Introduction
Tıbbi araştırma, insan hücre hatları ve hayvan modellerinde hem çalışma son derece yararlanmıştır. Hücre çizgileri iyi bir sistem elemanlarının kontrolü, hem de uygun organizmadan hücrelerin kullanımı için izin verir. Hücre hatları yanıtları 1 etkileyebilecek diğer hücrelerin, stromal bileşenleri ve organların etkisini özetlemek değil, çünkü daha fazla temsilcisi olurken, sağlık ve hastalık sorumlu olabilir mekanizmalarının büyük ölçüde basitleştirilmiş anlık sunar, insan hücreleri ile çalışma. Öte yandan, hayvan modelleri, insan hastalığını ve genetik heterojenite üreyen tamamen doğru olmasa da, çoğu modelde 2,3 bütün hayvan sistemlerinin giriş için izin vererek daha fazla fikir sunar.
Eksiklikleri bir yana, her iki yöntemin de yararları var ve tamamlayıcı niteliktedir. Ancak, ana hedefi bir tam vücut, çoklu organ sisteminde insan hücreleri ve organları, çalışma devam etmektedir. Bu duruma göre, geleneksel araştırma tak sahipDaha iyi mekanizmaları altta yatan hastalığın kavramak için, insan organları ve hastaların çıkarılan dokuların çalışma kolaylaştırmada büyük adımlar tr. Translational araştırma ve böylece, tüm vücutta ve uygun hücrelerde tedavileri ve hastalıkların sonuçlarını okuyan hücre ve hayvan çalışmaları 4 arasında iki dünyanın en iyi sağlama avantajı sunuyor.
Translational araştırma kusurları olmadan da değil. Insan hastalardan hasat edilen örnekler, ana bilgisayardan uzaklaştırılması üzerine hemen iskemi ve başka bir şekilde korunacak olan, diğer dış faktörlerle tabi tutulur. Bu stres kaynaklı moleküler ve genetik değişikliklere neden olur ve daha sonraki çalışmalarda önyargı neden olabilir. Bu nedenle, çok çaba en aşağı çalışmalar için 5 organ ve hücre bütünlüğünü korumak için sıkı yöntemlerle dokuların çıkarılması ve işlenmesi girmiştir. Yöntemleri o seçerken önemlisi, gelecekteki uygulamalar yakından ele alınmalıdırf belli yöntemler hücresel bileşenleri için zararlı olabileceğinden, insan örnekleri işleme ve diğerleri tutumlu sırasında sinyal yolları.
İnsan dokuları içeren herhangi araştırma, düzenleyici konular ele alınmalıdır. Tuskegee ve Belmont raporlar sonrasında, biyomedikal araştırma doğasında riskler genellikle kaçınılmaz etik ikilemler 6 sonuçlanan ile ilişkili olduğu gerçeğini büyüyen bir kabul vardı. Ulusal standartlara ihtiyaç tanındı ve federal hükümet Belmont Raporu ilkelerine uyulması (kişiler, Yararlılık, Adalet için saygı) için bir araç olarak Kurumsal Gözden Kurulları (IRBs) oluşturuldu.
Herhangi bir kurumun IRB araştırma katılımcılarının korumakla yükümlüdür doktorlar, araştırmacılar ve topluluk üyeleri bir kuruldur. Gönüllü rıza biyomedikal araştırma çalışmalarının tüm katılımcıların elde gerektirir ve bu rıza bir aydınlatılmış onam fo belgelenmiş olması rm. Bilgilendirilmiş onam süreci bilinçli bir karar çalışmaya kayıt veya katılım devam edip etmemeye yapılabilir böylece, bir katılımcının yeterli bilgi vermeyi amaçlamaktadır. Bu bağlamda, bilgilendirilmiş onam belge iyi okunabilirliği olmalı ve kolayca hedef nüfusun (6 th 8 inci sınıf okuma seviyesi) anlayabileceği dilde yazılmış olmalıdır. Baskı veya uygunsuz etkiden olasılığı minimize edilmelidir, ve konu katılımını dikkate için yeterli zaman verilmelidir. Katılımcı da ceza olmadan çalışmanın seyri sırasında herhangi bir aşamada onayı geri alma hakkını kullanmasına izin verilmelidir. Gönüllü bilgilendirilmiş onam araştırma gönüllünün katılımı için zorunlu ön koşulu ve aynı zamanda 7 hukuken etkilidir.
Insan korunması için yönetmelik gereğince konular 21 CFR 50,25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), çalışmaya katılanların araştırma amacı haberdar edilmelidir, araştırmaya katılan prosedürleri, katılım alternatifleri, topluma ve muhtemelen tek araştırma tüm öngörülebilir riskler ve rahatsızlıkları (sadece fiziksel yaralanma, aynı zamanda mümkün psikolojik, sosyal ya da ekonomik zarar, rahatsızlık ya da rahatsızlık dahil), faydaları, konu katılması bekleniyor zamanın uzunluğu, kişi katılım gönüllü olduğunu belirten açıklamada, soruların ya da araştırma ile ilgili yaralanma ya da acil durumlarda cevaplar için iletişim ve katılmak için bu reddin, düzenli klinik bakım bir uzlaşma olarak herhangi bir sonuç veya faydalar herhangi kaybına neden olmaz katılımcı aksi hakkı olduğunu gizlilik ve çekilme hakkına kişinin hakkına ilişkin nihayet bir açıklama onun / onu tanı sonucu almak veherhangi sonuçları olmadan herhangi bir zamanda çalışma. Çalışmanın süresince onayı geri katılımcılardan doku örnekleri banked edilmemelidir ve hemen tükenmiş olması gerekir. Aydınlatılmış onam bir ya da daha fazla eleman feragat pratik gerekli unsurlara veya gerekli unsurlar uygulanabilir olmadığında çalışmalar için bir değişiklik olmadan yapılamaz olabilir bazı araştırma projeleri için IRB elde edilebilir. Büyük bir dikkatle veri gizliliğini sağlamak için alınmalıdır. Sağlık Sigortası Taşınabilirlik ve Sorumluluk Yasası (HIPAA) kullanarak veya katılımcıların yazılı izni olmadan "Korumalı Sağlık Bilgileri" (PHI) ifşa engelleyen bir federal yasa olduğunu. PHI içerir, ancak sağlık bilgileri iletilen veya muhafaza herhangi bir biçimde ya da orta ve bireysel 9 tanımlamak için kullanılabilir alanları içerir ile sınırlı değildir.
Bu çalışma sayesinde, biz Tissu'nun sırasında uyulması gereken protokol anahat hedefliyoruze işleme - tedarik dahil, depolama ve doku çıkarma üzerine maruz streslere bağlı olarak meydana gelebilir önyargıları en aza indirecek şekilde bu katı yönergeleri izleyerek önemini vurgulamaktadır. Okuyucular Ne tahlil (ler) en iyi onların ihtiyaçlarına uygun nitelikli bir yargıya böylece biz de aşağı tahlillerde ya da bu tür örnekler üzerinde yapılabilecek analizler (Şekil 1) kısa bir özetini sunmak için gayret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik bildirimi: Bu protokol Texas MD Anderson Kanser Merkezinde Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Numune Alımı
- Artı tümör ve ilgili normal dokudan 10-12 araştırma doku örneklerini toplayın. Islak buz üzerinde saklayın örnekleri otolitik önlemek için.
- Patolojik tanı kolaylaştırmak amacıyla tüm dokuları, tıbbi cihazlar ve gerekli inceleme için Patoloji Anabilim bir cerrahi prosedür sırasında çıkarılan yabancı cisimlerin gönder.
- Uygulanabilir araştırma ve doku bankacılığı politikaları ve prosedürlerine uygun olarak araştırma için ayrılan doku anlaştım.
NOT: Biospecimen toplama patologlar koordinasyonunu gerektirir, patologlar 'yardımcıları, histotechnologists ve doku alım uzmanları.
2. Patoloji Kalite Güvencesi (QA)
- Tamamlayın ve erken QA önlem olarak hasta kayıtlarını doğrulamak ve teşhis pa gözden geçirmek için bir patolog danışmaktient kayıtları (patoloji raporları, doku slaytlar, vb) ve doku örnekleri. Böyle Bu biorepository en iyi uygulamalar 10-12 uyarınca vs tümör yüzdesi, nekroz, doku tümör arayüzü, gibi ilgi morfolojik özelliklerine Yargıç doku örnekleri.
- İlk inceleme sonrasında, biospecimen kalış tüm uzunluğu boyunca biorepository verileri ve araştırma örneklerinin periyodik gözden yürütürler.
- Numunelere histopatolojik ve diğer incelemelerden Bağlantı sonuçları ve açıklamalar ve özel bir biorepository yazılım sistemi aracılığıyla araştırmacılara bu veri sağlar.
NOT: QA süreçleri biorepository operasyonların klinik ve teknik yönlerini hem de bütünlüğünü sağlamak. - Doğrulamak ve klinik kullanım için numune karakterize genetik ve moleküler testleri gerçekleştirin.
- Toplayın ve laboratuar deneyleri için örnekler kullanıyorum araştırmacıların görüşlerine dayalı verileri analiz. ParçaBarkod teknolojisi kullanılarak örnekler. Bu elektronik izleme sistemi de biorespository en iyi uygulamalar 10-12 yılında savunulmaktadır.
3. Örnek / Doku İşleme
- Daima kendi doğal ortamından doku örneğinin çıkarılması tarafından uyarılan değişiklikleri sınırlamak amacıyla, mümkün olduğunca çabuk taze doku ıslak buz üzerinde örneklerin ve süreç saklayın. Süreç, normal tümör eşleşti ve tümör dokusu örnekleri ayrı ayrı çapraz bulaşmayı önlemek için.
Not: Araştırma iletişim kurallarına göre, biospecimen işleme ortamının bir veya daha fazla tipte örneklerin toplanması içerebilir. - Işlemine başlamadan önce, steril Petri kültür çanak, bir neşter gibi doku işleme için bir iğne veya forseps hazırlamak. Borular, hazırlanan etiketli ve örnek işleme (Şekil 2) süresini sınırlamak amacıyla düzenlendiği emin olun.
- Böyle hasta adı, numarası, tedavi, tarihi olarak tüm ilgili doku bilgileri,cerrahi, ve çalışma için uygun olabilecek diğer ilgili bilgileri, kurumsal bir doku veritabanında kolayca erişilebilir hale getirilmelidir. Sınırlı hasta bilgileri kağıt veya elektronik tablo şeklinde laboratuvarda yapılmalıdır.
NOT:. Sadece araştırma viz doğası ile ilgili biospecimen bilgi toplamak, hastalığa özgü bilgiler için vb temel biyomedikal araştırmalar, klinik araştırmalar, translasyonel araştırma, biorepository personel için literatürde gerekli gördüğü bilgi ve yöneten organizasyonlar toplamak gerekir doğru tanı ve anlamlı araştırma sağlamak. Bu içerir, ancak tümör notları ve kanser evreleme bilgilerle sınırlı değildir. - Analiz, her tür, hem de oluk bezeme konumu için gerekli olan doku bölümleri büyüklüğüne karar verirse, tüm istenen sonraki deneyler planı. Imkansız olmasına rağmen İdeal olarak, tüm analizler doku heterogenei hesaba katmak amacıyla, tüm doku bölümünde temsilcisi olmalıdırty ve alt analizlerin sınırı önyargı. Şekil 2'de gösterildiği gibi önceden gerekli tüm öğeleri yatırın.
- Yüzeyine düz açık Petri kültür çanak doku örneği, yerleştirin.
NOT: Sadece belirlenen örneklerin ele ve belirlenen sağlık verilerini yorumlayan biorepository personel yetkili izin ver. Müfettişler IRB tarafından düzenlenen imzalanan bilgilendirilmiş onayı ile izin verilen ve sadece bu hasta tanımlayıcılar erişebilirsiniz gerekir. Tüm örnekler yeterince etiketli olmalı ve en az bir benzersiz doku kimlik numarası ve doku tipi de içermelidir. HIPAA düzenlemelerine uygun olarak, etiketler herhangi bir PHI içermez. - Yapısı ve boyutları daha iyi anlamak için, tüm açılardan örneği inceleyin. Iğne ile çanak alt numuneyi Pin ve onun en büyük ve en iyi temsil eden eksen boyunca doku iki eşit parçaya böler geçin.
- Doku küçük bir parça kesip ve steril bir 1.5 ml MICR yerleştirinRNA-stabilize edici çözeltinin 1ml içeren ocentrifuge tüpü. Bu örnek, işlemin geri kalan kısmı için buz üzerine yerleştirilmiş ve gerekli olana kadar, 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
NOT: RNA ile çalışırken, eldiven daima giyilmelidir ve RNAse ücretsiz filtre ipuçları bozulması ve RNA kirlenme ihtimalini sınırlamak için kullanılmalıdır. - Petri kültür çanak kapağı açık ve önceden etiketlenmiş biyopsi kasetini yatıyordu. 5 mm 3'ten hiçbir kalın bir doku dilim kesip kaset aktarmak. 72 saat en az% 10 kaseti nötr tamponlu formalin (NBF) koyun. Parafin katıştırma önce uzun süreli depolama için% 70 etanol içinde kaset aktarın.
Not: kasetlerin Etiketleme kalem ya da başka etiket silecektir işleme sırasında ksilen kullanımı önerilen belirteçler ile yapılmalıdır. - Doku parçası kesip bir doku kalıp yerleştirin. Optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşik doku bölümünü kapsayacak ve hemen dondurmakcryosectioning -20 ° C 'de. Bu doku kesiti cryosectioning için hazır olana kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Bir kesip veya dokuya birçok parçalar ve MACS tamponu ihtiva eden 50 ml'lik bir tüp (1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS),% 0.5 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA)) sitometri analizi daha sonra akış aktarmak . Flow sitometri için gerektiğinde hücreler tümör disassociation, hücre fiksasyon ve permeabilization sırasında kaybolmuş olabilir gibi büyük numuneler tercih edilebilir. Genel olarak, bu bölüm sonunda alınabilir, bir kez tüm diğer parçaları işlenmiştir. Kalan temsili tümör örneği akış sitometrisi için kullanılabilmektedir. İsteğe bağlı olarak, bu tüp, 4 ° C'de saklandı CO / H ya da bir hücre süspansiyonu (Adım: 4 - Akım Sitometrisi boyanması) içerisine akış sitometrik boyama hemen sonra sindirim için de kullanılabilir.
- 0,5 mm x 0,5 mm maksimum boyutundan daha büyük parçalar hiçbir içine doku geri kalanını kesin ve Kriogen aktarabilirsinizSıvı azot içinde hızlı dondurulması şişeler. Gelecek analizleri ve işbirlikçi amaçlı bu çırpıda dondurulmuş numuneler kullanılabilir.
NOT: Doğrudan temas ciddi yaralanmalara yol açabilir gibi sıvı azot ile çalışırken ekstra dikkatli olunmalıdır. Gözler Yan siperleri olan veya yüz kalkanı ile koruyucu gözlüklerle korunmalıdır. Dondurucu eldiven de sıçramasına ve doğrudan temas sonucu sıvı azot yanıklardan korumak için giyilmelidir. Eldivenler düzgün uygun ama bunların içine hızla gerektiği sıvı azot sıçrama kaldırılacak kadar gevşek olmalıdır.
4. Akış Sitometrik Boyama
- Doku Homojenizasyon
- DMEM (40 mi), DNase I (50 U / ml) ve kollajenaz l (2 mg / ml) ile sindirim orta hazırlayın. Petri kabı kapağı MACS tamponu taze veya O / N-depolanan tümör yerleştirin ve sindirim ortamı ile daldırın.
NOT:. Farklı sindirim yöntemleri, mevcut avantajları ile her (yani, hücre yüzey proteini expression, canlılığı). İstediğiniz alt uygulama için uygun bir yöntem olduğundan emin olun. - Tümör macun benzeri bir dokuya sahiptir kadar dışarıdan bir iğne ile çanak alt ve kesim Pin tümörü, bir neşter ile merkezi. Sızıntıları önlemek için bir plastik torba içinde bir 50 ml tüp, mühür ve yere tümör karışımı aktarın. Bir kuluçka tüp aktarın ve 225 rpm, 37 ° C, 1 saat sonra döner.
- Bir 70μm hücre süzgecinden tümör hücre süspansiyonu Filtre. 250 xg, 4 ° C'de, 5 dakika santrifüjleyin hücre süspansiyonu. 1 ml FACS tamponu (500 ml PBS, 1 mi 0,5 M stok EDTA, 10 mi FCS ya FBS) yeniden süspanse hücre topağı.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve 1x10 7 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda yeniden askıya. Aktarım boyama için bir 96 yuvalı yuvarlak tabanlı plaka içinde çukur başına 100 ul (10 6 hücre).
- DMEM (40 mi), DNase I (50 U / ml) ve kollajenaz l (2 mg / ml) ile sindirim orta hazırlayın. Petri kabı kapağı MACS tamponu taze veya O / N-depolanan tümör yerleştirin ve sindirim ortamı ile daldırın.
- Canlılık ve Antikor Boyama
- Her bir canlılık leke çözeltisi 200 ul de ilave et ve karıştır. IncuKaranlıkta 4 ° C'da 30 dakika, için kesmek. 250 xg, 4 ° C'de 5 dakika ve aspire süpernatant hücreleri aşağı doğru döndürün.
- FACS tampon 200 ul yüzey antijenleri için (üretici göre) tarafından önerilen / titre konsantrasyonda antikor karışımı ekleyin. Karanlıkta 4 ° C'de, 30 dakika hücreleri inkübe edin. 250 xg, 4 ° C'de 5 dakika ve aspire süpernatant hücreleri aşağı doğru döndürün.
- , FACS tampon 200 ul ile yıkayınız 250 xg, 4 ° C'de 5 dakika ve aspire süpernatant hücreleri aşağı doğru döndürün. FACS tampon 200 ul hücre yeniden süspanse edin ve alımı ve analizi için akış sitometresi geçin.
NOT: Hücre içi akış sitometri boyama gerçekleştirmek durumunda adımlarla 4.2.2 ile 4.2.3 arasında tespit ve permeabilization adımları ve hücre içi boyama gerçekleştirin. Sitokin boyama gerçekleştirmek için, hücreler, tavsiye edildiği gibi ön-aktifleştirilmiş önceki boyama olmalıdır, ve bu da monensin hücre içi protein taşıma ve salgılama inhibitörü aktivasyon sırasında kullanılan gerekençözünür faktörlerin tutulmasını sağlamak. Sabit hücreler bir akış sitometresi üzerinde koyu önce ediniminde 4 ° C'de kısa vadeli (bir hafta) saklanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşağıda gösterilen sonuçlar işlenmiş bir melanom tümör üzerinde geniş bir immün fenotipleme için akış sitometri yolluk stratejisini betimliyor. Boyama gün, doku numunesi 225 RPM dönme altında, 37 ° C'de, sindirilmiş ve kolajenaz I ve 60 dakika boyunca kuluçkalama DNase I ile homojenize edildi. Sindirme işlemini takiben, bir hücre süspansiyonu artıkları yok etmek için 70 mikron hücre süzgecinden süzüldü ve hücreler, immün hücre fenotipleme antikorlar sitometri floresan etiketli akışı ile boyandı. MACS tamponu içinde 4 ° C de, doku depolanmış O / N birden fazla marker için yolluk stratejisi ve boyama (Şekil 3) altında gösterilmiştir. Gösterildiği gibi, 4 ° C 'de MACS tamponu tarif depolanmıştır O / N gibi işlenmiştir örnekler, son derece sınırlı mortalite göstermektedir. Bundan başka, bu rakam yukarıda tarif edildiği gibi olduğu işlem doku melanoma tümörlerinin immün hücre alt çok renkli geniş bir fenotipleme sağlar göstermektedir.
s / ftp_upload / 53189 / 53189fig1.jpg "/>
Şekil insan kan ve doku örnekleri yapılabilir 1. Analizler. Aşağıdaki işlem yapılabilir deneyleri bakış. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Uygun doku işleme ve depolama. Doku işleme kurulum Örnek için gerekli 2. Öğeler Şekil. Doku iğne ve neşter ile Petri kültür kaplarına (A) parçalara olabilir. Doku Temsilcisi parçaları daha sonra oda sıcaklığında üç gün sabitleme için NBF konteyner (C) transfer edilmelidir biyopsi kaset (B) transfer edilmelidir. Doku Bir parça, b daha önce Ekim çözelti içinde cryomold (D) içine yerleştirilmiş ve kapalı olmalıdır-20 ° C'de dondurularak Eing. Doku Büyük bir parça boyama akış sitometrisi için 50 ml'lik bir tüp (E) transfer edilmelidir ve MACS tamponunda O / N 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Doku küçük bir parça RNA stabilize edici çözelti (F) ile bir 1.5 ml'lik tübe aktarılarak RNA ekstraksiyonu kadar 4 ° C 'de muhafaza edilmelidir. Son olarak, artık doku parçalar halinde kesilir ve sıvı nitrojen ve uzun süreli depolama geçmeli dondurma cryotubes (G) transfer edilmelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Geniş bağışıklık fenotipleme için Şekil 3. Akış sitometrik yolluk stratejisi. 4 ° sitometri melanom tümör saklanan O üzerinde akış / N tarafından geniş bir immün fenotipleme yolluk stratejisinin Örnek;. C MACS tamponu 13 bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sonuçta, işleme yöntemleri, istenen hipotez tarafından dikte ve (Şekil 1) yapılacak teknik testlerin tahmin edilmelidir. Aşağıdaki bölüm, doku kesitlerinde gerçekleştirilebilir potansiyel tahlilleri açıklamak için özet olarak hizmet vermektedir. Hiçbir ayrıntılı bir bakış anlamına gelir, ama teknikleri anlatan ve onların güçlü ve zayıf yönlerini listeleyerek kılavuz örnek işleme yöntemleri ve alt testlerin seçimi yardımcı olmak için tasarlanmıştır gereğidir.
Boyama Flow cytometry taze parçalara doku bölümleri üzerinde gerçekleştirilebilir, ya da fragmanları, 4 ° C'de MACS tamponu O / N saklanır. Sitometrisi oldukça spesifik fenotiplendirilmesini ve doku örneklerinden alınan hücre popülasyonlarının analizi kolaylaştırır ve tek bir hücre içerisine 17 hücre yüzey belirteçleri ve hücre içi proteinlerin, sitokinler ve proteazlar lekelenmesini sağlar akış. Ayrıca, bazı sitometre localizat belirlemek amacıyla, tek bir hücre büyütme izinhücre içindeki proteinlerin iyon yerine sadece pozitifliği ve sinyallerin yoğunluğu. Son olarak kütle sitometrisi olumsuz hücreler lize edildi ve bu nedenle daha fazla kültürlendi olmayabilir kriteri, ya da bütün olarak 14 rakamı ile analiz edilmesi gerektiğini olmak üzere aynı örnek 35 'in protein ölçülmesini sağlar. Bu teknik, tek hücre düzeyinde birçok belirteç ve proteinlerin analizi yanı sıra ayrıntılı karakterizasyonu sağlar. Ancak, akış sitometrisi, doku homojenizasyon ve doku yapısının kaybına gerektirir hücre fenotipinde değişiklikleri en aza indirmek için taze doku üzerinde gerçekleştirilmelidir. Bazı hücre alt iskemi karşı daha savunmasız olabilecek önemlisi, hücre içeriğini etkileyebilir flow sitometri yönelik doku depolama erteledi. Fosfoproteinler da kötü işleme kinetiği 15 suboptimal sitometri ise akış ile tespit edilebilir.
Formalin fiksasyonu ve doku kesitlerinin parafin gömme (FFPE) durumunda en iyi seçim olabilirBu gerçekleştirilebilir tahlillerin tipler, yüksek esneklik sağlar, çünkü gelecekte ilişkin belirsizlik, analiz eder. Geleneksel, FFPE bölümleri immünohistokimyasal (İHK) ya da immünfloresans (IF) boyama 5 mikron bölüme bir mikrotomda kesitli. Bununla birlikte, FFPE dokular iyi korunmuş ve bu nedenle farklı amaçlar için kullanılabilmektedir. Aslında, FFPE bloklardan daha kalın bölümleri kesme DNA ve RNA ekstraksiyonu ticari olarak temin edilebilen kitler ile birlikte, hem de ters-faz proteini dizisi (RPPA) analiz 16-18 hem sağlar. Bu duruma göre, FFPE içine işleme doku örnekleri daha fazla esneklik gibi olanaklar, hem de immün doku yapısını koruyarak ve dolayısıyla doku yapılarının ve hücre popülasyonlarının tasviri benzeri in vivo olarak daha doğru bir temin etme avantajına sunabilir. Doku kesitleri zaman uzun süreler için muhafaza edilmesi için FFPE sağlar. Bu teknik, bununla birlikte, bazı olumsuz özelliğe sahiptir. FFPE için kullanılan ince kesitler yapmaksıralı kesimler ve doku kesitlerinde doku heterojenite için hesap böylece RNA ve DNA kalitesini olumsuz yönde etkileyen bir kez ortam havasına maruz okside başlar. Nihayet, çapraz bağlanma, FFPE bölümlerde IHC birden fazla proteinin beraber boyama optimizasyon gerektirir.
IHC veya IF ile mikroskopi istendiğinde, bir Ekim bileşiğin kullanılması tercih edilir. Ekim-depolanmış bölümler İHK ve IF için slaytlar üzerine yerleştirilir ve kullanılmadan önce kriyotom ile kesilmelidir. Ekim antijenitesini korur ve mikroskopi için en uygun tekniği yapım arka plan en aza indirir. Ekim de NBF birkaç gün gerektiren FFPE göre acil dondurma ve kesme verir. Bu faydalarına rağmen, Ekim genellikle daha az istikrarlı ve sadece İHK ve IF Ekim gömülü doku kesitlerinden yapılabilir çünkü FFPE daha az esnektir.
RNA analizi ile ilgili olarak, numuneler daha RNA e sağlayan, zamanla sertleşebilmesi RNA stabilize çözeltisi içinde 4 ° C'de saklandıdiğerleri arasında ticari olarak temin edilebilen çıkarma kitleri ve TRIzol aracılığıyla xtraction. RNA ekstraksiyonu, izin alt transkribe genler, RNA dizi analizinde ekspresyonunu ölçmek için ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve mikro-tahlil ile modüle edilmiş genlerin geniş spektrumlu analizleri veya nanoString analizi gibi analiz eder. Bu duruma göre, doku RNA izolasyonu gen ekspresyonu ve tedaviler ve hastalıkları olan yollar hakkında geniş bilgi sağlayarak son derece yüksek verimli olabilir. Önemlisi, ancak RNA ifadesi büyük ölçüde doku yapısı ve örnekleme büyüklüğüne göre değişebilir, bu nedenle ekstra bakım toplamanın önlemek için örnekleme konumu nedeniyle analizleri alınmalıdır. Ayrıca, RNA niteliği ifade seviyelerinde dinamik değişimler, bu nedenle ekstra bakım da genleri ve ilgi 19,20 yollarını incelemek için takip edilmektedir uygun kinetik sağlamak için alınması gereken oluşabilecek düşündürmektedir; işleme RNA stabilize s çekimini takiben sınırlı olmalıdıristikrarı sağlamak için Ç ÖZÜM. Buna göre, tamamlayıcı DNA depolama artan istikrar (cDNA) RNA tercih edilir (eğer aşağı analiz doğrultusunda) 21. RNA, genellikle alt analizlerde amplifiye edilebilir, çünkü son olarak, kirletici hücre dakikalık fraksiyonlar elde edilen sonuçlar büyük önyargılara neden olabilir.
DNA analizi daha önce hızlı bir şekilde dondurulup doku örnekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir ya da FFPE doku kesitleri üzerinde olabilir. Bu yöntemler daha sonraki bütün exome veya tüm genom dizileme, çoklu hastalık bağlamlarda hasta yanıtı ve prognozu bağlantılı mutasyonların ve polimorfizmin belirlenmesi yoluyla muazzam söz göstermiştir iki teknik sağlar. DNA izolasyonu başka antijenlerin ve tedavi ve hastalık 20,21 bağışıklık tepkisi ile ilgili bilgiyi elde etmek için, T-hücresi ve B hücresi reseptörünün (TCR ve BCR) numuneleri içinde bulunan dizileri belirlenmesi izin verebilir. RNA ile karşılaştırıldığında, DNA, ancak oldukça dengeli bir kez ekstre olduğuo hesap transkripsiyonel ve genlerin translasyonel regülasyonu yanı sıra post-translasyonel modifikasyonlar ve yönetmelik 22 içine alır.
Protein Western blot gerçekleştirmek amacıyla doku bölümleri veya FFPE örnekleri hızlı bir şekilde dondurulup şirketinden ekstre edilebilir protein etkileşimleri ve ağlar tespit etmek ko-immünopresipitasyon, hem de RPPA, yüzlerce göreli sayılmasına olanak tanıyan yüksek verim analiz tekniğinin tek bir örnek 23 proteinler. Ancak, bu teknik, sadece özel antikorların kendi ihtiyacına ile bilinen proteinlerin belirlenmesini sağlar. Önemli bir şekilde, bundan başka translasyon sonrası modifikasyon analizi, örneğin protein fosforilasyon gibi kararsızlık 15 nedeniyle dokusunun hızlı işlem gerektirmektedir.
Örneklerin Yapış-dondurma basit ve sınırlı kaynakları gerektirir. Aşağı analizler henüz belirlenmiş değil zaman da dışında, numunelerin uzun vadeli depolanmasına olanakTaze numuneler üzerinde yapılması gereken akış sitometrisi örneği. Yapış dondurulmuş örnekler de kolayca işbirliği amacıyla paylaşılabilir.
Sonuç olarak, bir doku tek bir parça elde edilebilir veri miktarı sınırsızdır. Tahlilleri herhangi bir çalışmada yapılmalıdır hangi evrensel doğru cevabı vardır. Her araştırmacı bu nedenle bu dramatik çalışmaların tasarımı ve elde edilen cevaplar etkileyebilir olarak o / o, hasta alımı ve doku işlemeden önce dikkate tüm hipotezler, istenen deneyleri yanı sıra mevcut kaynakları alır emin olmalısınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, John G. ve Marie Stella Kenedy Memorial Vakfı (Hibe # 0727033) ve Melanom Araştırma İttifak hayırsever katkıları ile desteklenmiştir. Yazarlar Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, MD Anderson Kanser Merkezi Dairesi yanı sıra, doku dağıtımı, toplanması koordine ve translasyonel araştırma kolaylaştırmak için Texas MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal Doku Bankası (ITB) University of teşekkür etmek istiyorum Patoloji ve Melanom Ay Shot Programı. Son olarak, yazarlar melanom etkilenen tüm hastalara ve ailelerine teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al.
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M. The ethics of social research. Researching social life. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. IRB guidebook. , US Government Printing Office. (1993).
- Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25 (2011).
- HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm (2003).
- MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).
- Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from: http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf (2011).
- NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from: http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf (2011).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G.
