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Biology

प्रतिदीप्ति लेबल नैनोकणों का उपयोग कर Murine, मानव और सुअर उत्पत्ति के जीवित कोशिकाओं में Intracellular जीन एक्सप्रेशन की जांच

Published: November 13, 2015 doi: 10.3791/53268
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 2,3, 1,4, 1,4
1Department of Cardiovascular Surgery, German Heart Center Munich, Technische Universität München, 2Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Hygiene, Technische Universität München, 3Clinical Cooperation Groups: "Antigen-specific Immunotherapy" and "Immune Monitoring", Helmholtz Center Munich (Neuhererg), Technische Universität München, 4DZHK (German Center for Cardiovascular Research) – Partner site Munich Heart Alliance
* These authors contributed equally

Introduction

2006 में, एक उपन्यास दृष्टिकोण एक pluripotent राज्य में दैहिक कोशिकाओं reprogram को वर्णित किया गया था। संभावित reprogramming की एक सरणी के prescreening बाद murine fibroblasts सफलतापूर्वक प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (आईपीएस) रेट्रोवायरल पारगमन और चार प्रतिलेखन कारक की overexpression द्वारा तथाकथित करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है कारकों (Oct4, Sox2, Klf4, सी Myc) 1। इसके बाद इस तकनीक को प्रभावी ढंग से मनुष्य 2, बंदरों 3, चूहों 4, कुत्तों 5, भेड़ 6 और सूअरों 7 सहित विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों में से दैहिक कोशिकाओं का उपयोग कर reproduced किया गया है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को छोड़ते हुए या MYC 8, 9 प्रकाशित किया गया है सी संभावित ऑन्कोजेनिक प्रतिलेखन कारक की जगह संशोधित।

भले ही प्रारंभिक reprogramming की बढ़ती कालोनियों का सच pluripotency, एक श्रमसाध्य और समय लेने वाला काम इस बात की पुष्टि हो गया है दृष्टिकोण। एक बड़ी खामीइन विश्लेषण के बहुमत की वे जीवित कोशिकाओं पर नहीं किया जा सकता है। ऐसे OCT4, Sox2, NANOG या REX1 के रूप में स्थापित pluripotency कारकों नाभिक में स्थित प्रतिलेखन कारक प्रतिनिधित्व करते हैं और उनकी पहचान आरटी पीसीआर विश्लेषण 10 के लिए immunohistochemistry या सेल करने के लिए पूर्व कोशिकाओं के निर्धारण की आवश्यकता है -। 12 इसके बाद इन कोशिकाओं को भविष्य के लिए खो रहे हैं प्रत्येक कॉलोनी के दोहराने संस्कृतियों की आवश्यकता होती है प्रयोगों।

इस प्रकार, जीवित कोशिकाओं पर pluripotency का विश्लेषण करने के लिए एक प्रौद्योगिकी अति आवश्यक है। कई दृष्टिकोण वास्तव में झिल्ली आधारित एंटीजन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग जीवित कोशिकाओं पर सीधे किया जा सकता है (उदाहरण। टीआरए-1-60, SSEA4) 12, फ्लोरोसेंट विशेष रूप से भ्रूण स्टेम लेबल जो alkaline फॉस्फेट 13 या छोटे अणुओं का पता लगाने के रंगों की सूचना दी (ते) और आईपीएस कोशिकाओं 14। हालांकि, एंटीबॉडी फिर भी प्रतिकूल कोशिकाओं और प्रत्येक मेथ प्रभावित हो सकती हैआयुध डिपो के लिए एक एकल pluripotency मार्कर के लिए प्रतिबंधित है। अंत में, फ्लोरोसेंट आणविक बीकन, कोशिकाओं का जीना धुंधला अनुमति है, जो बाल के लिये कांटा संरचनाओं, साथ दोहरे antisense oligonucleotides, 15 में वर्णित किया गया है। इस दृष्टिकोण कई जीनों को लागू किया जा सकता है, तकनीक से बढ़ आईपीएस कालोनियों के लिए लागू नहीं है, जो एक एकल कक्ष निलंबन, की nucleofection की आवश्यकता है।

कुछ साल पहले जीन विशिष्ट नैनोकणों मानव SKBR3 स्तन कैंसर की कोशिकाओं को 16 में survivin अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए वर्णित किया गया है। यह पांडुलिपि सोने nanoparticle conjugates के उपयोग के माध्यम से लाइव ते और आईपीएस कोशिकाओं में pluripotency मार्कर का पता लगाने के लिए एक उपन्यास नवीन दृष्टिकोण का वर्णन है। ये नैनोकणों पूरक आरएनए अनुक्रम और एक Cy3 लेबल संवाददाता किनारा लेकर जा रही एक युग्मित कब्जा किनारा के साथ एक केंद्रीय सोने के कण से मिलकर बनता है। संवाददाता कतरा के फ्लोरोसेंट संकेत केंद्रीय सोने के कण से बुझती है। इसके अलावा, उचितनैनोकणों के रूप में नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण, क्रमशः (चित्रा 1) सेवा करते हैं। (चित्रा 3) एक आवेदन के लिए नैनोकणों बस संस्कृति के माध्यम से (चित्रा 2) से जुड़ जाते हैं और endocytosis के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश। लक्ष्य शाही सेना व्यक्त किया जाता है, तो यह तो एक फ्लोरोसेंट संकेत उत्सर्जन करता है जो रिपोर्टर कतरा विस्थापित। इस विधि लक्ष्य सेल और लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के हेरफेर जीवित कोशिकाओं में सीधे एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे ऑप्टिकली नजर रखी जा सकती आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, प्रौद्योगिकी आईपीएस कोशिकाओं के मामले में प्रजातियों भर में किसी भी वांछित लक्ष्य जीन के लिए लागू किया जा सकता है और इस तरह के कई अलग अलग क्षेत्रों में अनुसंधान नियोजित किया जा सकता है। अंत में, प्रवाह cytometric Cy3 सकारात्मक कोशिकाओं की पहचान और संवर्धन की अनुमति देने का विश्लेषण करती है।

Protocol

मीडिया, अभिकर्मकों और सेल संस्कृति शर्तों के 1. तैयारी

  1. मानव HEK 293 भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं
    1. DMEM / हाम एफ 12 के माध्यम में संस्कृति HEK 293 कोशिकाओं (सीआरएल-1573, ATCC) 5% एफसीएस, एल glutamine (2 मिमी), और पेनिसिलिन (100 यू / एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक।
    2. कोशिकाओं पारित होने के लिए, पीबीएस के साथ एक बार धोने कोशिकाओं 0.05% / trypsin EDTA जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण, 1,200 आरपीएम (300 x जी) और 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज एक ताजा T25 संस्कृति फ्लास्क में लगभग 5x10 5 कोशिकाओं को हस्तांतरण।
  2. Murine भ्रूण (MEFs) fibroblasts
    1. अलग-अलग 6 कुओं के लिए एक 0.1% जिलेटिन समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सेते हैं। आरटी पर महाप्राण तरल और दुकान उपयोग करें जब तक।
    2. DMEM में संस्कृति MEFs 10% एफसीएस, एल glutamine (2 मिमी), एल ग्लूकोज (4.5 ग्राम / एल), सोडियम पाइरूवेट (1 मिमी), और पेनिसिलिन (100 यू के साथ पूरक /जिलेटिन लेपित 6 अच्छी तरह प्लेटों पर एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल)।
    3. 6 अच्छी तरह प्लेटों में MEFs बांटो और उन्हें संगम तक बढ़ता है। 2.5 घंटा कोशिकाओं को गिरफ्तार करने के लिए mitomycin (5 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें। महाप्राण मध्यम, पूरा MEF मध्यम के साथ दो बार कोशिकाओं को धोने और प्रत्येक 6 अच्छी तरह से करने के लिए 3 एमएल MEF मध्यम जोड़ें। इन कोशिकाओं को murine और सुअर आईपीएस कोशिकाओं के लिए एक फीडर परत के रूप में काम करते हैं।
  3. Murine ते और आईपीएस कोशिकाओं की संस्कृति
    1. 15% एफसीएस, एल glutamine (2 मिमी), एल ग्लूकोज (4.5 ग्राम / एल), सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड (1X), β-mercaptoethanol (0.1 मिमी) के साथ DMEM माध्यम के पूरक, माउस ते संस्कृति के माध्यम से तैयार करने के लिए और ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (1.000 यू / एमएल)।
    2. , सीरम मुक्त DMEM के साथ एक बार विकास को गिरफ्तार कर लिया MEFs के साथ 6 कुओं कुल्ला 2 मिलीलीटर माउस ते मध्यम और murine आईपीएस कोशिकाओं (एक मिला हुआ पकवान की कोशिकाओं का 20%) जोड़ें। हर दिन धोने कोशिकाओं को एक बार सीरम मुक्त DMEM के साथ और 2 मिलीलीटर ताजा माउस ते माध्यम जोड़ें।
    3. कोशिकाओं पारित होने के लिए, अच्छी तरह से सीरम मुक्त DMEM के साथ एक बार प्रत्येक धोने, 0 जोड़ने0.25% trypsin / EDTA और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं। 1,200 rpm पर 5 मिनट के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब, अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं स्थानांतरण (300 x जी), resuspend 500 μl माउस ते माध्यम से कोशिकाओं और एक के साथ एक ताजा 6 अच्छी तरह से में 2 मिलीलीटर माउस ते मध्यम करने के निलंबन के 100 μl जोड़ने MEF फीडर परत।
  4. सुअर की संस्कृति कोशिकाओं आईपीएस
    1. सुअर आईपीएस मध्यम तैयार करने के लिए पूरक DMEM / हाम एफ 12 मध्यम 20% नॉकआउट सीरम, एल glutamine (2 मिमी), सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड (1X), β-mercaptoethanol (0.1 मिमी), और पेनिसिलिन (100 साथ यू / एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (/ एमएल 100 माइक्रोग्राम)। 2 से 3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर और दुकान के माध्यम से फिल्टर। पहली बार उपयोग करने पर, bFGF (10 एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
    2. सीरम मुक्त DMEM / हाम एफ 12 और जोड़ने 1.5 मिलीलीटर सुअर आईपीएस मध्यम और सुअर का आईपीएस कोशिकाओं (एक मिला हुआ पकवान की कोशिकाओं के 10%) के साथ एक बार विकास को गिरफ्तार कर लिया MEFs के साथ 6 कुओं कुल्ला। सीरम मुक्त DMEM के साथ एक बार हर दिन धोने कोशिकाओं / हाम एफ -12 और जोड़ने 1.5 मिलीलीटर ताजा सुअर आईपीएस मध्यम।
    3. हदबंदी बफर 2.5% ट्रिप्सिन, collagenase चतुर्थ (10 मिलीग्राम / एमएल), सीए 2 + मुक्त पीबीएस को पीटा सीरम (20%) और 2 CaCl (1 मिमी) जोड़ने के लिए तैयार है। पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए हदबंदी बफर के साथ सेते हैं। 1,200 आरपीएम (300 x जी) पर 5 मिनट के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब, अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं स्थानांतरण।
    4. 500 μl ताजा सुअर आईपीएस माध्यम में सुअर का आईपीएस कोशिकाओं Resuspend और एक MEF फीडर परत के साथ एक ताजा 6 अच्छी तरह से में 1.5 मिलीलीटर सुअर आईपीएस मध्यम करने के निलंबन के 50 μl जोड़ें। हर दिन धोने कोशिकाओं को एक बार सीरम मुक्त DMEM / हाम एफ 12 और जोड़ने 1.5 मिलीलीटर ताजा सुअर आईपीएस माध्यम के साथ।
  5. मानव आईपीएस कोशिकाओं की फीडर मुफ्त संस्कृति
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर तहखाने झिल्ली तैयारी युक्त मूल शीशी पिघलना और आगे उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा सीरम मुक्त DMEM / हाम एफ-12-8 मिलीग्राम / एमएल, विभाज्य और दुकान के साथ पतला।
    2. आधार के एक विभाज्य पिघलनाजाहिर झिल्ली 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयारी और ठंडा सीरम मुक्त DMEM / हाम F12 (90 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पतला। Pipet 1 से 3 सेमी संस्कृति बर्तन में इस समाधान का मिलीग्राम और पूरी सतह को कवर किया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे ज़ुल्फ़। अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर parafilm और दुकान के साथ व्यंजन सील। सेल संस्कृति के लिए उपयोग करने से पहले तहखाने झिल्ली तैयारी के polymerization अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट या आरटी पर 3 घंटे के लिए व्यंजन सेते हैं।
    3. व्यंजन से महाप्राण मध्यम तहखाने झिल्ली तैयारी के साथ लेपित और सीरम मुक्त DMEM / हाम F-12 के साथ दो बार धो लें। संस्कृति डिश और मानव आईपीएस कोशिकाओं (एक मिला हुआ पकवान की कोशिकाओं का 10%) के लिए 1.5 मिलीलीटर E8 मध्यम जोड़ें। हर दिन धोने कोशिकाओं को एक बार सीरम मुक्त DMEM / हाम एफ 12 और 1.5 मिलीलीटर जोड़ने ताजा E8 माध्यम के साथ।
    4. कोशिकाओं पारित होने के लिए, पीबीएस के साथ दो बार व्यंजन कुल्ला और 1 मिलीलीटर पीबीएस / 0.5 मिमी EDTA जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए व्यंजन सेते हैं। एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की निगरानी करें। नोट: कालोनियों और भूख दौर शुरू करते हैंएआर वे हस्तांतरण के लिए तैयार कर रहे हैं छेद है।
    5. , तरल महाप्राण धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं 1.5 मिलीलीटर E8 मध्यम जोड़ने और अलग। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण, 1,200 आरपीएम (300 x जी) पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, 500 μl E8 मध्यम में resuspend और तहखाने झिल्ली तैयारी के साथ लेपित एक ताजा संस्कृति डिश में 1.5 मिलीलीटर E8 मध्यम करने के निलंबन के 50 μl जोड़ने ।

प्रजाति सीमाओं के पार लक्ष्य-दृश्यों के 2. डिजाइन

  1. चुनें संदर्भ मानव, murine और लक्ष्य जीन (GAPDH, NANOG, GDF3) के सुअर का सीडीएनए दृश्यों और एक CLUSTAL बहु अनुक्रम संरेखण विश्लेषण करते हैं।
    नोट: इस प्रजाति के बीच मुताबिक़ दृश्यों का संकेत होगा।
    1. निम्नलिखित कई संरेखण के लिए सेटिंग्स का उपयोग करें: (फिक्स्ड) की खाई जुर्माना 10, अंतर दंड (अलग-अलग) 5, संक्रमण भार 0, अंतर जुदाई जुर्माना सीमा 8, देरी के लिए 40% की पहचान, पुनरावृत्तियों की अधिकतम संख्या 3 प्रदर्शन करने के लिए।
  2. जांच के डिजाइन और विनिर्माण के लिए निर्माता (सामग्री की तालिका देखें) के लिए वांछित लक्ष्य दृश्यों को जमा करें।
    नोट: निर्माता तो तकनीक के साथ वांछित अनुक्रम की अनुकूलता की पुष्टि करेगा। इच्छित क्रम संगत नहीं है, तो निर्माता वैकल्पिक दृश्यों का सुझाव देगा।
    1. संभावित कब्जा किनारा दृश्यों 27 बीपी की लंबाई के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो कि मुताबिक़ क्षेत्रों सुनिश्चित करें।
      नोट: यह केवल वास्तविक सेलुलर प्रयोग एक व्यक्ति के अनुक्रम की कार्यक्षमता का एक निश्चित सबूत दे देंगे के रूप में एक चयनित लक्ष्य जीन के लिए अलग कब्जा किस्में के साथ कई नैनोकणों ऑर्डर करने के लिए सलाह दी जाती है। तीन अलग अलग नैनोकणों NANOG अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए परीक्षण किया गया है, जबकि इसलिए, GAPDH और GDF3 के लिए दो अलग-अलग दृश्यों का मूल्यांकन किया गया। उनके स्थान और सटीक दृश्यों कहीं और 17 प्रकाशित किया गया है। निर्माता व्यावसायिक रूप nanop विनिर्माणवांछित दृश्यों के साथ लेख और lyophilized प्रारूप में उन्हें प्रदान करता है।

3. नैनोकणों के पुनर्गठन और सेल संस्कृतियों के अलावा

  1. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त होने पर lyophilized नैनोकणों स्टोर।
  2. 100 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता देता है, जो 50 μl दोहरा आसुत जल के अलावा द्वारा नैनोकणों Reconstitute। एक बार अंधेरे में आरटी पर दुकान नैनोकणों पुनर्गठन किया। नोट: इस शर्त के तहत वे कम से कम एक साल के लिए स्थिर रहे हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर पुनर्गठन के नमूनों का संग्रहण पर प्रतिकूल अपनी स्थिरता को प्रभावित कर सकता है।
  3. आवेदन के दिन 2 (HEK 293 कोशिकाओं) या 8 एनएम (आईपीएस और ते कोशिकाओं) की एकाग्रता के लिए पीबीएस के साथ nanoparticle शेयर समाधान प्री-पतला। नोट: यह एकाग्रता संस्कृति डिश में अंतिम एकाग्रता से अधिक 20 गुना है। ES कोशिकाओं और आईपीएस कोशिकाओं में, नैनोकणों के 400 बजे खुर्दबीन के नीचे आसानी से detectable एक फ्लोरोसेंट संकेत प्रेरित किया। HEK 293 कोशिकाओं के लिए, एसी100 बजे के oncentration पर्याप्त है।
  4. 24 अच्छी तरह से युक्त 237.5 μl पूरा सेल संस्कृति के माध्यम से prediluted नैनोकणों के pipet 12.5 μl। विभिन्न आकार के कुओं के लिए, तदनुसार संस्करणों को समायोजित। नैनोकणों के समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए सावधानी से भंवर थाली। एक humidified वातावरण में सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (हे / एन) कोशिकाओं को सेते हैं और 5%।
  5. एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे - अगले दिन 546 एनएम (640 एनएम उत्सर्जन 575) के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ जीन विशिष्ट Cy3 प्रतिदीप्ति के लिए सेल संस्कृतियों का विश्लेषण। नोट: सेल प्रकार और लक्ष्य जीन पर निर्भर हो सकता है एक पर्याप्त मजबूत प्रतिदीप्ति प्राप्त करने के लिए आवश्यक अवधि। इन प्रयोगों में, यह जांच के आवेदन के बाद 16 और 20 घंटे के बीच में देखा गया था।

फ्लो द्वारा 4. पहचान Cy3 के सकारात्मक सेल आबादी

  1. HEK 293 या धारा 1.1 या 1.3 में निर्दिष्ट शर्तों का उपयोग murine ES कोशिकाओं, आर बढ़ोespectively। प्रायर FACS विश्लेषण करने के लिए एक दिन ES कोशिकाओं murine के लिए 293 कोशिकाओं (चित्रा 6A देखें) और 400 बजे हेक करने के लिए अलग सांद्रता में GAPDH -specific नैनोकणों जोड़ें। एक humidified वातावरण में सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हे / एन सेते हैं और 5%।
  2. एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत जीन विशिष्ट Cy3 प्रेरित प्रतिदीप्ति के लिए सेल संस्कृतियों का विश्लेषण करें।
  3. बिंदु 1.1.2 के तहत निर्दिष्ट के रूप में HEK 293 कोशिकाओं को अलग करें। अपकेंद्रित्र, 200 μl ठंडा पीबीएस / 0.5% बीएसए / 2 मिमी EDTA (FACS बफर) में 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और resuspend में हस्तांतरण। प्रवाह cytometric विश्लेषण तक बर्फ पर अंधेरे कोशिकाओं रखें।
  4. बिंदु 1.3.3 के तहत निर्दिष्ट के रूप में murine ES कोशिकाओं को अलग करें। अपकेंद्रित्र, 200 μl ठंडा पीबीएस / 0.5% बीएसए / 2 मिमी EDTA में एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और resuspend में हस्तांतरण। प्रवाह cytometric विश्लेषण तक बर्फ पर अंधेरे कोशिकाओं रखें।
  5. Propidium आयोडाइड सेल एकत्रीकरण को रोकने और जोड़ने के लिए एक 30 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम कोशिकाओं प्रेस (2 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) 2 मिनटFACS विश्लेषण करने से पहले मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए।
  6. पहले एफएससी-ए / एसएससी-एक सबसेट पर श्रेणीबद्ध फाटकों सेट Cy3 पॉजिटिव कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए, एफएससी-एच / FSC डब्ल्यू-सबसेट और एसएससी-एच / एसएससी-डब्ल्यू सबसेट। सेल मलबे और बिखरे हुए नहीं हैं कि कोशिकाओं को बाहर करने के लिए आगे और पक्ष बिखराव का प्रयोग करें। पीई टेक्सास रेड के खिलाफ पीई प्रदर्शित उनकी propidium आयोडाइड धुंधला द्वारा मृत कोशिकाओं को बाहर निकालें। Cy3 पीई सकारात्मक कोशिकाओं पर अंतिम क्रमबद्ध गेट प्रदर्शन करना (चित्रा 4)।

Representative Results

नैनोकणों का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं में विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति के intracellular का पता लगाने की पुष्टि करने और स्थापित करने के लिए एक पहला प्रयास में हम मानव HEK 293 कोशिकाओं में एक अनिवार्यता से व्यक्त घर कीपिंग जीन (GAPDH) का उपयोग पायलट प्रयोगों का संचालन करने का निर्णय लिया। इन प्रयोगों में इस्तेमाल नैनोकणों की एकाग्रता निर्माता की सिफारिश के अनुसार चुना गया था। हे / एन ऊष्मायन (चित्रा 5 ए) के बाद एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे दिखाई दे रहा था जो इन कोशिकाओं में एक स्पष्ट Cy3 प्रतिदीप्ति प्रेरित एक 100 बजे अंतिम एकाग्रता में संस्कृति के माध्यम से एक GAPDH विशिष्ट जांच के अलावा। दो नियंत्रण परिणाम को पुष्ट करने के लिए इन प्रयोगों में शामिल थे। एक नियंत्रण रिपोर्टर कतरा स्तनधारी या कोशिकाओं में एक मेल अनुक्रम के पास नहीं है, जहां एक तथाकथित "हाथापाई" nanoparticle के शामिल हैं। "हाथापाई" nanoparticle unspecific पृष्ठभूमि fluorescen निर्धारित करता हैसंभव जांच गिरावट या प्रतिदीप्ति की अधूरी शमन के कारण सीई। हाथापाई जांच के अलावा नगण्य है, जो एक ही सीमांत फ्लोरोसेंट संकेत, (चित्रा 5 ब) का उत्पादन किया। एक स्थायी रूप से fluorescing "तेज" नियंत्रण विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच भिन्न हो सकते हैं जो endocytosis द्वारा नैनोकणों शामिल करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का निर्धारण करने में मदद करता है। इन सकारात्मक नियंत्रण कणों HEK 293 कोशिकाओं (चित्रा 5C) में एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट संकेत का उत्पादन किया। इस प्रकार, एक नगण्य पृष्ठभूमि संकेत के साथ एक intracellular जीन की एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट संकेत रिकॉर्ड करने के लिए प्रौद्योगिकी की व्यवहार्यता की पुष्टि की थी। यह पृष्ठभूमि संकेत और विशिष्ट प्रतिदीप्ति के बीच अंतर समय के साथ कम हो जाती है कि उल्लेख किया जाना चाहिए। विशिष्ट प्रतिदीप्ति धीरे-धीरे (चित्रा 5 डी) fades, जबकि गिरावट या अधूरा शमन की जांच के लिए कारण पृष्ठभूमि बढ़ जाती है। एक ही GAPDH -specific नैनोकणों हैmurine, सुअर और ovine मूल 17 के प्राथमिक fibroblast संस्कृतियों में परीक्षण किया गया। लक्ष्य विशिष्ट प्रतिदीप्ति संभवतः कारण इन संस्कृतियों की अपेक्षाकृत कम proliferative क्षमता के लिए, बल्कि कमजोर है, जबकि इन कोशिकाओं HEK से 293 कोशिकाओं में एक बहुत उच्च पृष्ठभूमि संकेत उत्पादन।

ये पायलट प्रयोगों विभिन्न प्रजातियों में से निकाली गई आईपीएस में pluripotency जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस तकनीक का उपयोग करने के लिए हमें प्रेरित किया। इस प्रयोजन के लिए NANOG और GDF3 pluripotent कोशिकाओं 18 में व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है, जो दोनों के विश्लेषण किया गया। एक Nkx2.5 हृदय बढ़ाने ट्रांसजेनिक माउस लाइन 19 की पूंछ की नोक fibroblasts से ली गई पहली आईपीएस कोशिकाओं पर जांच की गई। एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत प्राप्त हुई थी दोनों जीन (चित्रा 6A) और हाथापाई नियंत्रण का एक नगण्य Cy3-प्रतिदीप्ति के लिए (डेटा) नहीं दिखाया। इसी तरह के परिणाम मानव और सुअर आईपीएस कोशिकाओं (चित्रा 6 पर प्राप्त किया गयाबी और सी)। महत्वपूर्ण बात है, प्रतिदीप्ति संकेत आईपीएस कालोनियों के लिए प्रतिबंधित किया गया था और माउस और सुअर का आईपीएस (चित्रा 6A और सी में तीर देखें) के लिए एक फीडर परत के रूप में इस्तेमाल किया fibroblasts लेबल नहीं था। NANOG जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण भी सिलिको में भविष्यवाणी नहीं हर अनुक्रम अंत में कार्यात्मक है "अच्छा" होने का पता चला। इसी तरह का एक परिणाम मानव और सुअर का मूल के आईपीएस कोशिकाओं पर प्राप्त हुई थी murine आईपीएस कोशिकाओं में एक 100% अनुक्रम मैच (चित्रा 6D)। के बावजूद हाथापाई नियंत्रण के बराबर लगभग कोई फ्लोरोसेंट संकेत प्रेरित एक NANOG -specific नैनोकणों के तीन डिजाइनों में से एक इस जांच के साथ (डाटा) नहीं दिखाया। इस प्रकार, नैनोकणों हर एक के लिए बनाया गया जांच की कार्यक्षमता पहले से मूल्यांकन करने की जरूरत है, जबकि प्रजातियों सीमाओं के पार pluripotency जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

सीटू के आशाजनक परिणामसेल संस्कृति बर्तन में जीवित कोशिकाओं की लेबलिंग फ्लो द्वारा मात्रात्मक जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए हमें प्रेरित किया। यह अंत करने के GAPDH -specific नैनोकणों लक्ष्य सेल आबादी के भीतर लेबलिंग दक्षता तुलना करने के क्रम में 293 monolayers हेक वर्गीकृत सांद्रता में जोड़ा गया था। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन के रूप में एक बढ़ाया Cy3 प्रेरित प्रतिदीप्ति नैनोकणों प्राप्त नहीं किया है, जो कोशिकाओं की तुलना में सबसे कम एकाग्रता के साथ देखा गया था। नैनोकणों की सांद्रता में वृद्धि सीटू (चित्रा 7A) में HEK 293 कोशिकाओं का एक स्पष्ट रूप से एकाग्रता निर्भर प्रतिदीप्ति प्रेरित किया। एक प्रवाह cytometric विश्लेषण करने के लिए इन कोशिकाओं Subjecting एकाग्रता निर्भर लेबलिंग दक्षता की पुष्टि की। नैनोकणों के सर्वोच्च एकाग्रता (चित्रा 7B) लागू किया गया था जब Cy3 सकारात्मक कोशिकाओं की आवृत्ति काफी (सात गुना से अधिक) की वृद्धि हुई। Nkx2.5 हृदय से आगे के प्रयोगों में ES कोशिकाओंबढ़ाने ट्रांसजेनिक माउस लाइन 19 फ्लो द्वारा pluripotency जीनों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। सकारात्मक तेज नियंत्रण के 400 प्रधानमंत्री के साथ पायलट प्रयोगों खुर्दबीन के नीचे स्पष्ट रूप से Cy3 सकारात्मक लाइव ते कालोनियों झुकेंगे और cytometry Cy3 सकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 7C) का लगभग 40% का पता चला प्रवाह। इसके विपरीत, अनुपचारित कोशिकाओं के लिए तुलनीय हाथापाई दाग सकारात्मक साथ इलाज किया कोशिकाओं का लगभग 0.1% (डेटा) नहीं दिखाया। इसी GAPDH, Nanog और Gdf3 के लिए विशिष्ट नैनोकणों के अलावा सेल संस्कृति डिश में अलग-अलग कालोनियों में एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति संकेत प्रेरित किया। फ्लो द्वारा निर्धारित रूप में GAPDH के लिए Cy3 सकारात्मक कोशिकाओं की आवृत्ति दोनों pluripotency जीन (चित्रा 7 सी) के लिए देखा है कि के बराबर था। Nanog और Gdf3 भी pluripotent ES कोशिकाओं में रचनात्मक रूप में व्यक्त किया जा लगा रहे हैं, क्योंकि यह परिणाम expectable है। इस प्रकार, इन आंकड़ों में स्पष्ट रूप से भारतीयोंएक विशेष जीन व्यक्त कोशिकाओं प्रवाह cytometric से पहचाना जा सकता है कि केट गुणात्मक और उनके रिश्तेदार राशि से, विश्लेषण करती है।

चित्र 1
चित्रा 1: नैनोकणों की संरचना की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक जीन विशिष्ट nanoparticle की (ए) संरचना। (बी) हाथापाई nanoparticle (नकारात्मक नियंत्रण)। (सी) तेज nanoparticle (सकारात्मक नियंत्रण)। विले से अनुमति के साथ reprinted, लाम एट अल। 17 से अनुकूलित।

चित्र 2
चित्रा 2: नैनोकणों के आवेदन संस्कृतियों सेल नैनोकणों की एक ठीक से पतला समाधान के लिए बस संस्कृति माध्यम में pipetted है।। बाद ओ / एन ऊष्मायन जीन विशिष्ट फ्लोरोसेंट कोशिकाओं वायुसेना के तहत दिखाई दे रहे हैं luorescent माइक्रोस्कोप।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Endocytosis के माध्यम से कोशिकाओं द्वारा नैनोकणों के सक्रिय तेज (ए) कोशिकाओं को सक्रिय endocytosis द्वारा नैनोकणों निमग (बी) के लक्ष्य mRNA कब्जा कतरा को बांधता है और fluorescing संवाददाता विस्थापित।।

चित्रा 4
चित्रा 4: फ्लो के लिए gating रणनीति। (ए) रणनीति murine ES कोशिकाओं के लिए HEK 293 कोशिकाओं। (बी) रणनीति के लिए। डेटा murine ES कोशिकाओं के लिए HEK 293 कोशिकाओं या डिवाइस 2 के लिए डिवाइस 1 का उपयोग कर हासिल किया गया और बाद में एक सॉफ्टवेयर उपकरण (सामग्री की तालिका देखें) द्वारा विश्लेषण किया गया।

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चित्रा 5:। HEK 293 कोशिकाओं में GAPDH -expression के विश्लेषण से एक GAPDH -specific nanoparticle 100 बजे (अंतिम एकाग्रता) में कोशिकाओं को जोड़ा गया और प्रतिदीप्ति हे / एन ऊष्मायन के बाद दर्ज किया गया था (ए) GAPDH -specific nanoparticle (बी।। ) हाथापाई (नकारात्मक नियंत्रण)। (सी) तेज (सकारात्मक नियंत्रण)। (डी) हाथापाई और तेज नियंत्रण की काइनेटिक्स। प्रतिदीप्ति GAPDH -specific नैनोकणों के अलावा के बाद संकेत दिया समय अंक पर निर्धारित किया गया था। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 6
चित्रा 6:। विभिन्न प्रजातियों के 400 बजे कोशिकाओं के लिए जोड़ा गया था NANOG या GDF3 लिए नैनोकणों विशिष्ट आईपीएस कोशिकाओं में pluripotency जीन एक्सप्रेशन का विश्लेषण (अंतिम concentration) और प्रतिदीप्ति हे / एन ऊष्मायन के बाद दर्ज किया गया था। (ए) Murine आईपीएस कोशिकाओं। (बी) मानव आईपीएस कोशिकाओं। (सी) सुअर आईपीएस कोशिकाओं। (ए) और (सी) में तीर लेबल हटाया fibroblast फीडर परत की कोशिकाओं को नामित। Murine आईपीएस कोशिकाओं में (डी) प्रतिदीप्ति NANOG डिजाइन SF3 nanoparticle के अलावा के बाद। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 7
चित्रा 7: Nanoparticle लेबल लाइव प्रकोष्ठों फ्लो से पहचाना जा सकता है। प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित Cy3 सकारात्मक कोशिकाओं (ए) 293 कोशिकाओं नैनोकणों के विभिन्न सांद्रता के अलावा के बाद Cy3 सकारात्मक HEK की सूक्ष्म दृश्य। (बी) आवृत्ति। (सी) murine ते सेल कालोनियों का लाइव धुंधला और Cy3 सकारात्मक की आवृत्ति के निर्धारण कोशिकाओं। नैनोकणों जोड़ा गया था400 बजे के अंतिम एकाग्रता में। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Discussion

वर्तमान कार्य सीधे एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे विविध histogenetic मूल के साथ अलग स्तनधारी प्रजातियों में से जीवित कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर जीन की अभिव्यक्ति का विश्वसनीय मूल्यांकन की अनुमति है जो प्रतिदीप्ति लेबल नैनोकणों के उपयोग का वर्णन। यह दृष्टिकोण अन्य प्रकाशित तरीकों की तुलना में लाभ की एक जोड़ी है। सभी शोधकर्ता का पहला लक्ष्य जीन या सेल प्रकार या तो सम्मान के साथ सीमित नहीं है। सभी प्रतिरक्षी आधारित तरीकों का पता लगाने के लिए एक एकल मिलान करने के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं। फ्लोरोसेंट आणविक बीकन भी जीन की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए तैयार किया जा सकता है, इस विधि कोशिकाओं और बाद में nucleofection 15 की हदबंदी की आवश्यकता है। इसके विपरीत, जीन विशिष्ट नैनोकणों के आवेदन को सक्रिय रूप से endocytosis द्वारा नैनोकणों समाई है जो लक्ष्य सेल के किसी भी हेरफेर की आवश्यकता नहीं है। बाद में passaging के दौरान सोने के कणों धीरे-धीरे कोशिकाओं को छोड़ने और संस्कृति downstrea में इस्तेमाल किया जा सकतामीटर प्रयोगों।

फिर भी, तकनीक भी अभी भी कुछ सीमाएं हैं। कुछ मार्कर के कारण इस तरह के SSEA -1 या टीआरए-1-81 के रूप में 20 उनके कार्बोहाइड्रेट प्रकृति को स्पष्ट रूप से पहचाने जाने नहीं हैं। वर्तमान में, नैनोकणों के एक बड़े सरणी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है। इन कणों सेलुलर प्रयोगों में उनकी कार्यक्षमता के लिए pretested कर दिया गया है। वर्तमान कार्य के उद्देश्य प्रजातियों सीमाओं के पार इस्तेमाल किया जा सकता है, जो अनुकूलित जांच करने के लिए डिजाइन किया गया था। एक उपन्यास लक्ष्य जीन एक के लिए एक जांच डिजाइन जब इस तरह के एक दृष्टिकोण के बाद या जब सिलिको में एक की कार्यक्षमता की जांच अच्छी तरह से इन विट्रो में मूल्यांकन किया जाना चाहिए भविष्यवाणी की है कि बारे में पता होना चाहिए। NANOG-SF1 एक murine में बेमेल का आधार है और सुअर का अनुक्रम के साथ एक अच्छा प्रतिदीप्ति संकेत उत्पादन किया, जबकि अनुक्रम समरूपता के लिए एक 100% अनुरूपता पता चला है जो NANOG-SF3 जांच बिल्कुल काम नहीं किया था। एक अन्य प्रश्न के नैनोकणों कुशल तेज करने के लिए संदर्भित करता है। कणों दर्जendocytosis, नैनोकणों 21 के आकार से प्रभावित है जो एक प्रक्रिया के द्वारा कोशिकाओं, सेल प्रकार और भेदभाव का दर्जा 22 और सेलुलर क्षमता phago- प्रदर्शन और 23 macropinocytosis करने के लिए। एक संतोषजनक प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करने के लिए इष्टतम एकाग्रता प्रत्येक व्यक्ति आवेदन या सेल लाइन के लिए परीक्षण किया जाना है। कि अंत करने के लिए, पहला प्रयोग हमेशा लक्ष्य विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने पर जाने से पहले सेल प्रकार और संस्कृति की स्थिति के भीतर जांच की अनुकूलता का मूल्यांकन करने के लिए तेज नियंत्रण के आवेदन होना चाहिए।

एक उपन्यास सेल लाइन के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करने या सेल की आबादी उचित नियंत्रण का समावेश है जब एक महत्वपूर्ण बिंदु विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए। कभी fluorescing तेज नियंत्रण नैनोकणों की सांद्रता लक्ष्य सेल की आबादी में एक पर्याप्त फ्लोरोसेंट संकेत प्रेरित करेगा, जो एक संकेत प्रदान करेगा। प्रतिदीप्ति का मूल्यांकन किया जाना चाहिएघ संकेत के रूप में अगले दिन के समय 17 के साथ खत्म हो जाएगा। एक ही समय में एक समान एकाग्रता पर लागू यूकेरियोटिक जीनोम में एक समकक्ष के बिना हाथापाई नियंत्रण एक नगण्य पृष्ठभूमि संकेत के लिए प्रेरित करना चाहिए। एक तिहाई नियंत्रण के रूप में यह एक एक गृह व्यवस्था जीन के लिए विशिष्ट nanoparticle (जैसे GAPDH, β-actin) का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। ये नैनोकणों दृष्टिकोण चयनित लक्ष्य सेल की आबादी में विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं। इन पर नियंत्रण से बाहर कर देते हैं संतोषजनक एक अन्य लक्ष्य जीन के लिए विशिष्ट नैनोकणों का उपयोग कर विश्वसनीय विशिष्ट फ्लोरोसेंट संकेतों को प्राप्त करने की उम्मीद कर सकते हैं। वे लक्ष्य अनुक्रम 24 नीचे विनियमित करने के लिए दिखाया गया है के रूप में लागू नैनोकणों की एकाग्रता भी महत्वपूर्ण हो सकता है। हालांकि, इस आशय यहाँ (400 बजे) प्रस्तुत प्रयोगों में इस्तेमाल सांद्रता तुलना में बहुत अधिक सांद्रता (5 एनएम) की आवश्यकता है। इस एकाग्रता nanofla पररिस लक्ष्य जीन mRNA या प्रोटीन का स्तर और HEK293 और murine ES कोशिकाओं 17 के प्रसार को ख़राब नहीं है 2 एनएम के रूप में उच्च सांद्रता को प्रभावित नहीं करते। इसके अलावा, एक पूरे जीनोम अभिव्यक्ति विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति 25 में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन का खुलासा नहीं किया। इसलिए, 1 एनएम के लिए ऊपर सांद्रता में nanoflares किसी भी महत्वपूर्ण प्रतिकूल प्रभाव का प्रदर्शन नहीं करना चाहिए।

इस तकनीक का एक बहुत ही होनहार आवेदन एक विशेष जीन द्वारा चिह्नित किया गया है, जो किसी भी सेल की आबादी लेबल करने के लिए संभावना है। हाल ही में, जीन विशिष्ट नैनोकणों सफलतापूर्वक चुनिंदा लाइव वेंट्रिकुलर myocytes 26, मेलेनोमा कोशिकाओं 27 की उप-जनसंख्या दाग इस्तेमाल किया गया है, 28 और अनुमस्तिष्क सेल संस्कृतियों 29 monocytes। इस तरह के प्रतिदीप्ति चिह्नित सेल आबादी और हल के रूप में जीवित कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में पशु मॉडल में लाइव मेटास्टेटिक ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने की कल्पना हैसीईए की उनकी अभिव्यक्ति, जीन या लक्ष्य संरचनाओं को बढ़ावा देने के संभावित मेटास्टेसिस की खोज के लिए सबसे अधिक मूल्यवान पर आधारित है। हमने हाल ही में वास्तव में reprogrammed murine आईपीएस कालोनियों का पता चला प्रतिदीप्ति तीव्रता 17 के आधार पर Nanog -specific नैनोकणों के साथ बगल में पहचाना जा सकता है कि पता चला है। इसलिए, सही मायने में reprogrammed आईपीएस कालोनियों की पहचान के सबसे होनहार कालोनियों की पहचान करने के लिए रोबोट प्रतिदीप्ति का पता लगाने और उठा उपकरणों का उपयोग करें, जो उच्च throughput प्लेटफार्मों पर प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रौद्योगिकी के विशिष्ट सेलुलर उप-जनसंख्या का चयन करने के लिए कई शोध क्षेत्रों में उपयुक्त प्रतीत होता है और यह उच्च throughput प्लेटफार्मों में नैनोकणों लागू करने के लिए संभव लगता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं में सीधे इंट्रासेल्युलर जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए अनुमति देता है जो प्रतिदीप्ति लेबल नैनोकणों का उपयोग कर एक उपन्यास दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। यह तकनीक एक, शुद्ध विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण है और आगे चरित्र हो सकता हैकई क्षेत्रों में अनुसंधान दुर्लभ सेलुलर उप-जनसंख्या ize।

Disclosures

एच एल नि: शुल्क ईएमडी Millipore निगम से नैनोकणों प्राप्त हुआ है। अन्य सभी लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine Biochrome GmbH FG4815
Fetal calf serum Life Technologies SV30160.03
Penicillin/Streptomycin (100x) Millipore A2213
Sodium pyruvate (100x) Life Technologies 11360-039
DMEM high glucose with stable glutamine Biochrome GmbH FG0435
Mitomycin C Roche 10 107 409 001 prevents cell division of MEFs
MEM non-essential amino acids (100x) Life Technologies 11140-050
b-Mercaptoethanol Sigma M3148
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) Millipore ESG1107 growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation
0.25% Trypsin/EDTA (1x) Life Technologies 25200-056 detaches adherent cell cultures
Knockout serum Invitrogen 10828-028 supplement for human and porcine iPS cell culture
bFGF Peprotech 100-18B growth factor for human and porcine iPS cells
Collagenase IV Worthington LS004188 dissociation of pig iPS cells
Matrigel Corning 354277 effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript
E8 medium Stem Cell Technologies 05940 defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel
EDTA 0.5 M Invitrogen 15575-038
SmartFlare Probes EMD Millipore Corporation customized item detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript
Fluorescence microscope Zeiss Axiovert 200M
HeraCell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 51026282
Gelatine (from porcine skin) Sigma G6144 enhances attachment of MEFs to surface
Propidium iodide (1 mg/ml) Sigma P4864 labels dead cells in flow cytometric analyses
BD FACS Aria Illu Becton Dickinson A4544 referred to as device 1 in Figure 4
Navios Beckman Coulter 775213 referred to as device 2 in Figure 4
FloJo vX 10.0.7r2 Treestar software for analysis of flow cytometry data

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References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
  4. Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
  5. Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
  6. Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
  7. Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
  9. Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
  10. Marti, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  11. Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
  12. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  13. Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
  14. Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
  15. Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
  16. Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
  17. Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
  18. Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
  19. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  21. Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
  22. Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
  23. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nat. Mater. 13 (2), 125-138 (2014).
  24. Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
  25. Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
  26. Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
  27. Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
  28. Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
  29. Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 105 pluripotency प्रेरित स्टेम कोशिकाओं लाइव धुंधला नैनोकणों endocytosis, प्रवाह cytometry
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Lahm, H., Doppler, S. A., Dreßen, M., Adamczyk, K., Deutsch, M. A., Ulrich, H., Schiemann, M., Lange, R., Krane, M. Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles. J. Vis. Exp. (105), e53268, doi:10.3791/53268 (2015).

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