende k cat / K M værdier ved forskellige temperaturer. Dette understreges for S168F variant heri (figur 2A) med en aktivering entalpi tæt på nul (figur 2B og 2C). Meget small temperaturafhængige ændringer i tilsyneladende kcat / KM, kunne inducere usikkerhed i den observerede aktivering entropi Δ S ‡ (dvs. skæringspunktet i den lineære plots i figur 2B). I princippet kunne den observerede aktivering entropi også blive påvirket af en anden overflod af aktive enzymer for forskellige varianter, som ikke ville blive detekteret ved at måle proteinkoncentrationen. Det forventes, at eksperimentelle fejl er reduceret ved blanding flere substrater i en gryde. Dette skyldes, at alle de forskellige substrater interagere med den samme mængde enzym under disse omstændigheder (ligning 4). Anvendelsen af et ekstraktionsmiddel tilsat en intern standard er vigtigt at tage højde for forskelle i udtræk og / eller GC-injektion.
Transition state teori er blevet anvendt med succes i Enzymology 26. Denne vigtige teoretiske ramme blev oprindeligt deudviklet til unimolekylær reaktioner i gasfase. Det har imidlertid vist sig, at enzymer virker primært ved at sænke den klassiske aktiveringsenergi barriere 26. Transmissionskoefficienten antages at være en heri kan påvirke den målte aktivering enthalpi og / eller entropi. Bidraget fra tunnelering, og andre ikke-klassiske effekter såsom recrossing af overgangen tilstand, kan groft bidrager 1000-fold til katalyse 26 svarende til ca. 4 kcal / mol med energi. Det kan ses, at aktiveringen entropi vises af vildtype-enzymet (16 kcal / mol ved 328 K, figur 2C) er meget større end sådanne ikke-klassiske virkninger forårsaget af en uensartet transmissionskoefficient. Virkningen af transmissionen koefficient bør falde, når man sammenligner termodynamiske parametre for aktivering for vildtype og tunnel varianter ved hjælp af protokollen.
Den Gibbs fri energi for aktivering (Δ G ‡) er komposed af både en enthalpic (Δ H ‡) og en entropisk (- T * Δ S ‡) sigt. Opløsningsmiddel reorganisering i enzymer under katalyse kan påvirke begge parametre. Forventes den nuværende protokol for at lette studiet af disse fænomener ved at samle en værktøjskasse med relevante og brugervenlige i silico beregningsværktøjer med den nødvendige biofysiske eksperimentelle rammer. Fremgangsmåden forudses at være nyttig til at undersøge et væld af enzymatiske processer, herunder katalyse af membranbundne enzymer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
| CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
| Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
| Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |
References
- Ball, P. Water as an active constituent in cell biology. Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).
- Snyder, P. W., et al. Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).
- Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization. Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).
- Persson, F., Halle, B. Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR. J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).
- Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).
- Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization. J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).
- Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38α MAP kinase inhibitors. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).
- Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).
- Matsuoka, S., et al. Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein. Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).
- Pavlova, M., et al. Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate. Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).
- Breiten, B., et al. Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).
- Oldfield, E., Lin, F. Y.
- Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
- Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. Protein activity regulation by conformational entropy. Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).
- Warshel, A. Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites. J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).
- Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).
- Duan, Y., et al. A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations. J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).
- Essmann, U., et al. A smooth particle mesh Ewald method. J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).
- Chovancova, E., et al. CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures. PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708 (2012).
- Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol. Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).
- Kürten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli. Protein Express. Purif. , (2015).
- Eyring, H., Stearn, A. E. The application of the theory of absolute reaction rates to proteins. Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein. , W.H. Freeman. (1999).
- Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. Structure and function of a squalene cyclase. Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations. Science. 303 (5655), 186-195 (2004).
