Abstract
Utrymmet analysen social beskrivs här kan användas för att kvantifiera sociala interaktioner av Drosophila melanogaste r - eller andra små insekter - på ett enkelt sätt. Som vi tidigare visat en, i en två-dimensionell kammare, vi först tvinga flugorna att bilda en tät grupp, därefter låta dem ta sin föredragna avstånd från varandra. Efter flugorna har avgjorts, mäter vi avståndet till närmaste granne (eller socialt utrymme), behandling av en statisk bild med fri programvara online (ImageJ). Analysen av avståndet till närmaste granne tillåter forskare att bestämma effekterna av genetiska och miljömässiga faktorer på social interaktion, samtidigt kontrollera för potentiella störfaktorer. Olika faktorer såsom klättringsförmåga, tid på dygnet, kön och antal flugor, kan ändra sociala avståndet mellan flugor. Vi föreslår sålunda en serie experimentella kontroller för att mildra dessa störande effekter. Denna analys kananvändas för åtminstone två syften. För det första kan forskarna avgöra hur deras favorit miljö shift (t.ex. isolering, temperatur, stress eller toxiner) kommer att påverka den sociala avstånd 1,2. För det andra, kan forskare dissekera de genetiska och neurala grunderna för denna grundläggande form av socialt beteende 1,3. Specifikt, vi använde det som ett diagnostiskt verktyg för att studera betydelsen av ortologa gener som tros vara inblandade i socialt beteende i andra organismer, såsom kandidatgener för autism hos människor 4.
Introduction
Social interaktion är avgörande för en god utveckling och hälsa individer inom en grupp som helhet, och kan observeras över många arter, från människor (Homo sapiens) och enklare organismer såsom fruktflugor (Drosophila melanogaster) 5,6. En enskild fruktflugor eller människa har gemensamma metoder för att behandla sensorisk information under dessa interaktioner, oavsett om det är: auditiv, visuell, lukt, känsel, eller gustation. Vi och andra hypotesen att det finns ett potentiellt delad neurocircuitry underliggande beteendemässiga reaktioner på sociala interaktioner och att de neuronala celler och gener som är involverade kan vara evolutionärt konserverade 7. När den första interaktionen har inträffat, kommer socialt utrymme mellan de samverkande individerna antingen öka (social undvikande 8) eller minskning (gruppbildning / aggregation 5). Mer komplicerade interaktioner, som aggression eller uppvaktning, kan sedan ske.
Drosophila melanogaster, som användes i följande studier 1-4,9. Socialt rum avser ett mått på avståndet mellan en fluga och dess närmaste granne 10. Sociala rummet är konsekvent för en viss population av D. melanogaster när experimentella betingelser bevaras (i genomsnitt ungefär inom 1-2 kroppslängder), och varierar med hänsyn till social upplevelse av flugorna, ökar om individen har hållits isolerade 1. Korrekt vision är nödvändig för att upprätthålla normal social distans, men inte klassiska doftämnen eller CVA uppfattning 1. Mått på socialt rum kan därför varaanvändas som ett diagnostiskt verktyg för att analysera sociala interaktioner och kvantifiera socialt beteende i D. melanogaster 1. Vi beskriver här i detalj hur man utför denna kvantifiering, och i vilken utsträckning gemensamma experimentella variabler påverkar detta beteende.
Vi visar att orienteringen av kammaren där analysen utförs, liksom antalet flugor - i en omfattning - gör påverkar sociala rummet. Det har tidigare visat att kammargeometrin påverkar spontan utforskande förflyttning av flugor 11,12, och detta fenomen kan i slutändan påverka om de beslutar att bosätta sig. Men så länge som flugan densitet (fluga / cm 2) och kammar orientering är densamma, förblir det sociala rummet av flugorna också konstant. Robustheten i denna analys illustreras av det faktum att oberoende laboratorier med olika kammarstorlekar, form och orientering kan replikera resultatet visas av mutanter av white gen (som påverkar ögonpigmentering), vilket är en ökning socialt utrymme (vertikal triangel eller horisontell cirkel i ett, horisontella torg med luftflödet i 3).
Våra resultat visar också att är avgörande för samstämmigheten i resultaten upprätthålla den tidpunkt då det sociala rummet Experimentet utförs, som vi visar att män, men inte kvinnor, står längre ifrån varandra på kvällarna. Skillnaderna ses mellan dagtid och kvällstid inte beror på aktivitets skillnader i flugorna, och vi diskuterar argument som anger att aktivitetsnivåer inte korrelerade med sociala rummet.
Slutligen finns det genetiska underbyggnad till fastställandet av sociala rummet, vilket indikeras av den vita mutanten redan beskrivits 1,3, och skillnaderna mellan olika inavlade och vildfångade stammar av flugor som vi presenterar här.
Därför gör denna analys ett utmärkt verktyg feller studera effekterna av genetiska såväl som miljöfaktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utrustning och reagenser Skapad In-house (Se lista över material för andra)
- Förbered en Drosophila kall anestesiapparat som tidigare beskrivits 8.
- Förbered en fluga sug som tidigare beskrivits 13.
- Förbered sociala kammare och innehavare utrymme.
- Beställ eller göra glasrutor och akryl distanser för att skapa de sociala kamrarna utrymme. Varje socialt utrymme kammare består av två kvadratiska glasrutor (17,6 cm x 17,6 cm, med en tjocklek på 0,3 cm), två rätvinklig triangel akryl distanser (med en höjd på 16,5 cm, en bas av 8,9 cm, med en tjocklek på 0,3 cm ), och två rektangulära utrymmen (9 cm av 1,5 cm med en tjocklek på 0,3 cm) (Figur 1A).
- Montera glas och akryl socialt utrymme kammaren så att den är identisk till kammaren i figur 1B. För att göra det, börja med att placera en triangulär spacer platt på toppen av en kvadrat glasruta så att den räta vinkelnhos den triangulära distansorganet är i linje med ett av hörnen av fyrkanten rutan. Placera sedan andra triangulära distans platt på toppen av torget rutan spegling första triangulära distans.
OBS: Se till att använda handskar för att inte förorena bitarna med oljor och dofter från dina händer. - Placera två små rektangulära distanser platta ovanpå torget rutan längs sidan av rutan som inte täcks. Akryl distanser på toppen av torget plan ska nu bilda en triangulär arena.
- Placera en andra kvadrat glasruta på toppen av akryl distanser så att den är i linje ovanför den ursprungliga glasruta nedan.
- Använd fyra bindemedel klipp för att säkra rutorna och distanser för att bilda det sociala rummet kammaren. Placera en klämma nära hörnet, över den långa sidan av var och en av de triangulära distansorgan, fästa dem inuti glasrutorna. På samma sidor, placera ett klipp i det intilliggande hörnet, under vart och ett av de rektangulära distanser, säkra dem isida glasrutorna.
- Montera en stödstativ och en kolv klämma så att klämman kommer att upprätthålla det sociala rummet kammaren i upprätt läge, som det sociala rummet kammaren vilar på högkant ovanpå arbetsytan.
- För varje upprepning i försöket, montera ett socialt rum kammare och stödja stå.
- Förbered en klättring analyssvar apparat för att kontrollera klättringsförmåga av de testade flugor.
- Använd en motström apparat, som tidigare beskrivits 14,15.
- Säkerställa homogena ljusförhållanden genom att utföra experiment på en arbetsyta täckt med en vit bänk lock och framför en vit bakgrund.
2. Förbereda Flugor innan Experiment
- Behåll flugor i flaskor som innehåller standard Drosophila flyga mat. Förvara dem i en inkubationskammare vid 25 ° C på en 12 timmar ljus / mörker-cykel.
- En till två dagar före eXperiment, samla och kön flyger under kalla anestesi, såsom tidigare beskrivits 8.
- Chill kalla anestesiapparaten vid -4 ° C. Plats flyger i 50 ml plaströr. Helt dränka plaströr innehållande flugor till is i en isolerad ishink, vänta minst 5 minuter för flugor att bli orörliga.
- Placera flugorna på polyetylenarket av det kalla anestesiapparaten. Vid RT, använd en stereo att skilja hanar från honor. Behåll flugor, i grupper, i injektionsflaskor som innehåller standard Drosophila flyga mat, högst 40 flugor per flaska.
- Två timmar före början av experimentet, se till att temperaturen i rummet där experimentet kommer att utföras är mellan 24-25 ° C och luftfuktigheten är ca 50%.
- Överför flugorna i nya flaskor innehållande mat, och placera dem under 2 h på arbetsytan där experimentet kommer att utföras.
OBS: För dessa experiments, i farten stammar som användes var Drosophila melanogaster stammar: Canton-Special eller Kanton-S (CS), w 1118 Cs 10 (eller W - w 1118 utparade 10 gånger till Canton-S), Oregon och Samarkand flugor var alla från vårt laboratorium lager 16; Elwood flugor samlades under hösten 2011 i Elwood närheten av Huntington, på Long Island, New York, USA 8. Förutom när annat anges, var de resultat som presenteras erhållits med Kanton-S flugor (i olika nyanser av rött).
3. Utföra experiment
- Utför experimentet 12:00 till 03:00 (Zeitgeber tid - tiden i timmar efter debuten av ljus - i ZT 4-7).
- Förbered det sociala rummet kammaren för överföring av flugor.
- Placera ett socialt rum kammar platt på en arbetsyta, med sidan som innehåller rektangulära distanser närmast kroppen.
- Avlägsna one klipp närmast din kropp och skjut en rektangulär spacer utåt, skapa ett gap på cirka 1 cm mellan de rektangulära distanser.
- Med tejp och en markör, märka det sociala rummet kammaren i en övre hörnet med kön, stam, och upprepa nummer. Var noga med att bandet inte täcka en del av den inre triangulära arenan.
- Överför flugorna i det sociala rummet kammaren.
- Transfer flyger från sin flaska innehållande mat i en ny, tom flaska. Sug flyger från den tomma flaskan och överföra dem till det sociala rummet kammaren.
- Inhalera att dra flugorna in i spetsen av aspiratorn. Placera spetsen i en cm klyftan mellan de rektangulära distanser i det sociala rummet kammaren och andas ut med en konsekvent hastighet för att tvinga flugorna i den inre triangulära arenan.
- Skjut omedelbart den rektangulära distans tillbaka på plats, stänga basen av inre triangulära arenan, och placera bindeklippet igen.
- På en bultande pad, som ligger på olika bänk än där det experimentella arbetet sker genom att hålla det sociala rummet kammaren upprätt så att rektangulära distanserna är på undersidan. Pund tre gånger för att säkerställa alla flugor har sjunkit till botten av arenan.
OBS: På grund av akryldistans sticker ut från den minsta kammarstorlek (Figur 1D), bang armbågarna på arbetsytan samtidigt upprätthålla ett säkert grepp om apparaten för att säkerställa flugorna har sjunkit till botten. - Starta en timer.
- Placera det sociala rummet kammaren på arbetsytan och använd stativet och kolv klämma för att hålla den upprätt. Placera en linjal eller ett klistermärke med känd längd platt mot det sociala rummet kammaren, men inte täcker någon del av den inre triangulära arenan.
- För horisontellt placerade experiment, inte placera det sociala rummet kammaren i stödstativet; istället lägga det sociala rummet kammar platt på arbetsytan.
- När flugorna har avgjorts, vanligtvis efter ca 30 min, ta en bild av det sociala rummet kammaren. Se till att bildrutan innehåller hela den inre triangulära arena, härskaren, och etiketten.
- Upprepa försöket för varje genotyp och skick (helst tre interna replikat och 3 oberoende upprepningar).
4. Analysera Social Space Data
- Importera följande makron i ImageJ 17
- ImageJ finns här: http://rsbweb.nih.gov/ij/.
- Du kan skapa en "Mäta avstånd" kommando i Plugins-menyn genom att spara makron nedan i en fil som heter "Measure_Distances.txt" i mappen ImageJ / plugins i makromappen, och använda Hjälp> Uppdatera menyer kommandot. "
- Kopiera i en .txt-fil makron som tillhandahålls i kompletterande uppgifter och ursprungligen publicerats i tre.
- Ladda upp bilder till en dator, och öppna en rsi ktre med ImageJ.
- Skapa en skala genom att dra en linje från 0 cm till 1 cm märken på linjalen i bilden, och under fliken Analysera, välj Set Scale funktionen för att ställa en skala från 1 cm för det avståndet (samma tillvägagångssätt för klistermärke av känd längd). Välj Global alternativ innan applicering av skalan i bilden.
- Beskära bilden med hjälp av beskärningsfunktionen under fliken Image så att den omfattar alla flugorna, när du tar bort så mycket av resten av bilden som möjligt.
- Gör bilden svartvit genom att välja 8-bit från alternativet Typ under fliken Bild.
- Ta bort allt bakgrundsljud från bilden genom att gå till Threshold funktion under Justera alternativ på fliken Bild. Dra skjutreglagen för att förbättra eller ta bort kontrasten så att kroppen varje fluga syns tydligt utan några andra markeringar i bilden. Om det finns markeringar som inte flugor, fånga dem med den rektangulära verktyget och ta bort dem.
- Ställmätningar med hjälp av Set Mätningar verktyget under fliken Analysera. Välj Area, masscentrum, Centroid och Display Label. Därefter väljer analysera partiklar har under fliken Analysera för att skapa en numrerad lista över alla de svarta fläckar som representerar flugor.
- Vid användning av Analysera partiklar; set storlek 0,01-0,1 (INTE välja pixelenhet); cirkularitet 0,00-1,00; show konturer; visa resultat, och lägg till manager.
- Se till att varje svart fläck (varje partikel) är en exakt återgivning av flugorna som finns i originalbilden, genom att jämföra den numrerade listan till den ursprungliga bilden.
OBS: Om några flugor som är mycket nära varandra räknas som en partikel, dra en vit linje för att separera de två flugor på den binära bilden manuellt.
- Medan listan är vald, använd Närmaste granne - Lista Avstånden makro under den andra makron alternativet på fliken Plugins för att skapa en ny lista med avstånden i cm, från each flyga till sin närmaste granne.
- Kopiera närmaste granne avstånd från ImageJ och klistra in i en kolonn av ett kalkylprogram.
- Sammanställa all data från varje upprepning på samma kalkylblad och ordna med genotyp och skick.
- Utför dataanalys med hjälp av statistisk programvara. I detta experiment var Graph Pad Prism (version 6 för MacOS X, GraphPad Software, San Diego Kalifornien USA, www.graphpad.com) används för att utföra en envägs ANOVA, och Kruskal-Wallis test, Tukeys och Dunnet s Post-hoc-tester.
- Fördelningen av avstånden följer en icke parametrisk fördelning 1, och data representeras som box och Tukeys whiskers (för att eliminera extremvärden).
5. Klättring analys (Kontroll Behavior)
- Använd en klättring analys som en kontroll för att testa flugor klättring förmåga 14,15,18.
- Använd motströmningsanordning sådan att tre försök cen köras parallellt.
- Överför 50 till 100 tidigare obehandlade flugor (flugor som inte har testats tidigare) i tre olika testflaskor, och snäpp dem i 1: a, 3: e och sista slots på botten av motströmsapparat, med färska tomma flaskor i motsatta ställen.
- Placera färska, tomma flaskor i tomma luckor i botten av apparaten.
- Knacka ned anordningen tre gånger, så att alla flugor är vid botten av varje rör, för att initiera försöket.
- Starta timer för 15 sekunder (tid som är tillräcklig för ~ 100% av 3-7 dagar gamla Canton-S för att nå toppen flaskan - se figur 3F).
- Skjut den övre delen av motströmsanordning, för att förskjuta de översta flaskorna genom en slits.
- Samla flugor genom att trycka på apparaten ner, för att få alla flugor i botten flaskor.
- 1: a och 2: a rören (eller 3: e och 4: e, 5: e 6: e) motsvarar respektive flugorna som inte når till toppen och flugorna som nådde toppen flaskan.
- Beräkna Performance Index (PI).
- Räkna antalet flugor i varje ampull.
- PI är den procentuella andelen av flugor som kan klättra på det övre röret.
- Medlen för PI följer en normalfördelning 1, och data representeras som kolumn grafer av medelvärde plus eller minus standardavvikelsen för medelvärdet (SEM).
OBS: Alternativt kan PI beräknas som andel av flugor kan uppnå den övre delen av den undre flaskan (för äldre flugor är 5 sek tillräcklig tid för att kvantifiera en skillnad i klättringsförmåga mellan infekterade och icke infekterade 12 dagar gammal Canton-S kvantifierade från en stillbild: se resultat). Andra har använt olika mått på prestanda skrämma-inducerad negativa geotaxis, som är lämpliga att kvantifiera klättringsförmåga 19-22 också.
- Transfer flyger från sin flaska innehållande mat i en ny, tom flaska. Sug flyger från den tomma flaskan och överföra dem till det sociala rummet kammaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det sociala rummet kammaren kan användas som ett verktyg för att kvantifiera sociala beteende Drosophila melanogaster. Akryl distanser och glasrutor klipps tillsammans för att bilda en inre triangulär arena som ger en två-dimensionell området där flugor kan bilda stabila grupper utan närvaro av många potentiellt störande signaler. När flugorna överförs till den vertikala arenan, de överraskad av att utnyttjas ned, och de svarar genom ett avbrotts beteende: negativa geotaxis. De klättra till vertex upprätt triangel, tvingas in i en tät grupp, och sedan ges tid att gå vidare bilda varandra, och att utforska arenan. Efter 20 till 40 minuter, de slutar röra, och en stabil grupp bildas. Avståndet mellan varje fluga och dess närmaste granne kan mätas från en bild, för att ge en kvantifiering av deras föredrog sociala rummet. Flugor anses vara mer social ju närmare de är med sina grannar.
Flydensitet inte spela en roll i det sociala rummet i kammaren till den punkt av underkapacitet. För en stor grupp av 20 till 70 flugor i större vertikalt orienterad kammare, är socialt utrymme oberoende av grupptätheten (figur 2A, B). Med endast 10 eller 15 flugor i det sociala rummet kammaren, det är troligen inte tillräckligt många individer för att bilda en stabil social grupp, vilket leder till en ökning av sociala rummet (figur 2A, B). Men det är att testa ett stort antal flugor inte alltid bekvämt - under vissa omständigheter där antalet muterade individer är begränsad, kan forskarna inte kunna samla grupper av flugor är tillräckligt stora för standardstorleken på det sociala rummet kammaren. För att underlätta kvantifiering socialt utrymme med hjälp av små grupper av flugor, kan forskarna manipulera det sociala rummet kammaren så att området för den tvådimensionella arena är mindre men området per fluga förblir konstant. Visas i figur 1C, D finns två typer av socialrymdkammare ändras för mindre grupper, men behålla samma densitet som den större kammaren. På detta sätt håller flugan densiteten, och minska kammarstorlek medger erhållande av en liknande social avståndet (figur 2C).
Samma övergripande trenderna håller streck för sociala rymdkammare placerade i ett horisontellt läge (Figur 2D). Vi kan dock konstatera att flugorna tenderar att vara längre ifrån varandra i en sådan övergripande inställning, och de inte nöja sig lätt en. Grupper som har bara 15 och 20 flugor uppvisar större social utrymme än grupper med 40 flugor (F igure 2D).
För att bekräfta att överbefolkning inte var ansvarig för de mindre avstånd till närmaste granne ses i större grupper av flugor, avståndet från varje flyger till alla andra flugor mättes, som under 9. Kvantifiera avståndet till alla flugor, kontra avstånd till närmaste granne, kan bedöma en grupp behavieller, i stället för beteendet hos individer inom en grupp. Som väntat, avståndet till alla flugor ökade när mängden flugor i gruppen var större, en återspegling av gruppen själv, inte av de individuella flugor. Denna trend observerades för både vertikalt och horisontellt placerade sociala rymdkammare (figur 2E, F). Därför var flugorna från större grupper som inte tvingas att hålla ett närmare avstånd till sin granne på grund av begränsat utrymme. Istället, flugor bildar hårdare samhällsgrupper när det finns mer än 15 flugor i kammaren.
När det gäller andra beteendetester, en begränsning till att använda det sociala rummet kammaren vertikalt är att den kräver flugor utan geotaxis eller klättring nedskrivningar. Exempelvis Canton-S flugor infekterade under en vecka med den gramnegativa bakterien Providencia rettgeri 23 besitter en klättring defekt och uppvisar olika sociala distans resultat beroende på orienteringen av det sociala avståndetkammare. När testet utfördes vertikalt, det sociala rummet av de smittade flugorna var större än det sociala rummet av kontrollerna, förmodligen eftersom de infekterade flugor kunde inte bilda en stabil grupp på toppen av kammaren (Figur 3A). När flugorna under samma betingelser testades sedan i horisontellt orienterade socialt utrymme kammare fanns inga signifikanta skillnader, vilket indikerar att rörelseförmåga är förmodligen mindre av en faktor för social utrymme i de horisontellt placerade sociala kammare utrymme (Figur 3B). Medan de infekterade flugor är visuellt mindre möjlighet att klättra än kontroller, kan detta kvantifieras med hjälp av klättring analysen (Figur 3C). Efter 5 sekunder, klättrade upp till den övre halvan av den nedre flaskan och endast 32% av infekterade flugor cirka 44% av kontroll flugor. Det är värt att notera att alla flugor i denna analys klättra dåligt (de sällan nå till toppen flaskan, bara den övre delen av den undre flaskan), vilket kanförklaras av det faktum att de är 12 dagar efter eclosion, vilket är när flugor börjar uppvisa en defekt i klättring på grund av åldrande 22.
För stammar som inte har någon klättring defekt, båda orienteringarna av kamrarna ledde till samma resultat, som vi tidigare har visat en. I detta experiment var samma ökning av socialt utrymme ses för Canton-S och w 1118 Cs 10 i den vertikala triangel eller horisontella cirkulära kamrarna (figur 3D, E - ny analys i fält och morrhår av uppgifter som publicerats i en). Det fanns ingen skillnad i klättringsförmåga mellan Canton-S och w 1118 Cs 10 indikerar att det inte var en faktor för skillnaden i sociala rummet mellan stammar i den ena kammaren orientering (15 sek val - Figur 3F). Om de får 5 sek val 17% ± 3,3 av CS och 14% ±2.5 av w 1118 Cs 10 nått den övre flaskan (statistiskt inte annorlunda, data ej visade).
Forskare som använder det sociala rummet kammaren måste också se till att de upprepar sina experiment vid samma tidpunkt på dagen. För både Canton-S och w 1118 Cs 10 manliga flugor, tiden på dagen påverkade sociala interaktioner. Vid jämförelse med dagtid (Zeitgeber tid - tiden i timmar efter starten av ljus - ZT4 till ZT7), de testade på kvällen flugor (ZT11 till ZT12 - precis innan belysningen) visade ett mycket större socialt utrymme för båda genotyper, även om deras relativa utrymme skillnad bevarades - dvs w 1118 Cs 10 flugor är fortfarande mindre social än Canton-S flyger på kvällen (Figur 4A). Intressant, bara det sociala rummet Kanton-S hanar, men inte thatt kvinnor ökar på kvällen, även om det fanns en trend mot större variation av socialt utrymme för kvinnliga flugor på kvällen (Figur 4B). Vi har tidigare självständigt gjort samma iakttagelser 24.
Som vi tidigare rapporterat använder en Oregon-R-ledningen för att studera effekten av bisfenol A (BPA) 2, är det sociala rummet kammaren också känslig för den genetiska bakgrunden till Drosophila. Här visar vi att Elwood, en nyligen fångad vild-typ linje hade ökat socialt utrymme jämfört med Canton-S och Samarkand, men inte Oregon (Figur 5). De sociala utrymmen i Samarkand och Oregon var inte signifikant skiljer sig från varandra men båda är större än det sociala rummet Kanton-S (Figur 5). Dessa data visar att i en viss miljö, olika stammar inavlade och vildtyp har en annan social utrymme, vilket tyder på en genetisk komponent till beteendet. Den visar också att sensitivity av detta test kräver därför att flugor kan utparade i lämpliga genetiska bakgrunder före experimentera. Detta kommer att bidra till att säkerställa skillnaderna, eller omvänt likheterna, sett i det sociala rummet beror på den faktor som testas.
Figur 1. Socialt utrymme kammar komponenter och arrangemang. (A) Sociala rymdkammare av olika dimensioner kan byggas med hjälp av samma glasrutor (17,6 cm x 17,6 cm x 0,3 cm) och akryl distanser i form av rätvinkliga trianglar (med en höjd på 16,5 cm, en bas av 8,9 cm, och en tjocklek på 0,3 cm - indikeras med en liten bokstav a) och rektanglar (9 cm x 1,5 cm x 0,3 cm -. anges med en liten bokstav b) (B) Den största socialt utrymme kammaren, som beskrivs i ett lämpar sig för 30-40 flugor. Det har inre dimensioner av 16,5 cm x 16,5 cm x 14,5 cm, vilket ger en yta på 86,45 cm 2, och som leder till ett område på 2,16 cm 2 per fluga för 40 flugor. (C) En kammare storlek optimala för 20 flugor. Det har inre dimensioner 16,5 cm x 14,5 cm x 5,96 cm, vilket ger en yta på 43,25 cm 2, och som leder till ett område på 2,16 cm 2 per fluga. (D) Mindre kammare, optimalt för 15 flugor. Det har inre dimensioner 10,2 cm x 8,9 cm x 8,9 cm, vilket ger en yta på 32,45 cm 2, och leda till ett område på 2,16 cm 2 per fluga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Orientering av kammaren och gruppstorlek, men inte densitet, påverkar social utrymme. Data representeras i en lådaoch morrhår tomt på avståndet till närmaste granne i kammaren, med boxen som representerar den 1: a kvartilen (25: e procent) och 3: e kvartilen (75: e procent), linjen i rutan representerar medianen, och Tukeys whiskers . (AB) representant data visar att en ökning av antalet flugor i en kammare av samma storlek leder till stabila mätningar sociala utrymme. Grupper av 10 till 70 Canton-S manliga flugor ställdes i större vertikal sociala rummet kammaren och fick nöja sig med 30 minuter; avståndet till närmaste granne varje fluga registrerades. Grupper med mindre än 15 flugor hade betydligt mer socialt utrymme än grupper med mer än 20 flugor i den stora kammaren. (A) Grupper av 10 n = 9, 20 n = 9, 30 n = 8, 40, n = 8, Kruskal -Wallis test p <0,0001, Dunns multipla jämförelsetest: varje bokstav anger grupper statistiskt annorlunda a # b p <0,0001 (B) <./ strong> Grupper av 15 n = 6, 40 n = 8, 50 n = 5, 60 n = 6, 70 n = 5, Kruskal-Wallis test p <0,0001, en # b p <0,001. (C) När kammarens storlek justeras för att bibehålla flugan tätheten (respektive 15 i den lilla, 20 i medium eller 40 i stor kammare, varje gång vid en densitet av 2,16 cm 2 per fluga, är ingen signifikant skillnad observeras vid testning vertikalt. (D ) Men när dessa sociala kammare utrymme placeras horisontellt grupper som hade 15 eller 20 flugor hade ett större avstånd till närmaste granne, jämfört med grupper med 40 flugor (Grupper av 15 n = 3, 20 n = 4, 40 n = 4, Kruskal -Wallis test p <0,0001, Dunns multipla jämförelsetest en # b p <0,01). (E-F) Avståndet till alla flugor mättes för grupper på 15, 20 och 40 manliga Canton-S flugor placeras i både vertikalt och horisontellt orienterade kammare. Ju större mängd av flugor i kammaren, desto större avståndet till allaflugor ((E): grupper om 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis test p <0,0001, Dunns multipla jämförelsetest en # b p <0,01, (F): grupper av 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis test p <0,0001, Dunns multipla jämförelsetest en # b # c p <0,0001). Obs: (A, B och CF) visar data som erhållits i i 3 olika geografiska regioner och därmed olika laboratoriemiljö (A) Område 1: UCLA, Los Angeles, CA, (B) Region 2:. York College, NY, NY; (CF) Region 3:. Western University, London, ON Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Orientering of det sociala rummet kammaren kan användas för att styra för confounding geotaxis problem (A - C). Grupper av 40 manliga Canton-S flugor som antingen var infekterade med P. rettgeri i sju dagar eller injiceras med media som en kontroll var in i ett socialt rum kammare antingen vertikalt (A) eller horisontellt (B) placerade och fick nöja sig med 30 minuter. Avståndet till närmaste granne varje fluga registrerades. Uppgifterna finns representerade i en låda och morrhår tomt på avståndet till närmaste granne i kammaren, med boxen som representerar den 1: a kvartilen (25: e procent) och 3: e kvartilen (75: e procent), linjen i rutan representerar medianen, och Tukeys whiskers. (A) representant uppgifter visar en ökning av de sociala utrymme för flugor som är infekterade med P. rettgeri och placerades i ett vertikalt socialt utrymme kammare,jämfört med injektion med media (Wilcoxon-Rank test: varje bokstav anger grupper statistiskt annorlunda p <0,0001, n = 6) (B) Representativa data visar sociala rummet påverkas inte av P.. rettgeri infektion när flugor placeras i ett horisontellt socialt utrymme kammare (Wilcoxon-Rank test: p> 0,1, n = 5) (C) En motströms apparat användes för att bedöma klättring beteende både infekterade och mediekontroll flugor.. Infekterade flugor klättrar sämre än sina mediekontroller (flugor ~ 12 dagar gammal, graf representerar menar prestanda index ± SEM:% av flugor i övre halvan av flaskan vid 5 sek val, två tailed t-test med Welchs Correction, n = 6 av ~ 60 flugor, varje bokstav anger grupper statistiskt annorlunda p = 0,08) (D - F). vertikalt och horisontellt placerade kammare, antingen triangulära eller runda, användes för att jämföra det sociala rummet Kanton-S (CS) medsom w 1118 Cs 10 (W). Uppgifterna finns representerade i en låda och morrhår tomt på avståndet till närmaste granne i kammaren, med boxen som representerar den 1: a kvartilen (25: e procent) och 3: e kvartilen (75: e procent), linjen i rutan representerar medianen, och Tukeys morrhår. I både socialt rum kammar riktlinjer och former, w 1118 Cs 10 hade en högre grad av social utrymme än Kanton-S ((D), vertikal triangel: Kruskal-Wallis test, varje bokstav anger grupper statistiskt olika p <0,0001, (E), horisontell cirkel: Kruskal-Wallis testet, varje bokstav anger grupper statistiskt olika p <0,01). (F)) Ett motströmsanordning användes för att bedöma klättring beteende både Canton-S och w 1118 Cs 10stammar (flugor 3-5 dagar gammal, diagram representerar medel prestanda index ± SEM:% av flugor i honnörsflaska på 15 sek val). Det fanns ingen skillnad i förmåga mellan antingen Canton-S eller w 1118 Cs 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Social utrymme män ökar under kvällen. (A) representant data visar ett ökat socialt utrymme mellan manliga flugor under kvällstimmarna ("kväll" ZT 11-12, innan belysningen) jämfört med tvåtimmars timmar ("dag "ZT 4-7). Grupper av 40 Canton-S flugor och w 1118 Cs 10flugor placerades i ett socialt rum kammaren under antingen dagtid eller kvällstid och fick nöja sig med 30 minuter. Avståndet till närmaste granne varje fluga registrerades. För båda genotyper, flugor ökad social utrymme på kvällen och skillnader mellan stammarna hölls oavsett tid på dygnet (n = 6-7, Kruskal-Wallis test p <0,0001, Dunns multipla jämförelsetest: varje bokstav anger grupper statistiskt annorlunda p < 0,01). (B) När Canton-S flugor separerades genom kön endast män har visat en ökning av sociala rummet på kvällen (t p <0,01), även om en icke-signifikant trend för större intern variation ses hos kvinnor (Kruskal -Wallis testet, varje bokstav anger grupper statistiskt annorlunda p <0,0002). Uppgifterna finns representerade i en låda och morrhår tomt på avståndet till närmaste granne i kammaren, med boxen som representerar den 1: a kvartilen (25: e procent) och 3rd kvartilen (75: e procent), linjen i rutan representerar medianen, och Tukeys morrhår. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Genetisk bakgrund av flugor påverkar sociala rummet. Grupper av 40 Canton-S, Samarkand, Oregon, och Elwood flugor placerades i ett socialt rum kammare och fick nöja sig med 30 minuter. Avståndet till närmaste granne varje fluga registrerades. Fördelningarna av grupperna skiljer sig (Kruskal-Wallis test, p <0,0001), grupper som inte delar en gemensam skrivelse är mycket olika. Data är representerade i en låda och whisker pMånga av avståndet till närmaste granne i kammaren, med boxen som representerar den 1: a kvartilen (25: e procent) och 3: e kvartilen (75: e procent), linjen i rutan representerar medianen, och Tukeys whiskers (Dunnets multipla jämförelsetest, p <0,05 [d], p <0,001 [a, b, c], 3 oberoende upprepningar med 1-2 interna replikat, sådana att för Elwood och Kand n = 3, Oregon och Kanton-S n = 4 ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll var ett detaljerat förfarande för kvantifiering av sociala utrymme som beskrivs. Några viktiga åtgärder för att säkerställa experimentet lyckas är: 1) Använd alltid handskar vid rengöring och ställa upp utrustningen, för att hålla dina egna oljor och dofter från den inre kammaren av apparaten, 2) säkerställa flugor samlas minst en dag innan experimentet att minska eventuella effekter av kallt anestesi, 3) 2 timmar innan experimentet ger nya ampuller innehållande färska livsmedel för att säkerställa att flugorna inte svalt, och har rengjort sig, 4) Under dessa två timmar, låt flugorna vänja sig vid sin ny miljö, 5) notera temperatur och luftfuktighet när de utför experiment; försöka hålla dem konsekvent mellan 24-25 ° C och 50% luftfuktighet, 6) se till att inte störa de sociala kamrarna utrymme när du kör experimentet och 7) utföra experimentet vid samma tid på dagen, företrädesvis mellan Zeitgeber tid ZT4 och ZGT7.
Sociala rummet är bara beroende av tätheten av flugor i kammaren, och inte beroende av gruppens storlek, så länge det finns en minimal gruppstorlek uppfyllda.Flugor kommer att behålla samma sociala avståndet mellan sig oavsett mängden medlemmar i gruppen. Dock är avståndet till alla flugor i kammaren, som väntat, påverkas av gruppstorlek, liksom kammaren orientering. Det är viktigt att notera att trots den övergripande inriktningen är svårt att använda (flugor inte nöja lika lätt), och leder till ett minskat avstånd mellan genotyper i våra händer (figur 3D jämfört med 3E), Burg et al. 3 framgångsrikt använt en horisontell , fyrkantig kammare. I sina experiment, avståndet till närmaste grannen var mest liknar våra vertikalt orienterade social rymd resultat. Men i sin kammare, det fanns en kontinuerlig luftflöde som kan ha bidragit till flugorna sociala grupper med ett avstånd som är mest lik vår vertikala kammare i stället för vår horisontella kammare. En begränsning till att använda vertikala kamrar är förmågan att testa Drosophila som har mobiliTy nedskrivningar. Det sociala rummet kammaren kräver flugorna att vara mobil så att de kan välja på vilket avstånd från sin granne de vill vara. Om flugor var orörlig eller hade underskott på något sätt, kan de inte kunna bilda stabila grupper ordentligt i kammaren. En potentiell botemedel mot dålig förflyttning skulle vara att sedan använda horisontella kammare, eller för att ge mer tid för flugorna att lösa innan du tar bilden. Forskarna måste också bedöma klättringsförmåga och eventuella geotactic nedskrivningar av flugor för att se om den vertikala sociala rummet kammaren är lämpligt. Om det finns brister i någon av dessa, kan horisontellt placerade kammare användas för att undvika dem.
Notera om klättring aktivitet eller totalt uthållighet och hälsa flugan kommer att påverka mätning av sociala rummet, visar vi att aktiviteten eller locomotion nivåer som inte är korrelerade med sociala rummet. I en annan studie visar vi att en behandling som minskar förflyttning, (mata BPA) också minska socialspace 2. Men mutanter av rugose (en Drosophila ortolog av autism kandidatgen neurobeachin) display hyperaktivitet och ökad social utrymmet 4. Slutligen, vita muterade flugor visar en ökning av sociala rummet 1,3, utan någon ökning av rörelse eller geotaxis 18. Kort sagt, har flera kombinationer av aktivitetsnivå och social avstånd observerats hittills indikerar ingen korrelation mellan de två beteenden. Faktum är att det sociala rummet inte nödvändigtvis korrelerar med andra sociala beteenden antingen, såsom social undvikande 8,25, vilket tyder på olika underliggande neurala kretsar. Till exempel, mutanter av rugose / neurobeachin display ökad social utrymme och minskad social undvikande 4; men vitt har både ökad social utrymme, och mycket stark social undvikande 4.
Allteftersom tiden på dygnet påverkar sociala rummet, åtminstone hos män, är det critical att forskarna är medvetna om vilken tid på dagen då deras experiment utförs och ansträngningar görs för att upprätthålla en konstant tid för alla experiment. Andra överväganden som bör redovisas bland annat ålder, kön, och passande status flugorna. Vi vet att det sociala avståndet ökas i jungfru jämfört med parade individ, både för både män och kvinnor 1, och vi nu visar att män är mindre nära än honorna på kvällen (Figur 4B). Stamspecifika könsskillnader i aktivitetsnivåer av enstaka flugor under dagen har tidigare beskrivits, föreslår att män högre rörelseaktivitet på morgonen och på kvällen jämfört med dagtid kan vara relaterat till deras parningsbeteende 26,27. Men i vårt fall, är könen åtskilda, men flugorna är grupperade, och när vi mäter deras sociala rummet har flugorna avvecklas. Fujii et al. 27 rapporterar att dygnsrytmen i par manliga hållstillsammans har en oregelbunden dygnsrytm, utan tydliga toppar, när rytmen kvinnliga par likna enskilda flugor. Så, är det ökade avståndet hos män på kvällen förmodligen inte relaterad till en ökning av parningsbeteende eller specifik ökning av rörelseaktivitet, och ligger till grund för könsdimorfism av detta beteende anledning behöver utredas ytterligare.
Med detta i beaktande, bör flugor alltid separeras med sex för experimentet så skillnader i social interaktion mellan män och kvinnor kan ses. Slutligen, vi för närvarande inte vet ännu hur åldern påverkar sociala interaktioner av flugor. Därför rekommenderar vi att sociala experiment rymd utförs med flugor inte är äldre än sju dagar, och olika beteende föreställningar, inklusive klättring aktivitet är kända för att påverkas flugor mer än en vecka gammal 22.
En sista fråga för sociala rummet är de variationer som iakttas i mediansocial distans. Mätningar socialt rum togs från olika platser inklusive (Los Angeles, Kalifornien: Figur 2A; New-York, NY: Figur 2B, Figur 3D, Figur 4, Figur 5, London, ON: Figur 2C-F, Ithaca, NY: Figur 3A, B, som alla är i samma Canton-S-bakgrund). Okända variabler som inte var konstant mellan geografiska platser eller laboratoriemiljö, påverkade median social distans. Möjliga faktorer inkluderar olika livsmedel, höjd, lufttryck i sig, och förändringar i atmosfärstryck 28. Även median var inte konstant mellan olika platser inom en plats median är mycket konstant och reproducerbar; och tendenser och mönster ses i mätningarna sociala utrymme förblev densamma bland platser. Så länge som forskare upprätthålla internt konstanta förhållanden, kommer de att vara enble att upptäcka skillnader i sociala rummet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Nikon | SMZ-645 | Any other standard scope for fly handling would work |
| Small paint brushes | for pushing flies | ||
| Jazz-mix | Fisher | 33545 | any other standard drosophila food would work |
| Mini-Alarm Timer/Stopwatch | |||
| Sharpie pens | |||
| Adhesive Tape | |||
| Medium size binder clips | Staples | to hold the chambers together: 1-1/4" (32mm) medium clips with 5/8" capacity | |
| small SupportStands | Carolina | 707161 | to hold the chambers in a vertical orientation |
| Buret clamps | Carolina | 707362 | |
| Digital Camera | Nikon | Coolpix S8000 | to take the still pictures |
| small ruler | to be able to scale the picture | ||
| trifold board and white bench cover | to provide a white background, and a homogeneous light. | ||
| pounding pad | any mouse pad works. | ||
| Prism 6 | GraphPad Software Inc. | Prism 6 for Mac OS X | Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work |
References
- Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila.: measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11, 243-252 (2012).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on the behavior of Drosophila melanogaster. - Potential use of Drosophila as a model in the study of neurodevelopmental disorders. Behavioural Brain Research. , (2015).
- Burg, E. D., Langan, S. T., Nash, H. A. Drosophila social clustering is disrupted by anesthetics and in narrow abdomen ion channel mutants. Genes Brain Behav. 12, 338-347 (2013).
- Wise, A., et al. The autism candidate gene Neurobeachin (Rugose) mutants in Drosophila exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social behavior and activity patterns. J Neurosci. , 1-9 (2015).
- Parrish, J. K., Edelstein-Keshet, L. Complexity, pattern, and evolutionary trade-offs in animal aggregation. Science. 284, 99-101 (1999).
- Sokolowski, M. B. Social interactions in ‘‘simple’’ model systems. Neuron. 65, 780-794 (2010).
- Rittschof, C. C., Robinson, G. E. Genomics: moving behavioural ecology beyond the phenotypic gambit. Animal Behaviour. 92, 263-270 (2014).
- Fernandez, R. W., et al. Straightforward assay for quantification of social avoidance in Drosophila melanogaster. JoVE. (94), e52011 (2014).
- Hahn, N., et al. Monogenic heritable autism gene neuroligin impacts Drosophila. social behaviour. Behav Brain Res. 252, 450-457 (2013).
- Mogilner, A., Edelstein-Keshet, L., Bent, L., Spiros, A. Mutual interactions, potentials, and individual distance in a social aggregation. J Math Biol. 47, 353-389 (2003).
- Liu, L., Davis, R. L., Roman, G. Exploratory activity in Drosophila requires the kurtz nonvisual arrestin. Genetics. 175, 1197-1212 (2007).
- Soibam, B., et al. Open-field arena boundary is a primary object of exploration for Drosophila. Brain Behav. 2, 97-108 (2012).
- Ejima, A., Griffith, L. C. Ch. 30. Drosophila Neurobiology - A laboratory Manual., Ch. , Cold Spring Harbor Press. 475-481 (2010).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Connolly, J. B., Tully, T. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. 1, 2nd, IRL Press. 265-317 (1998).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299, 1407-1410 (2003).
- Rasband, W. S. ImageJ. , US National Institutes of Health. Maryland, U.S.A. (1997).
- Simon, A. F., et al. Drosophila, vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
- Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila .dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. JoVE. (74), e50339 (2013).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila. models of neurodegeneration. JoVE. , e2504 (2011).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Simon, A. F., Liang, D. T., Krantz, D. E. Differential decline in behavioral performance of Drosophila melanogaster. with age. Mech Ageing Dev. 127, 647-650 (2006).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. JoVE. , (2015).
- Fernandez, R. W., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Simon, A. F. 54th Annual Drosophila Research Conference, Washinton D.C., , (2013).
- Suh, G. S. B., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster.--Sex-specific differences suggest a different quality of activity. J. Biol. Rhythms. 15, 135-154 (2000).
- Fujii, S., Krishnan, P., Hardin, P. E., Amrein, H. Nocturnal male sex drive in Drosophila. Curr Biol. 17, 244-251 (2007).
- Pellegrino, A. C., et al. Weather forecasting by insects: modified sexual behaviour in response to atmospheric pressure changes. PLoS One. 8, e75004 (2013).
