Abstract
In de hersenen meeste vasculaire systeem bestaat uit een selectieve barrière, de bloed-hersenbarrière (BBB) de uitwisseling van moleculen en immuuncellen tussen de hersenen en het bloed regelt. Bovendien is de enorme neuronale metabolische vraag vereist van moment tot moment regulering van de bloedstroom. Met name afwijkingen van deze verordeningen zijn etiologische kenmerken van de meeste hersenen pathologieën; zoals glioblastoom, beroerte, oedeem, epilepsie, degeneratieve ziekten (ex: ziekte van Parkinson, ziekte van Alzheimer), hersentumoren, alsook inflammatoire aandoeningen zoals multiple sclerose, meningitis en sepsis-geïnduceerde hersenendysfuncties. Dus, het begrijpen van de signalering gebeurtenissen moduleren van de cerebrovasculaire fysiologie is een grote uitdaging. Veel inzicht in de moleculaire en cellulaire eigenschappen van de verschillende celtypen die het cerebrovasculaire systeem samengesteld kan worden verkregen uit primaire cultuur of celsortering van vers gedissocieerde hersenweefsel. Echter,eigenschappen zoals mobiele polariteit, morfologie en intercellulaire verhoudingen niet gehandhaafd in dergelijke preparaten. Het protocol dat hier beschreven is ontworpen om hersenen vat fragmenten te zuiveren met behoud van structurele integriteit. We tonen aan dat geïsoleerde vaten bestaan uit endotheliale cellen afgedicht door tight junctions die worden omringd door een continue basale lamina. Pericyten, blijven gladde spiercellen en de perivasculaire astrocyt eindvoetjes van astrocyten membranen de endotheellaag bevestigd. Tot slot beschrijven we hoe immunokleuring experimenten uit te voeren op gezuiverd hersenen schepen.
Introduction
De correcte werking van het centrale zenuwstelsel (CNS) is een sterk gereguleerd extracellulaire omgeving en zijn metabole eisen zijn groot in vergelijking met andere organen 1. Het CNS is ook zeer gevoelig voor een groot aantal chemicaliën, algemeen onschadelijk perifere organen maar om het, neurotoxisch. Om een correcte werking te garanderen, de meeste van de CNS 'vaatstelsel vormt een endotheliale barrière; de bloed-hersenbarrière (BBB), die de stroom van moleculen en ionen en de passage van immuuncellen tussen bloed en hersenen controleert, waardoor goede homeostase 2 handhaven, maar ook beperken van de intrede van therapeutische geneesmiddelen, waardoor belemmerd behandelingen neurologische aandoeningen 3. Op cellulair niveau wordt de BBB voornamelijk ondersteund door uitgebreide tight junctions tussen endotheelcellen, gepolariseerde expressie van efflux transporters en een zeer lage prijs transcytose 4. Eigenschappen en functies van de BBB worden meestal veroorzaakt door neighboring cellen 4. Vooral pericytes een belangrijke rol spelen bij het induceren en handhaven van de BBB 5,6. Omdat contractiele cellen, pericyten reguleren ook de doorbloeding 7 net als de gladde spiercellen omliggende grote schepen. Tenslotte astrocyten, grote gliale cellen van de hersenen, om grote processen eindvoetjes van astrocyten ongeveer uitgeroepen meeste hersenen vasculatuur 8 en moduleren BBB integriteit en immune rust 9, de overdracht van metabolieten neuronen 10, en induceren de nauwe koppeling tussen neuronale activiteit en bloedstroom 11,12.
De mogelijkheid om de moleculaire en cellulaire eigenschappen van het cerebrovasculaire systeem bestuderen cruciaal is om beter te karakteriseren zijn bijdrage aan de hersenen en fysiopathologie. Om deze vraag te pakken, hebben strategieën om cerebrovasculaire systeem van de hersenen te isoleren ontwikkeld, die het mogelijk maken voor de voorbereiding van de intacte fragmenten hersenen vat. Cerebrale vaartuig purification werd aanvankelijk beschreven met boviene hersenen 13 en verbeterd en aangepast aan andere diersoorten, vooral knaagdieren 14. In dit laatste onderzoek, het gebruik van filters van variërende grootte werd geïntroduceerd hersenvaten in fracties verrijkt in vaten van verschillende diameters te scheiden. Interessant is dat in dergelijke preparaten, endotheelcellen hielden hun metabolische eigenschappen 15, transporter functionaliteit 16 en 17 polarisatie. Hier beschrijven we in detail dit protocol en verder aan te tonen dat geïsoleerde schepen de meeste van hun behoud in situ constructies. Endotheelcellen blijven verbonden door krappe kruispunten en omgeven door een continue basale lamina. Pericyten en gladde spiercellen blijven de endotheliale laag, evenals perivasculaire astrocyten membranen bevestigd. Echter, astrocyten, microgliacellen, neuronen en oligodendrocyten geëlimineerd. Tenslotte beschrijven we een procedure uit te voeren immunokleuring op geïsoleerde vaten hersenen. Tot nu toe de meeste van de moleculaire en cellulaire studies over de cerebrovasculaire systeem zijn uitgevoerd op gezuiverd hersenen vat cellen gedissocieerd door-celsortering gebruik van mobiele specifieke reporter muis stammen of-immunokleuring gebaseerde procedures 18,19. Hoewel deze technieken maakt de isolatie van bijna zuiver cerebrovasculaire celpopulaties, geïsoleerde cellen volledig verliezen hun in situ morfologie en interacties, die op hun beurt sterk hun moleculaire en cellulaire eigenschappen beïnvloedt. Het protocol hier beschreven, waardoor de isolatie van hele cerebrovasculaire fragmenten zonder de noodzaak van specifieke antilichamen en transgene muizen vlekken, een goed alternatief de algemene structuur van geïsoleerde hersenvaten behouden dus vermindering weerslag op hun moleculaire eigenschappen. Geïsoleerde schepen kunnen dan worden gebruikt voor het bestuderen van de activiteit van genen, eiwitsynthese en regelgeving op de BBB zoals onlangs beschreven 20,21 22,23 het huidige protocol is goedkoop, gemakkelijk uit te voeren en snel aanpasbaar aan een laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oplossingen en Materialen
- Bereid oplossingen isolatie vaartuig: B1, voeg 1,5 ml HEPES 1M tot 150 ml van HBSS; B2, voeg 3,6 g dextran 20 ml B1; B3, voeg 1 g BSA tot 100 ml B1.
- Wijzig de filterhouder door het snijden van de onderkant van de bovenste deel schroeven.
- Bereid immunokleuring oplossingen: Fixatie oplossing 4% paraformaldehyde in PBS pH 7,4; Permeabilisatie / blokkeeroplossing verdund geit serum tot 5% Triton X100 en 0,25% in PBS pH 7,4.
Opmerking: Fixatie afhankelijk van het soort primaire antilichamen gebruikt.
2. Dissection
Opmerking: steriele omstandigheden zijn niet nodig, tenzij schepen worden gebruikt voor celkweek doeleinden.
- Bereid een bekerglas van 150 ml met 20 ml van B1. Houd op ijs en bedek met parafilm om luchtvervuiling te voorkomen.
- Diep verdoven de muis onder een kap met een klein papieren handdoek gedrenkt in 1 ml zuiver Isoflurane die wordt toegevoegd into de kooi. Anesthesie wordt gecontroleerd door een gebrek aan reactie op een teen knijpen. Dood de muis door cervicale dislocatie.
OPMERKING: Deze stappen worden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale en institutionele regelgeving. - Optioneel: Voer intracardiale perfusie met 20 ml PBS 1x naar bloedgehalte 24 elimineren.
- Sectie van de huid met een scalpel van de nek tot de neus en trek het weg. Verwijder alle vervuilende haren met PBS 1x.
- Aan de schedel te openen, plaatst u eerst een schaar naar voren om de olfactorische gloeilamp, en open de schaar om de schedel scheuren in twee delen.
- Verwijderen van de hersenen met behulp van een brein spatel voorzichtig. Ontleden de choroid plexus van de laterale ventrikels zoals ze het bloedvat voorbereiding 38 zou besmetten.
OPMERKING: Optioneel: De laatste voorbereiding zal parenchymale en hersenvliezen schepen bevatten. Indien niet gewenst, kan meninges worden afgepeld na de beschreven 38 werkwijze. - Transfer de hersenen in de beker met B1-oplossing op ijs. Tot 8 hersenen kunnen samen worden behandeld.
3. Brain Tissue Homogenisering
- Met behulp van twee scalpels, handmatig en krachtig sloeg de hersenen in de B1 oplossing vervolgens het verkrijgen van kleine stukjes van ongeveer 2 mm.
- Homogeniseren van de bereiding van een geautomatiseerd Dounce homogenisator, het uitvoeren van 20 slagen bij 400 rpm. Zorg dat de glasbuis wordt gehandhaafd in ijs en het bovendeel van de douncer in oplossing bij het op en neer bewegen, teneinde de vorming van luchtzakken te voorkomen. Indien meerdere monsters worden voorbereid, was de douncer met geïoniseerd water tussen elke homogenisering.
4. Vessel Zuivering
- Breng het homogenaat in een 50 ml plastic buis en naar de centrifugeren bij 2000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Een grote witte interface (meestal myeline) wordt gevormd op de bovenkant van het vat pellet (rood wanneer geen perfusie uitgevoerd).
- Verwijder het supernatant. Het schip pellet en de witte interface zal elkaar gehecht blijven. Voeg 20 ml van ijskoude B2-oplossing en schud de buis met de hand en krachtig gedurende 1 minuut.
- Ga verder naar de tweede centrifugatie bij 4.400 g gedurende 15 min bij 4 ° C. De myeline vormen nu een dichte witte laag op het oppervlak van het supernatant.
- Haal voorzichtig het myeline laag van de buiswanden door houden de buis en langzaam draaien om de supernatant langs de wanden passen. Gooi myeline het supernatant. De pellet die de vaten blijft op de bodem van de buis bevestigd.
- Dep de binnenwand van de buis met een absorberend papier gewikkeld rond een 5 ml kunststof pipet en verwijder alle resterende vloeistoffen, vermijd contact met het schip pellet. Bewaar het buisje ondersteboven op een absorberend papier om achtergebleven vloeistof af te voeren.
- Hang de pellet in 1 ml ijskoude B3 oplossing door en neer te pipetteren met een laag-bindende tips, keeping de buis op ijs, voeg dan nog eens 5 ml B3 oplossing. Zorg ervoor dat schepen gedispergeerd zo veel mogelijk en hoeft aggregaten vormen.
5. Filtratie
- Bereid een bekerglas op ijs met 30 ml ijskoude oplossing B3. Dek af met parafilm om luchtvervuiling te voorkomen.
- Plaats een 20 urn zeef op een gemodificeerde filterhouder bovenop een Becker kolf en evenwicht door toepassing van 10 ml ijskoude oplossing B3.
- Giet de bereiding vaartuig op het filter en de vaten spoelen met 40 ml ijskoude oplossing B3.
- Herstellen van de filter met schone pincet en onmiddellijk onder te dompelen in de beker die de B3-oplossing. De schepen van de filter los door voorzichtig schudden.
- Giet het bekerglas gehalte in een 50 ml plastic buis en centrifugeer bij 2000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Opmerking: Als alternatief kan schorsing van de hersenen schepen 'uit stap 4.6 worden gefilterd op een 100 pm-zeef.In dit geval worden grotere schepen voorkeur aan de achter, terwijl de doorstroom bevat microvaten (voornamelijk capillairen), die vervolgens worden gefiltreerd op een 20 urn zeef zoals hierboven.
- Resuspendeer de pellet van microvaatjes in 1 ml ijskoude B3 bevat en hevel door pipetteren deze in een 1,5 ml Eppendorf buis. Centrifugeer bij 2000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
6. Fixatie, Permeabilisatie en blokkeren
- Transfer schepen door pipetteren in 0,2 ml PCR-buisjes met PBS met behulp van een 1,0 ml lage binding tip. Wees niet aanraken van de schepen als ze kunnen zich aan de buitenkant van de tip. Voer alle volgende stappen onder een binoculair microscoop.
- Voor elk van de volgende mediumveranderingen, laat de buisjes op ijs tot de vaten beneden bereikt, pipet en het grootste deel van de vloeistoffen via lange ding gel-loading pipet tips.
- Verwijder het grootste deel van de PBS en voeg 200 ul fixeeroplossing.De schepen door zacht schudden schorten en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Pipet de fixeeroplossing en te vervangen door 200 ul 1x PBS (eerste wasbeurt), incubeer gedurende 5 minuten bij RT en herhaal deze stap 3 keer. Elke keer, controleren dat de schepen correct gezonken naar de bodem van de buizen en de pipet uit 1x PBS, het waarborgen van de vaartuigen niet aangeraakt.
- Na de laatste wasbeurt, 1x PBS vervangen door permeabilisatie / blokkerende oplossing en incubeer 1 uur bij KT, de vaten opnieuw suspenderen door zachtjes schudden van tijd tot tijd.
7. Immunokleuring
- Vervang de permeabilisatie / blokkerende oplossing met de mix van primaire antilichamen (zie referenties van de antilichamen hier en verdunningen gebruikt in de Materials template tabel) verdund in de permeabilisatie / blokkeren oplossing en incubeer bij 4 ° CO / N.
- Na 3 wassingen in PBS bij kamertemperatuur, incubeer de vaten met het mengsel van secundaire antilichamen verdund in PBS gedurende 2 uurbij kamertemperatuur.
- Opmerking: we raden het uitvoeren van nucleaire kleuring met Hoechst (1: 2000) of DAPI (1: 2000) om schepen tegen mogelijke besmetting van haren of stof onder de microscoop te onderscheiden.
- Na 3 wassingen in PBS, resuspendeer de vaartuigen in 50 pl PBS.
8. Montage en Observation
- Bereid een tip met een gesiliconiseerde glazen capillair: snijd een P200 pipet met behulp van een scalpel en pas de capillaire binnen. Het volume van het capillair is bij benadering 40 pl.
- De schepen over te dragen aan een glasplaatje met behulp van de gesiliconiseerde glazen capillaire en de vloeistof verwijder voorzichtig met een stuk absorberend papier.
- Breng een druppel van de montage medium op de schepen en het bezit van een dekglaasje op 45º waardoor de daling tot aan de rand van de slip te verspreiden. Laten gaan van de dekglaasje en laat medium langzaam verspreiden. Laat het drogen O / N bij RT met bescherming tegen licht. Schepen kunnen onder een tl worden nageleefdent confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier, een protocol waardoor de mechanische isolatie van de hersenen schepen 14 beschrijven we. Figuur 1 geeft een overzicht van de belangrijkste stappen van deze techniek. De architectuur van de hersenvaten is ingewikkeld en omvat verschillende celtypes, dwz endotheelcellen verzegeld door tight junctions omgeven door pericyten, gladde spiercellen, en astrocyten voet 9 processen. Aldus, na isolering van de hersenvliezen, wilden wij de structuur van gezuiverde vaartuigen karakteriseren door immunokleuring zoals beschreven in het tweede deel van ons protocol. Agrine, een component van de endotheliale basale lamina continu en homogeen gelabeld aan het endotheliale oppervlak (Figuur 2A). Zona occludens-1 (ZO-1), een van de bestanddelen van endotheliale tight junctions werd immuungekleurd zonder duidelijke discontinuïteit, wat suggereert dat endotheliale tight junctions werden geconserveerd (Figuur 2B). De pericyte endotheliale dekking, labeled van NG2, verscheen bijna voortdurende zoals eerder beschreven 25 (figuur 2C). Tenslotte gladde spier actine labeling toonde de aanwezigheid van een dichte gladde spiercellen laag op de oppervlakken van grote vaten gezuiverd (Figuur 2D). Deze resultaten toonden aan dat de algemene structuur in situ hersenen vat werd bewaard in de geïsoleerde fragmenten vat.
Astrocytes bleken grote processen of "eindvoetjes van astrocyten 'naar het oppervlak van de vaten mantel vrijwel geheel cerebrovasculaire systeem 8. Hun strakke interactie met schepen en hun rol in het behoud en de regulering van diverse cerebrovasculaire functies, hen als een cruciaal onderdeel van de neurovasculaire eenheid 9. We verder geanalyseerd de astrocyten vasculaire dekking van geïsoleerd hersenen schepen. Immunolabel van de astrocytaire intermediaire filament GFAP aanwezig normaal in de hele astrocyten (figuur 3A), was slechts gedeeltelijk aanwezig op gezuiverde schepen tonen van een aantal korte vezels aan het endotheel oppervlak (figuur 3B-C). Daarentegen werd connexine 43, een gap junction eiwit sterk verrijkt in perivasculaire astroglial membranen 26, sterk gedetecteerd op het oppervlak van gezuiverde grote vaten (Figuur 3D) en capillairen (figuur 3E). Ook immunolabel van Aquaporin-4 (AQP4), lid van het waterkanaal familie sterk uitgedrukt op het niveau van de astrocyten membranen tegenover de vaten 27, 26, waarin de muren van geïsoleerde vaten (figuur 3F-G). Hoewel astrocyten werden niet co-gezuiverd met schepen, bleven hun membraan van astrocytaire eindvoetjes membranen tijdens de mechanische behandeling van isolatie hersenen vat bevestigd.
Tenslotte onderzochten we de mogelijke verontreiniging van onze voorbereidingen door andere neurale celtypes. Immunolabel van neuronale intermediaire filamenten (NFM) (HornunG et al, 1999) onthulde de aanwezigheid van weinig resterende vezels gehecht aan de vaten op een mogelijke co-zuivering van enkele neuronale terminals (Figuur 4A-B). Microglia, gemerkt door Iba1 (Figuur 4C-D) en oligodendrocyten, gelabeld door Olig2 (figuur 4E-F) werden niet gedetecteerd in geïsoleerde vaten. Aldus neuronen, oligodendrocyten en microglia zijn niet co-gezuiverd met de hersenvaten.
Tezamen geven deze resultaten aan dat de beschreven protocol maakt de zuivering van structureel geconserveerde hersenen vat fragmenten, waarna perivasculaire astrocytaire membraan gehecht blijven.
Figuur 1. Samenvatting Scheme van de Brain Vessel Zuivering Protocol. Zijn de belangrijkste stappen gepresenteerd. Deze schets geeft de drie mogelijke vat fracties die kunnen worden verkregen afhankelijk van de fi lters gebruikt (20 of 100 um-mesh). S1: microvaten en grote schepen, S2: grote schepen en S3. Microvessels Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Geïsoleerde Schepen behouden de meeste van hun In Situ Structuur. Confocale image projecties van immunostained geïsoleerde muizenhersenen vaten. (A) Basale lamina immunolabelled voor Agrin (rood). (B) endotheelcellen krappe kruispunten immunolabelled voor Zonula occludens (ZO-1 ) (rood). (C) pericytes immunolabelled voor NG2 (rood). (D) Gladde spiercellen immunolabelled voor gladde actine (SMA) (rood). Kernen gekleurd met Hoechst (blauw).pg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Astrocyte eindvoetjes van astrocyten membranen blijven aan de Gezuiverd Vessels. Confocale image projecties. (A) Afbeelding van een sectie hersenen met een corticale schip immunostained voor endotheliale PECAM (wit), astrocytische GFAP (rood) en connexine 43 (Cx43) (groen ). (B, C) GFAP immunolabel (groen) aan het oppervlak van een geïsoleerde capillaire gelabeld door isolectin b4 (wit) (B) of van een groot schip gelabeld voor gladde spier actine (SMA) (rood) (C). (C) is een Re-print met de toestemming van 20 (D, E) Cx43 immunolabel (groen) aan het oppervlak van een geïsoleerde capillaire gelabeld door isolectin b4 (wit) (D) of een groot vat geëtiketteerd gladde spier actine (SMA) (rood)
Figuur 4:.. Neuronen, Microglia en Oligodendrocyten zijn niet co-gezuiverd met Brain Schepen confocale image projecties (A, B) Neurofilament (NFM) immunokleuring op een 20 urn dikke hippocampus slice (rood) (A) en gezuiverd hersenen schepen ( B). (C, B) Microgliale Iba1 immunokleuring op een 20 urn dikke corticale slice (red) (C) en gezuiverd hersenen schepen (D). (E, F) Oligodendrocyte Olig2 immunokleuring op een 20 urn dikke corticale slice (rood) (E) en gezuiverd hersenen schepen (F). Kernen zijn gekleurd door Hoechst (wit ), endotheel door Isolectine b4 (IB4) (groen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bloed-hersenbarrière regelt de doorgang van fysiologische stoffen in en uit het CZS en beschermt tegen potentieel schadelijke stoffen in het bloed. Het is betrokken bij diverse CNS ziekten, waaronder neurodegeneratieve ziekten 2 en hersentumoren 28. De extreem lage permeabiliteit van de BBB belemmert ook de doorgang van therapeutische middelen gericht op neurale cellen en de ontwikkeling van methoden voornemens reversibel openen BBB zonder nadelige gevolgen voor de hersenen is een zeer actief onderzoeksgebied 3. Vele pogingen zijn gedaan om waardevolle modellen en technieken waarmee de cellulaire, moleculaire en farmacologische onderzoeken van de BBB, met name, protocollen te ontwikkelen voor het isoleren vaartuigen uit de knaagdieren hersenen. Eerste pogingen gewoon verzameld haarvaten van mechanisch gescheiden hersenweefsel met variabele porie-sized mazen te ontdoen vervuilende hersenen parenchymcellen 13, 29, 30, 31. Dichtheidsgradiënt centrifugatie werd later geïntroduceerd geassocieerd filtratie van hersenvaten op nylon mazen of glasparels kolommen 32, 33, 15. In deze procedures, glasparels versus nylon mesh filtratie bleek de opbrengst verbeteren en hoog- versus lage-snelheid centrifugatie, microvaatje zuiverheid, hoewel high-speed centrifugatie induceert ook schuifspanning die genexpressie 15, 32 beïnvloedt. Een additionele stap van enzymatische digestie werd geïntroduceerd in sommige protocollen na de dissociatie stap 34 met als doel het losmaken hechtende neuronen en astrocyten te microvaatje zuiverheid 35 verhogen. Echter kan een overmatige voorvertering ook microcapillaire integriteit 36, 37 verstoren. Recentelijk heeft immuno-laser capture microdissectie (LCM immuno-) aangetoond dat het ophalen van schepen of zelfs afzonderlijke celpopulaties in vesse inschakelenls, veranderingen in BBB genexpressie te onderzoeken, ofschoon de hoeveelheid materiaal verkregen met deze techniek is zeer beperkt 23.
Hier presenteren we een procedure voor mechanische isolatie van hersenvaten aanvankelijk uitgewerkt door Yousif et al 14. Het biedt de mogelijkheid om pure hersenvaten verkrijgen en te scheiden volgens hun diameter. Dit protocol heeft niet de pretentie om de zuivering van de hele hersenen vasculaire compartiment toe, en we hebben de werkzaamheid ervan niet te vergelijken met de vorige gepubliceerde protocollen. Het ontbreken van gradiënt specifieke kolommen en snelle centrifugatiestappen wordt de totale procedure zeer eenvoudig en goedkoop. Belangrijker is, raden wij aan de choroid plexus te verwijderen, zoals beschreven door 38 vóór homogenisering van de hersenen, zoals wij ervaren het als een mogelijke bron van besmetting. Andere belangrijke aanbevelingen zijn: 1) het gebruik van "low binding" plastic material (in het bijzonder pipetpunten) sinds schepen natuurlijk houden aan onbehandelde kunststoffen. Het weglaten dit punt zou resulteren in het verlies van de meeste schepen; 2) de zorgvuldige evenwichtsinstelling van nylon filters voorafgaand aan filtratie (stap 5,2); 3) het opnieuw suspenderen van de pellet in zoveel buffer mogelijk vóór filtratie om de zuiverheid van het monster te versterken; 3) Indien nodig, bloedcellen en eiwitten gevangen in gezuiverde vaten kan worden uitgevoerd door intracardiale perfusie met PBS gewassen voorafgaand aan dissectie hersenen; 4) De opbrengst van schepen gezuiverd kunnen worden verbeterd door het herhalen van de scheiding van het myeline in dextran twee of drie keer (stap 4,2) 39,40. Voor immunokleuring, raden wij: 1) om een nucleaire etikettering uit te voeren om schepen uit vervuilende haren en stof waarvoor antilichamen hebben veel niet-specifieke affiniteit te onderscheiden; 2) voorkomen dat de vaten verzamelen door centrifugatie voor elke medium verandering kan leiden tot de vorming van een onlosmakelijke bol materiaal.
Zuivering van intacte hersenen schepen presenteren grote voordelen om de moleculaire kenmerken van BBB bestuderen. Hoewel specifieke of verrijkte endotheel en pericyte genen en pathways zijn door transcriptoom en proteoom studies over afzonderlijke celtypen 18,19, is het bekend dat dissociatie en celsorteertechnieken leiden tot het verlies van cel polariteit, morfologie en interconnectie celtypen, die sterk van invloed zijn hun moleculaire profielen. In deze context houdt de gehele vasculaire compartiment intact zoals hier beschreven, met uitzondering van astrocyten, zou een groot voordeel geven. Bovendien, vergeleken met celsortering zuivering van hersenvaatjes geen gebruik van specifieke reporter transgene muizenstammen of langdurige-immunokleuring gebaseerde procedures. Een ander voordeel van het gebruik van hersenvaten is de mogelijkheid de zuiveringsprotocol andere soorten zoals reeds getoond murine14, Bovine13 alsook bij mensen 41,42. Tenslotte zou een verdere ontwikkeling van deze techniek de in vitro kweek van hersenvaten fragmenten. Co-cultuur van gezuiverd schepen met primaire astrocyten neuronen en microgliacellen zou kunnen helpen om de neurovasculaire eenheid weer in elkaar op een nauwkeurige wijze dan complexe 3-dimensionale meercellige kweeksystemen waarbij cellen eerst worden geïsoleerd en gezuiverd voordat het wordt teruggeplaatst 43. Zo zuivering van intacte hersenen schepen zou van groot nut zijn voor de ontwikkeling van elk type in vitro assays om de BBB te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Labex MemoLife en door de ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclerose en plaques)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| 10x PBS | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2,000 |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
- Pardridge, W. M.
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Armulik, A., Genové, G., et al.
- Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
- Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Iadecola, C., Nedergaard, M.
- Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
- Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
- Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
- Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
- Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
- Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
- Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
- Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
- Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
- Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
- Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
- Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M.
- Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
- Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
- Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S.
- Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
- Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
- Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
- Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
- Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
- Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
- Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
- Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
- Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
- Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).
