We beschrijven een protocol dat de zuivering van het vasculaire compartiment van de muizenhersenen mogelijk maakt. Geïsoleerde hersenvaten omvatten endotheelcellen die zijn verbonden door strakke verbindingen en omringd door een continue basale lamina, pericyten, vasculaire gladde spiercellen, evenals perivasculaire astrogliale membranen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In de hersenen meeste vasculaire systeem bestaat uit een selectieve barrière, de bloed-hersenbarrière (BBB) de uitwisseling van moleculen en immuuncellen tussen de hersenen en het bloed regelt. Bovendien is de enorme neuronale metabolische vraag vereist van moment tot moment regulering van de bloedstroom. Met name afwijkingen van deze verordeningen zijn etiologische kenmerken van de meeste hersenen pathologieën; zoals glioblastoom, beroerte, oedeem, epilepsie, degeneratieve ziekten (ex: ziekte van Parkinson, ziekte van Alzheimer), hersentumoren, alsook inflammatoire aandoeningen zoals multiple sclerose, meningitis en sepsis-geïnduceerde hersenendysfuncties. Dus, het begrijpen van de signalering gebeurtenissen moduleren van de cerebrovasculaire fysiologie is een grote uitdaging. Veel inzicht in de moleculaire en cellulaire eigenschappen van de verschillende celtypen die het cerebrovasculaire systeem samengesteld kan worden verkregen uit primaire cultuur of celsortering van vers gedissocieerde hersenweefsel. Echter,eigenschappen zoals mobiele polariteit, morfologie en intercellulaire verhoudingen niet gehandhaafd in dergelijke preparaten. Het protocol dat hier beschreven is ontworpen om hersenen vat fragmenten te zuiveren met behoud van structurele integriteit. We tonen aan dat geïsoleerde vaten bestaan uit endotheliale cellen afgedicht door tight junctions die worden omringd door een continue basale lamina. Pericyten, blijven gladde spiercellen en de perivasculaire astrocyt eindvoetjes van astrocyten membranen de endotheellaag bevestigd. Tot slot beschrijven we hoe immunokleuring experimenten uit te voeren op gezuiverd hersenen schepen.
Inleiding
De correcte werking van het centrale zenuwstelsel (CNS) is een sterk gereguleerd extracellulaire omgeving en zijn metabole eisen zijn groot in vergelijking met andere organen 1. Het CNS is ook zeer gevoelig voor een groot aantal chemicaliën, algemeen onschadelijk perifere organen maar om het, neurotoxisch. Om een correcte werking te garanderen, de meeste van de CNS 'vaatstelsel vormt een endotheliale barrière; de bloed-hersenbarrière (BBB), die de stroom van moleculen en ionen en de passage van immuuncellen tussen bloed en hersenen controleert, waardoor goede homeostase 2 handhaven, maar ook beperken van de intrede van therapeutische genee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Oplossingen en Materialen
- Bereid oplossingen isolatie vaartuig: B1, voeg 1,5 ml HEPES 1M tot 150 ml van HBSS; B2, voeg 3,6 g dextran 20 ml B1; B3, voeg 1 g BSA tot 100 ml B1.
- Wijzig de filterhouder door het snijden van de onderkant van de bovenste deel schroeven.
- Bereid immunokleuring oplossingen: Fixatie oplossing 4% paraformaldehyde in PBS pH 7,4; Permeabilisatie / blokkeeroplossing verdund geit serum tot 5% Triton X100 en 0,25% in PBS pH 7,4.
Opmerking: Fixatie afhankelijk van het soort primaire antilichamen gebruikt.
2. Dissection
Opmerking: steriele omstandighe....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier, een protocol waardoor de mechanische isolatie van de hersenen schepen 14 beschrijven we. Figuur 1 geeft een overzicht van de belangrijkste stappen van deze techniek. De architectuur van de hersenvaten is ingewikkeld en omvat verschillende celtypes, dwz endotheelcellen verzegeld door tight junctions omgeven door pericyten, gladde spiercellen, en astrocyten voet 9 processen. Aldus, na isolering van de hersenvliezen, wilden wij de structuur van gezuiverde vaartuigen kar.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De bloed-hersenbarrière regelt de doorgang van fysiologische stoffen in en uit het CZS en beschermt tegen potentieel schadelijke stoffen in het bloed. Het is betrokken bij diverse CNS ziekten, waaronder neurodegeneratieve ziekten 2 en hersentumoren 28. De extreem lage permeabiliteit van de BBB belemmert ook de doorgang van therapeutische middelen gericht op neurale cellen en de ontwikkeling van methoden voornemens reversibel openen BBB zonder nadelige gevolgen voor de hersenen is een zeer actief on.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Labex MemoLife en door de ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclerose en plaques)
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| 10x PBS | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2,000 |
Referenties
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
