Introduction
Medicinsk forskning har gynnats oerhört från studien av både humana cellinjer och djurmodeller. Cellinjer möjliggöra en bättre kontroll av komponenter i ett system, såväl som användning av celler från den rätta organismen. Arbeta med mänskliga celler, medan mer representativ, presenterar en drastiskt förenklad bild av mekanismer som kan vara ansvariga för hälsa och sjukdom, eftersom cellinjer inte kan rekapitulera effekterna av andra celler, stromala komponenter, och organ som kan påverka svar 1. Å andra sidan, djurmodeller, men inte helt korrekt reproducera sjukdomar hos människan och genetisk heterogenitet, erbjuder ytterligare insikt genom att tillåta för inmatning av hela djursystem i de flesta modeller 2,3.
Brister åt sidan, båda metoderna har sina fördelar och kompletterar varandra. Dock fortfarande det huvudsakliga målet att studera mänskliga celler och organ, i hela kroppen, flera organsystem. Följaktligen har translationell forskning taksv stora framsteg i att underlätta studiet av mänskliga organ och vävnader extraherade från patienter, för att bättre förstå mekanismerna bakom sjukdomen. Translationell forskning ger fördelen att studera resultatet av behandlingar och sjukdomar i hela kroppen och i lämpliga celler, vilket ger det bästa av två världar mellan cell och djurarbete 4.
Translationell forskning är inte heller utan brister. Skördade prover från humanpatienter vid avlägsnande från värden, omedelbart utsattes för ischemi och andra yttre faktorer som de annars skulle skyddas. Detta kan resultera i stressinducerade molekylära och genetiska förändringar, och orsaka snedvridning i efterföljande studier. Därför har mycket arbete lagts ned på att utvinna och bearbeta vävnader genom strikta metoder för att bäst bevara organ och cell integritet för nedströms studier 5. Viktigt, måste framtida tillämpningar övervägas noga vid val av metoder of bearbetning av mänskliga prov, eftersom vissa metoder kan vara skadliga för cellkomponenter och signalvägar utan att skada andra.
För all forskning som involverar mänskliga vävnader, måste lagstiftningsfrågor tas upp. Efter Tuskegee och Belmont rapporter fanns en ökande acceptans av det faktum att biomedicinsk forskning var associerad med inneboende risker ofta resulterar i oundvikliga etiska dilemman 6. Behovet av nationella standarder erkändes och den federala regeringen skapade Institutional Review Boards (IRBS) som ett sätt att upprätthålla principerna i Belmont Report (Respekt för personer, godhet, Justice).
Alla institutioner IRB är en kommitté bestående av läkare, forskare och samhällsmedlemmar som är ansvariga för att skydda forskningsdeltagare. Det kräver att frivilligt samtycke erhållas från alla deltagare i biomedicinska forskningsstudier, och att detta samtycke skall dokumenteras på ett informerat samtycke fo rm. Informerat samtycke Processen syftar till att ge adekvat information till en deltagare, så att ett välgrundat beslut kan göras om huruvida att delta i en studie, eller att fortsätta att delta. I detta avseende måste informerat samtycke dokument har god läsbarhet och bör skrivas på ett språk som lätt kan förstås (6: e till 8: e klass läsnivå) av målgruppen. Möjligheten att tvång eller otillbörlig påverkan skall minimeras, och ämnet måste ges gott om tid att överväga deltagande. Deltagaren ska också ha rätt att utöva sin rätt att dra tillbaka sitt samtycke när som helst under loppet av studien utan påföljd. Frivilligt informerat samtycke är en obligatorisk förutsättning för en patient deltagande i forskning och det är också rättsligt bindande 7.
Enligt reglerna för skydd av människors utsätter 21 CFR 50,25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), måste studiedeltagare informeras om syftet med forskningen, förfarandet i samband forskning, alternativ till deltagande, alla förutsebara risker och obehag (inklusive inte bara fysisk skada, men också möjligt psykologiska, sociala eller ekonomisk skada, obehag eller besvär), nyttan av forskningen till samhället och möjligen för den enskilde, hur länge ämnet förväntas delta, kontaktperson för svar på frågor eller i händelse av en forskningsrelaterad skada eller nödsituation, uppgift om att deltagandet är frivilligt och att vägran att delta kommer inte att resultera i några konsekvenser eller förlust av förmåner som en kompromiss i reguljär klinisk vård att deltagaren annars rätt till som ett resultat av hans / hennes diagnoser, och slutligen ett uttalande om personens rätt till sekretess och rätt att dra sig urstudien när som helst utan några konsekvenser. Vävnadsprover från deltagare som tar ut samtycke under studiens gång bör inte bankas och måste omedelbart slut. Upphävande av ett eller flera element av informerat samtycke kan erhållas från IRB för vissa forskningsprojekt som inte kunde praktiken göras utan en ändring av de nödvändiga elementen eller studier där nödvändiga elementen inte är tillämpliga. Stor försiktighet måste vidtas för att säkerställa uppgifternas konfidentialitet. Health Insurance Bärbarhet och Accountability Act (HIPAA) är en federal lag som förhindrar att använda eller avslöja "skyddade hälsouppgifter" (PHI) utan skriftligt godkännande från deltagarna. PHI inkluderar men är inte begränsade till hälsoinformation sänds eller bibehållas i någon form eller medium och innehåller fält som kan användas för att identifiera en enskild 9.
Genom detta arbete vill vi beskriva det protokoll som måste följas under tissue bearbetning - inklusive upphandling, och lagring och betona vikten av att följa dessa strikta riktlinjer för att minimera de fördomar som kan leda till följd av de påfrestningar en vävnad utsätts för vid utvinning. Vi strävar också efter att ge en kort översikt över de efterföljande analyser eller analyser (Figur 1) som kan utföras på sådana exemplar så att läsarna kan göra en kvalificerad bedömning av vad analysen (s) bäst passar deras behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Detta protokoll har godkänts av University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Prov Anskaffning
- Samla forskningsvävnadsprover från överskotts tumör och tillhörande normal vävnad 10-12. Lagra prover på våt is för att undvika autolys.
- Skicka alla vävnader, medicintekniska produkter och främmande kroppar bort under ett kirurgiskt ingrepp för att avdelningen för patologi för nödvändig granskning för att underlätta en patologisk diagnos.
- Handtag vävnad avsatts för forskning i enlighet med gällande forskning och vävnadsbank politik och rutiner.
OBS: Biospecimen samling innebär samordning av patologer, patologer "assistenter, histotechnologists och specialister vävnads upphandling.
2. Patologi Quality Assurance (QA)
- Fylla i och kontrollera patientjournaler som en tidig QA åtgärd och konsultera en patolog att granska diagnostisk patienten register (patologirapporter, vävnads diabilder, etc.) och vävnadsprover. Domare vävnadsprover på morfologiska egenskaper av intresse såsom procent av tumör, nekros, vävnadstumör gränssnitt, etc. Detta är i enlighet med biorepository bästa praxis 10-12.
- Efter inledande granskning, genomföra regelbundna kontroller av biorepository uppgifter och forskningsprover under hela vistelsens längd på biospecimen.
- Länk resultat och kommentarer från histopatologiska och andra undersökningar till prover och ger dessa data till forskare genom en egenutvecklad biorepository programvarusystem.
OBS: QA processer säkerställa integriteten av både kliniska och tekniska aspekterna av biorepository verksamheten. - Utför genetiska och molekylära tester för att kontrollera och karakterisera prover för klinisk användning.
- Samla in och analysera data baserat på feedback från forskare som har använt prover för laboratorieexperiment. Spåraprover med streckkod teknik. Detta elektroniska system för spårning är också förespråkas i biorespository bästa praxis 10-12.
3. Prov / Tissue Processing
- Förvara alltid färska vävnadsprover på våt is, och förloppet så snabbt som möjligt, för att begränsa förändringar inducerade genom extraktion av vävnadsprov från sin naturliga miljö. Process normal tumör matchade och tumörvävnadsprover separat för att undvika korskontaminering.
OBS: Baserat på forskningsprotokoll, kan biospecimen bearbetning innebära insamling av proverna i en eller flera typer av media. - Innan processen, framställa en steril petriodlingsskål, en skalpell, samt en nål eller pincett för vävnadsbehandling. Se till att rören har upprättats, märkts, och lade ut för att begränsa tiden för provbearbetning (Figur 2).
- All relevant information vävnad, såsom patientens namn, nummer, behandling, datumkirurgi, och annan relevant information som kan vara lämpliga för studien, bör göras lättillgänglig i ett institutionellt databas vävnad. Begränsad patientinformation bör hållas i labbet på papper eller kalkylblad form.
OBS:. Endast samla biospecimen information som är relevant för den typ av forskning nämligen grundläggande biomedicinsk forskning, klinisk forskning, translationell forskning, etc. För sjukdomsspecifik information bör biorepository personalen samla in uppgifter som bedöms nödvändiga av aktuell litteratur och styrande organisationer säkerställa korrekt diagnos och meningsfull forskning. Detta inkluderar, men är inte begränsat till tumör betyg och cancer staging information. - Planera alla önskade efterföljande experiment i förväg, för att besluta om storleken på vävnadssnitt som krävs för varje typ av analys, liksom placeringen av excisions. Helst även omöjligt, bör alla analyser vara representativa för hela vävnadssektion i syfte att ta hänsyn till vävnads heterogeneity och begränsa partiskhet analyser nedströms. Lägg ut alla nödvändiga poster i förväg som visas i figur 2.
- Placera vävnadsprovet i öppna petriodlingsskål, platt mot ytan.
OBS: Tillåt enda auktoriserade biorepository personal för att hantera identifierade prover och att se över identifierade hälsodata. Utredarna ska få tillgång till endast de patientidentifikation som tillåts av de undertecknade informerade medgivanden och som regleras av IRB. Alla prover skall vara väl märkta och bör åtminstone ett unikt identifikationsvävnadsnummer och vävnadstyp. Ta inte med någon PHI i etiketterna, i enlighet med HIPAA föreskrifter. - Inspektera provet från alla vinklar, för att få en bättre förståelse av dess struktur och dimensioner. Pin provet till botten av skålen med nålen, och fortsätt till tudelar vävnaden längs dess största och mest representativa axel.
- Klipp ut en liten bit vävnad och placera den i en steril 1,5 ml microcentrifuge rör innehållande 1 ml av RNA-stabiliserande lösning. Detta prov kan placeras på is under återstoden av processen och lagrades vid 4 ° C tills de behövdes.
OBS: När du arbetar med RNA, handskar ska alltid användas, och RNas-fria filterspetsar bör användas för att begränsa risken för nedbrytning och föroreningar RNA. - Lägg ut en öppen och pre-märkt biopsi kassett i locket av petriodlingsskålen. Skär ut ett segment av vävnad inte tjockare än 3 till 5 mm och överföra den till kassetten. Placera kassetten i 10% neutral buffrad formalin (NBF) under ett minimum av 72 timmar. Överför kassetten i 70% etanol under långtidslagring innan paraffin-inbäddning.
OBS: Märkning av kassetter bör utföras i penna eller med rekommenderade markörer såsom användning av xylen under bearbetningen kommer annars radera etiketter. - Klipp ut en bit vävnad och placera den i en vävnad mögel. Täck avsnittet vävnader i optimal skärtemperatur (oktober) förening, och frysa den omedelbartvid -20 ° C under cryosectioning. Denna vävnadssnitt kan förvaras vid -20 ° C tills redo för cryosectioning.
- Klipp ut ett eller flera stycken av vävnad och överföra dem till en 50 ml rör innehållande MACS-buffert (1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 0,5% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA)) för efterföljande flödescytometrianalys . För flödescytometri kan större prov vara att föredra som celler kan gå förlorade under tumörtagande, cellfixering och permeabilization vid behov. I allmänhet kan detta avsnitt tas i slutet, har en gång alla andra delar behandlats. Överblivna representativt tumörprov kan användas för flödescytometri. Eventuellt kan detta rör lagras vid 4 ° CO / N eller användes för flödescytometrisk färgning omedelbart efter digerering in i en cellsuspension (se Steg 4 - Flödescytometriska Färgning).
- Skär resten av vävnad i bitar inte större än en maximal storlek på 0,5 mm x 0,5 mm och överföra dem till kryogeniskaflaskor för omedelbar frysning i flytande kväve. Dessa snäppfrysta prover kan användas för framtida analyser och samarbets ändamål.
OBS: Extra försiktighet bör iakttas när man arbetar med flytande kväve som direktkontakt kan orsaka svåra skador. Ögon bör skyddas med skyddsglasögon med sidoskydd eller med ett ansiktsskydd. Kryogeniska handskar bör också användas för att skydda från flytande kväve brännskador orsakade av stänk och direktkontakt. Handskar bör passa ordentligt men vara lös nog att tas bort snabbt bör flytande kväve stänk i dem.
4. Flödescytometriska färgning
- Vävnads Homogenisering
- Förbered digere mediet med DMEM (40 ml), DNas I (50 U / ml) och kollagenas I (2 mg / ml). Placera färsk eller O / N-lagrad tumör i MACS-buffert i locket av en petriskål, och dränka med matsmältningen medium.
OBS:. Olika uppslutnings metoder finns, alla med fördelar (dvs. cellytproteinet expres, livskraft). Se till att du har rätt metod för din önskade tillämpningen nedströms. - Stift tumören till botten av skålen med en nål, och snitt från utsidan till centrum med en skalpell, tills tumören har en pastaliknande konsistens. Överför tumör blandningen till en 50 ml rör, tätning och lägg i en plastpåse för att undvika läckage. Överföringsröret till en inkubator, och roterar med 225 varv per minut, 37 ° C, 1 timme.
- Filter tumörcellsuspension genom en 70μm cell sil. Centrifugera cellsuspensionen vid 250 xg, 4 ° C, 5 min. Resuspendera cellpelleten i 1 ml FACS buffert (500 ml PBS, 1 ml 0,5 M lager EDTA, 10 ml FCS eller FBS).
- Räkna celler med användning av en hemocytometer och återsuspendera i en koncentration av 1x10 7 celler / ml. Överför 100 | il per brunn (10 6 celler) i en 96 väl rund bottenplatta för färgning.
- Förbered digere mediet med DMEM (40 ml), DNas I (50 U / ml) och kollagenas I (2 mg / ml). Placera färsk eller O / N-lagrad tumör i MACS-buffert i locket av en petriskål, och dränka med matsmältningen medium.
- Livskraft och Antikropp färgning
- Tillsätt 200 pl av lönsamheten fläcken lösning till varje brunn och blanda. IncuBate under 30 minuter, vid 4 ° C, i mörker. Centrifugera ner cellerna vid 250 xg, 4 ° C, 5 minuter, och aspirera supernatanten.
- Lägg antikroppsblandningen vid rekommenderade / titreras koncentration (enligt tillverkaren) för ytantigener i 200 pl FACS buffert. Inkubera cellerna vid 4 ° C, 30 minuter i mörker. Centrifugera ner cellerna vid 250 xg, 4 ° C, 5 minuter, och aspirera supernatanten.
- Tvätta med 200 | il FACS-buffert, spinn ner cellerna vid 250 xg, 4 ° C, 5 minuter, och aspirera supernatanten. Resuspendera cellerna i 200 pl FACS-buffert och fortsätt till flödescytometer för insamling och analys.
OBS: Om du utför intracellulär flödescytometri färgning, utföra fixering och permeabilization steg och intracellulär färgning mellan stegen 4.2.2 och 4.2.3. Om du utför cytokin färgning, bör cellerna vara föraktiverad föregående färgning som rekommenderas, och en hämmare av intracellulär proteintransport och utsöndring, såsom monensin ska användas under aktivering tillgarantera bibehållandet av lösliga faktorer. Fixerade celler kan lagras på kort sikt (en vecka) vid 4 ° C i mörker före förvärvet på en flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten visas nedan visar flödescytometri grindstrategi för brett immun fenotypning på en bearbetad melanomtumör. Dagen för färgning ades vävnadsprov digere och homogeniserades med kollagenas I och DNas I-inkubering under 60 min vid 37 ° C under 225 varv per minut rotation. Efter digestion ades cellsuspensionen filtrerades genom en 70 ìm cell sil för att eliminera skräp och celler färgades med fluorescensmärkt flödescytometri antikroppar för immunceller fenotypning. Nedan (figur 3) är grindstrategi och färgning för flera markörer på vävnad lagrad O / N vid 4 ° C i MACS-buffert. Såsom visas prover som behandlats såsom beskrivits och lagras O / N i MACS-buffert vid 4 ° C visar mycket begränsad dödlighet. Dessutom visar denna siffra att behandlingen vävnad som beskrivits ovan tillåter flerfärgade breda fenotypning av immuncellundergrupper i melanomtumörer.
s / ftp_upload / 53.189 / 53189fig1.jpg "/>
Figur 1. Analyser som kan utföras från blod- och vävnadsprover mänskliga. Översikt över analyser som kan utföras efter bearbetning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Poster som krävs för riktig vävnadsbehandling och lagring. Exempel på inställning för vävnadsbehandling. Vävnad kan dissekeras i petriodlingsskålen (A) med nålen och skalpell. Representativa vävnadsbitar ska sedan överföras till biopsi kassetten (B), som sedan skall överföras till ett NBF behållare (C) för tre dagars fixering vid RT. En annan bit vävnad bör placeras i en cryomold (D) och täckt av oktober lösning före bEing frystes vid -20 ° C. En stor bit av vävnad bör överföras till ett 50 ml rör (E) för flödescytometri färgning och kan lagras vid 4 ° C i MACS-buffert O / N. En liten bit vävnad bör överföras till ett 1,5 ml rör med RNA-stabiliserande lösning (F) och lagrades vid 4 ° C tills RNA-extraktion. Slutligen bör överblivna vävnad skäras i bitar och överfördes till kryorör (G) för snäpp frysning i flytande kväve och långtidsförvaring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Flödescytometrisk grindstrategi för brett immun fenotypning. Exempel på bred immun fenotypning grindstrategi genom flödescytometri på melanomtumör lagrad O / N vid 4 °;. C i MACS-buffert 13 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I slutändan måste de metoder för behandling att dikteras av den önskade hypotes och förväntade tekniska analyser som ska utföras (Figur 1). Följande avsnitt tjänar som en översikt för att beskriva potentiella analyser som kan utföras på sådana vävnadssektioner. Det är på intet sätt en uttömmande översikt, men är avsedd att hjälpa guide provbearbetningsmetoder och val av analyser nedströms genom att beskriva tekniker och notering deras styrkor och svagheter.
Flödescytometri färgning kan utföras på färska dissekerade vävnadssnitt, eller fragment lagrade O / N i MACS-buffert vid 4 ° C. Flödescytometri underlättar högspecifik fenotypning och analys av cellpopulationer extraherade från vävnadsprover, och tillåter färgning av upp till 17 cellytmarkörer och intracellulära proteiner, cytokiner och proteaser i en enda cell. Vidare är vissa cytometrar tillåter enda cell förstoring, för att bestämma localizatjon av proteiner i cellen i stället för enbart positivitet och intensitet signaler. Slutligen massa metri möjliggör kvantifiering av mer än 35 proteiner i samma prov, med nackdelen är att celler skall lyseras och kan därför inte vara längre odlas, sorterade, eller analyseras i sin helhet 14. Denna teknik tillåter analys av många markörer och proteiner samt detaljundersökning på en enda cell nivå. Men flöde kräver cytometry vävnads homogenisering och förlust av vävnad arkitektur och måste utföras på färsk vävnad för att minimera förändringar i cellfenotypen. Viktigt är försenade lagring av vävnad avsedd för flödescytometri kan påverka cellinnehåll, som vissa cellgrupper kan vara mer sårbara för ischemi. Fosfoproteiner kan också vara dåligt detekteras genom flödescytometri om bearbetnings kinetik är suboptimal 15.
Formalinfixering och paraffin-inbäddning (FFPE) av vävnadssnitt kan vara det bästa valet när det gällerosäkerhet om framtida analyser, eftersom det ger hög flexibilitet i de typer av analyser som kan utföras. Traditionellt FFPE sektioner sektion på en mikrotom i 5 pm sektioner för immunohistokemi (IHC) eller immunofluorescens (IF) färgning. Men FFPE vävnader väl bevarade, och kan därför användas för flera ändamål. I själva verket, skärning tjockare sektioner från FFPE block tillåter både DNA- och RNA-extraktion med kommersiellt tillgängliga kit, samt omvänd-fas-protein array (RPPA) -analys 16-18. Följaktligen kan bearbetning vävnadsprover till FFPE erbjuder fördelen med ökad flexibilitet, liksom fördelen att upprätthålla vävnadsstruktur för immunfärgning och därför tillhandahålla en mer exakt in vivo -liknande skildring av vävnadsstrukturer och cellpopulationer. FFPE möjliggör vävnadssektioner som skall bevaras under långa tidsperioder. Denna teknik har dock vissa nackdelar. Tunna sektioner som används för FFPE dointe redogöra för vävnads heterogenitet från sekventiella nedskärningar och vävnadssnitt börjar att oxidera en gång utsätts för omgivande luft och därigenom försämra RNA och DNA-kvaliteten. Slutligen, på grund av tvärbindning, co-färgning av flera proteiner genom IHC på FFPE sektioner kräver optimering.
När mikroskopi genom IHC eller IF är önskvärd, föredrages användning av en OCT-förening. Oktober-lagrade sektioner måste skäras med en cryotome innan de släpps ut på objektglas och används för IHC och IF. Oktober bevarar antigeniciteten och minimerar bakgrund som gör det den optimala tekniken för mikroskopi. Oktober kan också omedelbart fryses och skärning jämfört med FFPE som kräver flera dagar i NBF. Trots dessa fördelar, är oktober i allmänhet mindre stabil och mindre flexibel än FFPE eftersom endast IHC och IF kan utföras från oktober-inbäddade vävnadssnitt.
När det gäller RNA-analys, prov lagrades vid 4 ° C i RNA-stabiliserande lösning hårdna med tiden, vilket gör att bättre RNA-extraction genom kommersiellt tillgängliga extraktionsmetoder kit och TRIzol, bland andra. RNA-extraktion tillåter nedströms analyser såsom omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) för att kvantifiera uttrycket av transkriberade gener, RNA-sekvensanalys, och bred spektrumanalys av modulerade gener genom microarray, eller nanoString analys. Följaktligen kan RNA isolering från vävnader vara extremt hög avkastning, genom att tillhandahålla omfattande information om genuttryck och vägar som drabbats av behandlingar och sjukdomar. Viktigt är dock RNA uttryck kan variera kraftigt baserat på vävnadsstruktur och provtagning storlek bör så extra försiktighet iakttas för att undvika belastningsanalyser på grund av provtagningsplats. Vidare föreslår den typ av RNA som dynamiska förändringar i uttrycksnivåer kan förekomma, så extra försiktighet bör också vidtas för att säkerställa korrekt kinetik följs för att studera gener och vägar av intresse 19,20; bearbetning bör begränsas efter extraktion från RNA stabiliserande sÖSNING att garantera stabilitet. Följaktligen är lagring av komplementärt DNA (cDNA) av ökad stabilitet föredraget att RNA (om i linje med nedströms analys) 21. Slutligen, eftersom RNA kan ofta förstärkas i analyser i senare led, kan minut fraktioner av förorenande celler resultera i stora fördomar i erhållna resultat.
DNA-analys kan utföras på det tidigare snap frysta vävnadsprov, eller på FFPE vävnadssnitt. Dessa metoder tillåter efterföljande hela exome eller hela genomet sekvensering, två tekniker som har visat oerhörd löfte genom identifiering av mutationer och polymorfismer kopplade till patientens svar och prognos i flera sammanhang sjukdoms. DNA-extraktion kan vidare möjliggöra identifiering av T-cell och B-cellreceptor (TCR och BCR) sekvenser förekommer i prover, i syfte att skaffa sig kunskaper som hänför sig till antigener och immunsvar i terapi och sjukdoms 20,21. Jämfört med RNA, är DNA mycket stabil gång extraheras, mendet tar hänsyn till transkriptions- och translationell reglering av gener samt posttranslationella modifieringar och reglering 22.
Protein kan extraheras direkt från snabbfrystes vävnadssektioner, eller från FFPE prover för att utföra Western blot-analyser, sam-immunoutfällning för att identifiera protein-interaktioner och nätverk, samt RPPA, en hög avkastning tekniken tillåter relativ kvantifiering av hundratals proteiner i ett enda prov 23. Emellertid medger denna teknik identifiering av kända proteiner endast genom dess krav på specifika antikroppar. Viktigt är vidare posttranslationell modifiering analys, såsom proteinfosforylering, kräver snabb bearbetning av vävnad på grund av instabilitet 15.
Snap-frysning av proverna är enkel och kräver begränsade resurser. Det tillåter också långsiktig lagring av prover vid analyser nedströms ännu inte har definierats, utom när detVid flödescytometri som måste utföras på färska prover. Snap-frysta prover kan också enkelt delas för samarbets ändamål.
Ytterst är den mängd data som kan extraheras från en enda bit vävnad oändliga. Det finns ingen universell rätt svar på vilka analyser ska utföras i en viss studie. Varje utredare måste därför se till att han / hon tar hänsyn till alla hypoteser, önskade experiment samt tillgängliga resurser innan rekrytera patienter och bearbeta vävnad, eftersom detta dramatiskt kan påverka utformningen av studierna och de svar som erhålls.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av filantropiska bidrag från John G. och Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0727033) och Melanoma Research Alliance. Författarna vill tacka University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank (ITB) för att samordna vävnadsdistribution och insamling och underlätta överbryggande forskning, liksom Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, MD Anderson Cancer Center Institutionen för patologi och melanom månen Shot Program. Slutligen, författarna vill erkänna alla patienter och familjer som drabbats av melanom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al.
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M. The ethics of social research. Researching social life. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. IRB guidebook. , US Government Printing Office. (1993).
- Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25 (2011).
- HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm (2003).
- MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).
- Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from: http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf (2011).
- NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from: http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf (2011).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G.
