Epithelial cellerepopulationskilde og Udarbejdelse af Gnaver ekstracellulær matrix Stilladser for Renal Tissue Udvikling

Abstract

Denne protokol beskriver genereringen af ​​acellulær, endnu biofunktionelle, renale ekstracellulær matrix (ECM) stilladser, der er egnede som små modelsubstrater for orgel-skala vævsudvikling. Sprague Dawley rottenyrer kanyle ved at indsætte et kateter i den renale arterie og perfunderet med en række lav koncentration detergenter (Triton X-100 og natriumdodecylsulfat (SDS)) i løbet af 26 timer til at udlede intakte, hel-nyre stilladser med intakt perfusable vaskulatur, glomeruli og renale tubuli. Efter decellularization, er den renale scaffold anbragt i en specialdesignet perfusionsbioreaktor fartøj, og den kateter nyrearterie er forbundet til et perfusionskredsløb bestående af: en peristaltisk pumpe; rørledningen; og valgfrie prober for pH, opløst oxygen og tryk. Efter sterilisering stilladset med pereddikesyre og ethanol og balancering af pH (7,4), er nyrerne scaffold forberedt til såning via perfusion af dyrkningsmedium i et large-kapacitet inkubator holdt ved 37 ° C og 5% _CO2. Fyrre millioner renale kortikal rørformede epiteliale (RCTE) celler injiceres gennem den renale arterie, og hurtigt perfunderet gennem stilladset under højt flow (25 ml / min) og tryk (~ 230 mmHg) i 15 min før reducere strømmen til en fysiologisk sats (4 ml / min). RCTE celler primært befolker rørformede ECM niche inden for den renale cortex, formere, og danner rørformede epitel strukturer over syv dage af perfusion kultur. En 44 uM resazurin løsning i dyrkningsmedium perfuseres gennem nyrerne i 1 time under mellemstore udvekslinger til at give en fluorometrisk, redox-baserede metabolisk vurdering af levedygtighed og proliferation celle under tubulogenesis. Nyrerne perfusionsbioreaktor tillader ikke-invasiv prøveudtagning af medium til biokemisk evaluering, og flere indløbsåbninger tillade alternative retrograd podning gennem den renale vene eller ureter. Disse protokoller kan anvendes til at recellularize nyre stilladser med enrække celletyper, herunder vaskulær endotel, rørformede epitel, og stromale fibroblaster, til hurtig evaluering af dette system.

Introduction

Da antallet af patienter med slutstadiet nyresvigt fortsætter med at stige, er der en alvorlig og voksende mangel i antallet af donor nyrer rådighed til transplantation. Den manglende evne til at imødekomme efterspørgslen fra et konstant stigende antal kandidater Vent-børsnoterede for nyretransplantation har bedt forskning i nyre orgel ingeniør med det ultimative mål at udvikle skræddersyede, implantable nyre transplantater på efterspørgslen ^1,2. Opbygning fungerende nyre væv fra en patients egne celler vil eliminere behovet for livslang immunosuppression, mindske mængden af ​​tid patienter tilbringer i dialyse venter på en nyretransplantation, og udvide livreddende transplantation til flere patienter med kronisk nyresygdom.

Det første skridt mod Bioengineering en nyre vævet med patient-afledte celler er at udvikle et stillads, der fungerer som en støttende substrat for renal parenkym (f.eks rørformet epitheLiAl), stroma fibroblast og vaskulær cellevækst. Biomateriale stilladser afledt fra naturlige organ ekstracellulære matricer (ECMS) har flere egenskaber, der gør dem ønskelige til anvendelse i vævsmanipulering, herunder deres naturlige biologiske sammensætning; passende makro- og mikrostruktur at udstyre fysiologiske funktion; og cellulære biokompatibilitet, fremme celleadhæsion, migration og konstruktiv væv remodellering ^3. En lovende fremgangsmåde til fremstilling af stilladser for renal vævsregenerering er gennem decellularization af allogene eller xenogene nyrer, der bevarer en stor del af den komplekse naturlige proteinsammensætning i nyrerne ECM ^4, bevarer den iboende arkitektoniske forviklinger af organet, og overvinde vanskelighederne forbundet med bottom- up engineering af tykke cellularized væv ved at give en vaskulær forsyning til udviklingslande celler efter stillads recellularization ^5.

Perfusion decellularization er en proces,som detergenter, enzymer eller andre cellebaserede forstyrre opløsninger ensartet leveres gennem det vaskulære netværk af organet ^6. Er blevet etableret denne strategi som en effektiv proces til at udlede acellulære organ-baserede ECM scaffolds som tredimensionale (3D), biologiske skabeloner til hel-organmanipulation ^6-8, som det fremgår af udviklingen af acellulære renale skabeloner fra kasserede humane nyrer ⁹ og xenogene nyrer opnået fra store dyr (f.eks gris ^10, ged ¹¹⁾ og gnaver kilder ^12. Især anvendelsen af ​​små dyremodeller såsom gnavere kræver færre celler og dyrkningsmedier, der er specielt nyttigt for orgel recellularization undersøgelser, hvor celleantal er normalt begrænset, som det er tilfældet med stamcelle-afledte væv. Målet med den beskrevne decellularization protokollen er at fremstille en acellulær renal ECM, der kan bruges som et 3D-stilladssystem til regenerering af nyre struktues, herunder nephron tubuli, der er repopulerede i det foreliggende eksempel med human renal cortical rørformede epitelceller (RCTE) celler. Vi tidligere beskrevet vores strenge evaluering af en optimal, detergent-baserede rottenyre decellularization protokol ^7, som er hurtigere (ca. en dag) end andre metoder, der tidligere er rapporteret (Ross et al .- 5 dage ^12, Song et al .- 4,5 dage ^13), og udsætter organet til en væsentligt lavere koncentration (0,1%) af denatureringsmidlet natriumdodecylsulfat (SDS) under decellularization end tidligere rapporter ^12-15.

Et begrænset antal undersøgelser har beskrevet anvendelsen af gnaver nyrer for decellularization og efterfølgende anvendelse som en 3D-stillads for cellulær repopulation (peer andetsteds ^{1) 12-16.} I denne protokol, giver vi en detaljeret beskrivelse af vores tidligere konstaterede optimal decellularization strategi til fremstilling acellulære nyre stilladserfra Sprague Dawley rottenyrer ^7. Anvendelse af specialdesignede perfusion bioreaktorer i stand til dual såning og vedligeholdelse perfusion kultur ^17, vi recellularize de acellulære nyre stilladser med humane RCTE celler, som konsekvent genbefolke rørformede komponent i disse decellulariseret matricer, prolifererer og overleve i perfusion kultur i over en uge. Vi viser yderligere vores brug af resazurin perfusion assay - en billig, ikke-cytotoksisk, og ikke-invasiv metabolisk vurdering tidligere anvendt til Cytotoksicitetsstudier ¹⁷ - at tilvejebringe en indikation af cellelevedygtighed og proliferation inden for de recellularized nyrerne over tid ^7.

Protocol

ETIK ERKLÆRING: Alle procedurer, der involverer dyr blev udført i henhold til retningslinjer godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Northwestern University.

1. Nyre Decellularization

1. Forbered decellularization løsninger. Forbered følgende mængder af reagenser for hver nyre skal decellulariserede, plus en ekstra volumen (fx for 4 nyrer, forberede 5.000 ml Triton X-100 for trin 1.1.3.):
   1. Forbered 500 ml omvendt osmose vand (ROH ₂ O). Bemærk: Alternativt kan deioniseret vand anvendes i trin hvor ROH ₂ O er indiceret.
   2. Forbered 1000 ml Triton X-100, 1% (v / v) i ROH ₂ O. Tilsæt langsomt 10 ml Triton X-100 til 990 ml vand i et stort bægerglas under hurtig omrøring på en omrøringsplade. Tillad reagenset opløses fuldstændigt før brug (mindst 10 minutter).
   3. Forbered 1000 ml Triton X-100, 1% (v / v) i ROH ₂ O (separate volumen).
   4. Forbered 1,000 ml natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% (v / v) i ROH ₂ O. Tilsæt langsomt 5 ml SDS (20% stamopløsning) til 995 ml vand i et stort bægerglas under hurtig omrøring på en omrøringsplade. Tillad reagenset for at blande jævnt før brug (mindst 10 minutter).
   5. Forbered 500 ml ROH ₂ O (særskilt).
2. Forbered nyrer for decellularization.
   1. Gendanne en nyre fra en Sprague Dawley rotte (250-300 g) som tidligere beskrevet ^7.
      1. Bedøver rotten ved intraperitoneal injektion af pentobarbital (50 mg / kg legemsvægt). Hyppigt undersøge dybden af ​​bedøvelse (hver 10-15 min) ved at overvåge den respiratoriske funktion, puls, og tå knivspids reaktion under kirurgi. Hvis dyret har en forhøjet respirationshastighed eller positiv pedal refleks, administrere en supplerende dosis (med 1/3 til 1/4 af den oprindelige dosis), i pentobarbital.
      2. Udfør en langsgående midterlinje abdominal indsnit for at blotlægge nyrerne, abdominale aorta og vena cava inferior.
      3. Injicer 2.000 USP heparin enheder / kg legemsvægt i penis vene.
      4. Mobilisere begge nyrer ved forsigtig dissektion. Adskil forsigtigt nyre fra den perirenalt fedt, samtidig med at den renale kapsel omgiver nyren intakt. Perfundere nyrerne med koldt saltvand (10 ml) gennem infra-renal abdominal aorta.
   2. Indsæt en 24 gauge kateter ind nyrearterien, stramt ligere kateteret til arterien, og (ved hjælp af en sprøjte) forsigtigt perfundere nyrerne med 10 ml kold phosphatpufret saltopløsning (PBS) til helt klart orglet af blod.
   3. Fordybe nyre i 25 ml PBS i en petriskål og sted i en -20 ° C fryser til gradvist fastfryse organ (derved at inducere cellelysis) til opbevaring indtil decellularization.
      Bemærk: Hvis ønsket kan urinlederen og / eller renal vene også være kanylerede for retrograd podning, men ikke beskrevet i this protokol.
   4. Helt optø frosne nyre (equilibriate ved stuetemperatur (RT)), og forsigtigt perfuse med 10 ml PBS for at kontrollere det ligerede nyrearterie for utætheder. Hvis lækager eller væsentlig modstand overholdes, re-selvkaterisation nyrearterien.
3. Forbered udstyr til decellularization. Saml decellularization perfusionssystem som vist i figur 1B.
   1. Forbinde en 8 "længde peristaltisk pumpe slange (figur 1 D, f) til to tilstrækkelige længder (> 36" recommended) af 1/16 "indre diameter (ID) siliconegummirør (figur 1D, h). Bruge to han-Luer lås til 1/8 "barbed adaptere forbundet af en Luer x Luer-adapter til at slutte segmenter af rør (figur 1D, j). Indsætte en ekstra han-Luer lås til 1/8 "barbed adapter (figur 1D, c) i den nedstrøms ende af perfusionsledning til fastgørelse til den renalearterie kateter.
   2. Forbinde hver peristaltisk pumpe slangesegment til 4-valse pumpehoved hjælp af en stor pumpe patron.
   3. Efter placering den opstrøms ende af siliconegummirør i den første opløsning reservoir (ROH ₂ O), holde "Prime" -knappen for fuldt prime hver perfusionskredsløbet med opløsning. Kritisk: Kontroller, at ingen bobler forbliver indesluttet i slangen, og at den opstrøms ende (venstre åbne at trække fluid) i silikonegummi slangen er fastgjort under væskeniveauet-luftgrænseflade af reagenset reservoir, som vist i figur 1B.
4. Udfør decellularization protokollen ved RT ^7.
   1. Forbind den renale arterie kateter af hver optøet nyre til slutningen af ​​perfusionskredsløbet slangen nedstrøms fra pumpen, sikrer, at ingen luftbobler er indesluttet i kateteret. Tillad nyrerne skal suspenderes langs den indre væg af en tom 5 L bægerglas (perfusat opsamlingsreservoir, se Figure 1B), således at den renale arterie er ikke bøjet eller oprullet.
   2. Juster pumpens drev til 5 ml / min, og tryk på "Start" knappen. Bekræft, at hver nyre er perfusion ved at observere løsninger drypper fra bunden af ​​orglet.
   3. Perfundere hver nyre med følgende reagenser som beskrevet i figur 1A
      1. Perfundere med 500 ml ROH ₂ O ved 5 ml / min i 1 time, 40 min.
      2. Perfundere med 1,000 ml 1% Triton X-100 ved 5 ml / min i 3 timer, 20 min.
      3. Perfundere med 1,000 ml 1% Triton X-100 ved 1 ml / min i 16 timer, 40 min.
      4. Perfundere med 1000 ml 0,1% SDS ved 5 ml / min i 3 timer, 20 min.
      5. Perfundere med 500 ml ROH ₂ O ved 5 ml / min i 1 time, 40 min.
         Bemærk: Hver decellulariseret nyre kan opbevares i PBS (uden additiver) i en 50 ml konisk rør ved 4 ° C i maksimalt to uger før brug.

2. Perfusion bioreaktor Assembly, Nyre Sterilisation og Forberedelse til Recellularization

1. Forbered bioreaktor fartøjer.
   1. Vask glasset bioreaktor reservoirer (krop komponent) og bioreaktor hoveder med varm, fortyndet opvaskemiddel løsninger (f.eks. 1% opvaskemiddel opløsning i ledningsvand), og skyl grundigt med vand fra hanen og derefter ROH ₂ O. Lad komponenter til at tørre helt.
   2. Påfør et lille volumen (~ 5 ml) af silikonebehandling reagens til bunden af ​​hvert reservoir. Sørg for, at reagenset wets hele bunden overfladen i flere sekunder, så dræne overskydende væske.
   3. Tillad reservoirerne til tørre i et stinkskab ved stuetemperatur O / N. Alternativt kan reservoirerne tørres i en ovn ved 100 ° C i 30 min for at fremskynde tørring og forbedre holdbarheden af ​​coatingen, som er beregnet til at forhindre vedhæftning af celler til bunden af ​​glasset bioreaktoren reservoiret.
2. Forbered perfusion kredsløbskomponenter til sterilisering (figur1D).
   1. Klippe følgende længder slange (i hver bioreaktor):
      1. Skær to 25 "længder af 1/16" ID siliconegummirør (figur 1D, h).
      2. Skære en 8 "længde peristaltisk pumpe slange (figur 1 D, F).
      3. Skære en 4,25 "længde på 1/16" ID siliconegummirør.
      4. Skær to 1 "længder af tykvægget 1/16" ID siliconegummirør (figur 1D, g).
      5. Skære en 2 "længde på 1/4" ID x 0,5 'ydre diameter (OD) siliconegummirør (figur 1D, e).
   2. Forbered følgende Luer-adaptere (for hver bioreaktor):
      1. Forbered 10 han-Luer lås til 1/8 'pigtråd adaptere (figur 1D, c)
      2. Forbered 2 Luer stik (figur 1D, a)
      3. Forbered 2 Luer hætter (Figur 1D, b)
      4. Forbered 5 kvindelige Luerx Luer-adaptere (x5, figur 1D, d)
   3. Vask alle slanger og Luer-adaptere med varmt, fortyndes opvaskemiddel løsninger, skylles grundigt i vand fra hanen og derefter ROH ₂ O, og lad dem tørre.
3. Saml perfusion kredsløb.
   1. Tag 1 "længde tykvægget 1/16" ID silikonegummi slange over indløb Luer acceptor knyttet til lederen af ​​bioreaktoren. Placer han-Luer lock til 1/8 "ID barb adapteren i åbne ende af slangen. Gentag for de andre indløb Luer acceptor, og tilslut en kvindelig Luer hætte til at lukke port (beregnet til Urinleder eller venøse seeding teknikker ikke er beskrevet i denne protokol).
   2. Forbinde hver 25 "segment af 1/16" ID siliconegummirør til 8 "segment af peristaltisk pumpe rør under anvendelse Luer lås til 1/8" ID modhage og Luer x Luer-adaptere (figur 1D, j).
   3. Tilslut den ene åbne ende af silikonegummi Tubing til medierne perfusatet stikkontakt på ydersiden af ​​bioreaktoren hovedet. Tilslut 4,25 "længde af 1/16" ID slange til den modsatte (indre) side af mediet perfusatet stikkontakt på indersiden af ​​bioreaktoren hovedet.
   4. Tilslutte en han-Luer-lås til 1/8 "ID barbed adapter til den resterende åbne ende af perfusionskredsløbet slangen. Tilslut en kvindelig Luer x Luer-adapter til den mandlige Luer lock. Tilslut Luer x Luer-adapter til den åbne han-Luer lock fører ind i indløbet Luer acceptoren på bioreaktoren. Dette vil tjene som medierne perfusatet indløb fører direkte ind i kateter nyrearterie.
   5. Sikre, at ingen porte på bioreaktoren låg efterlades åbne eller udsættes. Stramt lukke vakuumventilen på bioreaktor krop.
   6. Monter bioreaktoren hovedet over reservoiret krop, med en O-ring klemt ind mellem de identiske riller foring hver komponent. Placer en metallisk klemme over grænsefladen til at holde de to komponenter sammen.
   7. Monter udluftningsporten på bioreaktoren hovedet med et 0,2 mikron udluftningsfilter, der forbinder de to komponenter ved hjælp af en 2 "længde på 1/4" ID x 0,5 'OD siliconegummirør (figur 1D, e). Åbne udluftningsventil.
   8. Løsn den røde skruelåg på bioreaktoren hovedet.
   9. Placer de resterende Luer adaptere og 6 "takkede eksemplar pincet i en autoklaverbar pose og segl.
4. Autoklaveres de forsamlede bioreaktorer og mandlige Luer stik.
5. Forbered følgende reagenser til stillads sterilisering og mellemstore perfusion før såning (mængder er angivet pr decellulariserede nyre):
   1. Inden for et stinkskab, forberede en 50 ml 0,1% pereddikesyre, 4% ethanolopløsning ved tilsætning 2,56 ml pereddikesyre opløsning (39% koncentration af stamopløsning) og 40 ml 200 proof ethanol til ~ 957 ml ROH ₂ O i en 1 L flaske. Bland grundigt ved gentagne gange at vende flasken, og placere i biologiske sikkerhed kabinet.
   2. Forbereden 150 ml 1x PBS-opløsning, præ-steriliseret ved autoklavering.
   3. Forbered 50 ml DMEM / F12-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Pen-Strep).
6. Saml de resterende elementer til perfusionsbioreaktor forsamling. Læg alle elementer i en biologisk sikkerhedsskab. KRITISK: Sørg for, at den biologiske sikkerhed fryser er udstyret med arbejder elektriske stikkontakter til magten digitale pumpe drevet. Alternativt kan du bruge en forlængerledning til at tilslutte pumpen drevet til eksterne stikkontakter uden for kabinettet.
   1. Saml decellulariserede nyrer.
   2. Saml autoklaverede bioreaktorer med vedhæftede perfusion kredsløb.
   3. Saml autoklaveret pose indeholdende Luer adaptere og pincet.
   4. Saml digital pumpe drev med vedhæftet 4-rulle hoved, og store pumpe patroner (1 pr perfusionskredsløbet).
7. Gennemfør perfusionskredsløbet som beskrevet i figur 1C under sterile cETINGELSER inden for et biologisk sikkerhedsskab.
   1. Tilslutte en 3-vejs stophane (figur 1D, i) mellem Luer lås til 1/8 "ID barb adapter nær medierne perfusatet indløbet og Luer x Luer-adapter. Lad alle tre porte på stophane åben.
   2. Fjern den røde Skruelåget på bioreaktoren hoved og pipette 50 ml af 0,1% pereddikesyre, 4% ethanolopløsning i mediet reservoiret gennem åbningen.
   3. Slut peristaltikpumpen slange segment til pumpehovedet ved hjælp af en stor pumpe patron. Juster flowet til 5 ml / min, skal du trykke på "Start", og lad kredsløbet at prime.
      1. Når væsken fylder perfusionsledning og når de resterende åbne port på tre-vejs stophane, plug porten ved hjælp af en Luer stik (figur 1D, a).
      2. Tillad kredsløbet til fuldt ud prime indtil ingen luft er observeret i perfusionskredsløbet slanger eller på indersiden af ​​indløbet Luer acceptoren. Hvis necessaRy, forøge strømningshastigheden midlertidigt at udvise bobler fra perfusionsledning. Når dyserne stoppe pumpen drev.
   4. Plug omhyggeligt Luer ende af den renale arterie kateter i mandlige indløb Luer acceptor på den indre overflade af bioreaktoren hovedet under anvendelse af de steriliserede 6 "pincet. Kontroller, at forbindelsen er stram, og at ingen luft er tilbage i kateteret. Tillad nyrerne til forsigtigt at hænge fra nyrearterie kateter, således at den renale arterie ikke bliver snoet eller knækket.
   5. Spænd metalliske klemme holder sammen bioreaktoren hoved og krop, så bioreaktoren reservoir tæt forseglet. Luk røde Skruelåget på bioreaktoren hovedet.
8. Sterilisere nyrer ved stuetemperatur ved perfusion med 0,1% pereddikesyre, 4% ethanol opløsning ved 5 ml / min i 1 time, derefter tre sekventielle 1-hr perfusioner ved stuetemperatur med 50 ml PBS ved 5 ml / min.
   1. Ændring løsninger:
      1. Efter 1 time, stoppe pumpen og åbne røde skruelåg. Ved hjælp af en sterile (autoklaveret) Pasteur pipette forsigtigt suge hele opløsningen fra bioreaktoren reservoiret. Lad perfusionskredsløbet dyserne.
      2. Pipette 50 ml frisk opløsning i bioreaktoren reservoir, lukke skruelåg, og start pumpen.
9. Efter den sidste PBS-skylning, aspireres PBS fra reservoiret og pipette i 50 ml DMEM / F12-medium suppleret med 10% FBS og 1% Pen-Strep. Luk skruelåg, og overføre bioreaktoren med vedlagte perfusionskredsløbet til en stor kapacitet inkubator holdt ved 37 ° C og 5% _CO2.
10. Hvis det er nødvendigt, overfører pumpen drevet til inkubatoren. Forbinde bioreaktor perfusionskredsløb til pumpen, og perfundere nyrerne ved 4 ml / min i mindst 1 time før podning.

3. Nyre Recellularization med Renal Kortikal tubulære epitelceller

1. Varm tilstrækkelige mængder DMEM / F12 (suppleret med 10% FBS og 1% Pen-Strep) og cell dissocierende enzym til celle løft til 37 ° C. Foreslåede mængder er angivet nedenfor:
   1. Forbered 10 ml celle dissocierende enzym og 10 ml DMEM / F12 per 175 ^cm2 kultur kolbe til løft.
   2. Forbered 5-10 ml DMEM / F12 per nyre, der skal podes.
2. Indsamle et tilstrækkeligt antal dyrkningskolber for den ønskede såning koncentration (4 x 10 ⁷ immortaliserede humane RCTE celler ¹⁸ pr nyre resulterer i maksimal inkorporering af RCTE celler ved hjælp af denne seeding strategi).
3. Lift celler fra kolberne ved hjælp celle dissocierende enzym. Aspirer medium fra kolben, så pipette 10 ml celle dissociere enzym i kolbe. Sted kolbe i 37 ° C inkubator at fremskynde dissociation.
4. Check kolbe på et fasekontrastmikroskop hver 2 min indtil fuld dissociation af celler fra kolben overflade observeres. Bemærk: Inkubationstid vil variere afhængigt af niveauet for sammenløbet af cellerne, men RCTE celler vil require ca. 15 min til fuldt dissociere.
5. Tag en prøve af dissocieret cellesuspension til optælling før pelletering. Cellesuspensionen fortyndes med et lige volumen forvarmet DMEM / F12-medium, og der centrifugeres ved 232 xg relative centrifugalkraft (RCF) i 5 min.
6. Tæl cellerne under centrifugering. Den opnåede prøve fortyndes med et lige volumen af ​​trypanblåt, og pipetten 10 pi i hver ende af et hæmacytometer til tælling. Beregn nødvendigt pellet fortyndingsvolumen at opnå den ønskede seeding fusion (2 x 10 ⁷ celler / ml).
7. Efter centrifugering fortyndes pelleten med et passende volumen dyrkningsmedium til opnåelse af en slutkoncentration på 2 x 10 ⁷ celler / ml. Udarbejde 2 ml af seeding suspension i en steril 5 ml sprøjte.
8. Overfør perfusionsbioreaktor til et biologisk sikkerhedsskab. Drej stophanen ventilen lukkes strømning til såning port. Fjern Luer slip stik frastophanen, og tilslut lastet med seeding suspension sprøjte.
9. Hurtigt overføre perfusionskredsløbet tilbage til inkubatoren, og bruge den store pumpe patronen for at fastgøre den peristaltiske pumpe slangesegment til pumpehovedet.
10. Cellepodning: Luk stophane ventilporten peger mod pumpen. Injicer langsomt cellesuspensionen i nyre, sikrer, at hele suspensionen overføres fra sprøjten ind i hanen og perfusion linje. Drej stophaneventilen at lukke strømning fra sprøjten, og start pumpen ved 25 ml / min i 15 min.
11. Efter 15 min sænke pumpens strømningshastighed til 4 ml / min. Exchange medium (100 ml volumen for efterfølgende ændringer) den følgende dag og derefter hver anden dag.

4. Evaluering af Cell Levedygtighed og spredning ved hjælp Resazurin Perfusion Assay

1. Forbered resazurin reagens. Opløs 110,5 mg resazurin natriumsalt i 100 ml PBS under omrøring, og der fortyndes 1:10 efter tilsætning af 5 ml afresulterende opløsning til 45 ml frisk PBS for at skabe en 440 uM resazurin stamopløsning. Filter-sterilisere (under anvendelse af en 0,2 um sprøjtefilter), og opbevar stamopløsning i en lys-beskyttet 50 ml konisk rør ved 4 ° C.
2. Forbered tilsætte Resazurin-suppleret medier kontroller. Der fremstilles en 10% opløsning af resazurin reagens i dyrkningsmedium (f.eks. 5 ml resazurin stamopløsning + 45 ml dyrkningsmedium) for at skabe resazurin arbejdsopløsning. Autoklavér et 10 ml volumen af ​​resazurin arbejdsopløsning i en lys-beskyttet beholder. Bemærk: Dette vil helt reducere resazurin forbindelse, resorufin, og vil fungere som en positiv kontrol for beregning af procent resazurin reduktion.
3. Alikvot 1 ml hver af resazurin arbejdsopløsning (oxideret), autoklaveret resazurin arbejdsopløsning (reduceret), og dyrkningsmedium alene (blind) i separate 1,5 ml prøveglas. Placer de åbne rør i samme inkubator som perfusion bioreaktorer.
4. Overfør nyrerne perfusionkredsløb fra inkubatoren til et biologisk sikkerhedsskab. Fjern skruelåget fra bioreaktoren hoved, og aspireres dyrkningsmedium fra bioreaktoren reservoir under anvendelse af en Pasteur-pipette.
5. Pipette 10 ml resazurin arbejder opløsningen i reservoiret tæt skruelåg og overføre nyre perfusionskredsløbet tilbage til kuvøsen.
6. Start pumpen ved 4 ml / min og tillade reagenset at perfundere gennem nyrerne i nøjagtigt 1 time.
7. Efter 1 time stoppe pumpen, og overføre nyrerne perfusionskredsløbet til biologisk sikkerhedsskab.
8. Saml den betingede (delvist reduceret) resazurin løsning, og der tilsættes 100 ml dyrkningsmedium til bioreaktoren reservoiret. Overførsel perfusionskredsløb at inkubator, og genoptage strømning (4 ml / min).
9. Tilsæt 100 pi (x 3 replikater) konditioneret resazurin opløsning, resazurin brugsopløsning, autoklaveret brugsopløsning, og dyrkningsmedier blank til en sort (uigennemsigtig) 96-brønds assay-plade. Læs fluorescensintensitet (excitation: 540/35; emission: 590/20) ved hjælp af et spektrofotometer.
10. Beregn procent reduktion i forhold til fluorescensintensiteter normaliseret ved fluorescensintensitet (FI), der genereres af det oxiderede resazurin medium (ORM eller resazurin arbejdsopløsning ikke er udsat for celler) eller den reducerede resazurin medium (RRM, eller autoklaveret brugsopløsning):% reduktion = 100 x {[FI (betinget resazurin opløsning) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. At normalisere resultater, formere% reduktion ved cirkulerende mængde (10 ml) og dividere med inkubationstid (1 time).

Representative Results

Nyrer sekventielt perfunderet med vand og fortyndet detergentopløsninger (1% Triton X-100, 0,1% SDS) ifølge en tidligere konstaterede optimal decellularization protokollen (se figur 1A, B) ^7, bliver gradvist mere gennemsigtig over en 26 timers periode, som vist i figur 2A. Den resulterende acellulære nyre stillads er blottet for celler og bibeholder en sammenhængende renal ECM understøttet af en intakt renal kapsel, som er ubeskadiget efter perfusion protokol. Som den endelige detergent perfusion (SDS), nyrens vaskulære netværk, og navnlig interlobar fartøjer, er synligt i den decellulariserede stillads, på grund af den større tykkelse af disse blodkar i forhold til den forholdsvis tynde basalmembran af nephron tubuli ( se figur 2A, B). Hele organet ryddes for medfødte celler og efterlader det intakte basalmembran netværk af glomeruli, tubuli, og colat der er valgt kabelkanaler, og ECM af decellulariserede blodkar, herunder intern og ekstern elastisk lag af corticale interlobulære arterier (se figur 2B, C). Ud over de større fartøjer, de mikrovaskulære basalmembraner inden glomeruli også bevarer strukturel integritet (se figur 2B, C).

Decellulariserede nyrer opbevares i PBS ved 4 ° C for at begrænse den naturlige hydrolytiske nedbrydning af renal ECM, og bør anvendes inden for 2 uger decellularization. Vi har tidligere beskrevet detaljeret udformningen af en brugerdefineret perfusion baseret nyre bioreaktor, der bruges til både såning decellulariserede gnaver nyre stilladser, og langvarig kultur recellularized organer under flow ^17. For recellularization, en perfusionskredsløb sammensat af lille diameter silikonegummi og træthed-resistente Pharmed pumpe rør benyttes til at føre dyrkningsmedium fra bioreaktoren reservoir, til en peristaltisk pumpe, ogtilbage til indløbet Luer acceptor, som det kateter nyrearterie er forbundet ved den indre flade af bioreaktoren hovedet (se figur 1C). Efter at sterilisere decellulariserede nyre ved perfusion med en pereddikesyre / ethanol-blanding, er perfusionssystemet prepped til såning ved cirkulation standard dyrkningsmedium (indeholdende 10% FBS for at forbedre celle-ECM adhæsion) gennem stilladset i inkubatoren.

De decellulariseret nyrer kan nu tjene som acellulære ECM skabeloner til recellularization, som vi tidligere har udført ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller celle-afledte endotelceller for revaskularisering ^7. Her vil vi demonstrere anvendeligheden af ​​denne stillads og perfusionsbioreaktor system til tubulogenesis hjælp humant afledte renale kortikale rørformet epiteliale (RCTE) celler. RCTE celler podes i nyre stilladser gennem den renale arterie under en højtryks-perfusion protokol der er blevet beskrevet tidligere ⁷, 17 .RCTE celler infunderes på denne måde hjem primært til det kortikale regioner i nyren, hvor de fortrinsvis genbefolke de periglomerular tubuli (se figur 3A). Få celler indkapsle inden glomeruli på dag 1 efter podning, og ved dag 7, glomeruli er næsten blottet for celler. Under perfusion kultur, er mediet skiftet hver 2 dage, på hvilket tidspunkt resazurin perfusion assayet samtidigt udføres for at tilvejebringe sammenlignende vurdering af cellelevedygtighed over tid (se figur 3B). Som understøttes af resultaterne resazurin reduktion, RCTE celler formere i 3D ECM, danner stramt organiseret, patent rørformede strukturer ved dag 7. Mens størstedelen af ​​disse celler besætte kortikale regioner i renal ECM, efter 7 dage fremadrettet perfusion kultur mange RCTE-foret tubuli er til stede i den ydre medullære og papillære tubuli og samlekanalerne (se figur 4). Efter repopulation med RCTE celler og en uge prfusion kultur, gennemsigtigheden observeret efter decellularization er tabt, og recellularized nyre vises uigennemsigtig og tættere i udseende til dens oprindelige tilstand (se figur 4).

Figur 1:. Nyre Decellularization System og protokollen og Recellularization Perfusion Circuit (A) Perfusion tidsplan for reagenser til decellularization af gnaver nyrer. De til decellularization, volumetriske strømningshastighed, og varigheden af ​​hvert trin reagenser er vist. (B) Perfusion decellularization set-up. Opløsninger pumpes ensrettet fra et reagens reservoir til en perfusatet opsamlingsbeholder gennem individuelle flowlinier for hver nyre undergår decellularization. Op til fire nyrer kan decellulariserede pr peristaltisk pumpe. (C) perfusionskredsløb for såning og dyrkning af recellularized nyre stilladser. Celler indlæses via en sprøjte forbundet direkte opstrøms for Luer indløb acceptor. Valgfri in-line sensorer til overvågning tryk, opløst ilt (DO _2), og pH kan placeres opstrøms af bioreaktor. Den digitale peristaltiske pumpe kan styres af computeren, og undertryk (partielt vakuum) kan anvendes til støtte ureter podning. (D) Komponenter anvendes til at skabe perfusionsledninger til decellularization (B) og recellularization (C). (A) han-Luer stik, (b) Luer cap, (c) han-Luer lås til 1/8 "barbed adapter, (d) Luer til Luer-adapter, (e) ¼" ID silikonerør, (f) peristaltisk pumpe slanger, g: tykvægget 1/16 "ID siliconegummirør, (h) 1/16" ID siliconegummirør, (i) tre-vejs stophane, (j) kobler anvendes til at forbinde segmenter af slangen ved at kombinere to 1/8 "barb til han-luer-adaptere (c) under anvendelse af enLuer til Luer kobling (d). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2:. Repræsentative Resultater af Nyre Decellularization Repræsentant brutto og mikroskopiske billeder vises af nyrer før og efter decellularization. (A) Time lapse serie af en nyre undergår decellularization. Billeder vises umiddelbart efter perfusion med hvert reagens er angivet. Efter perfusion af 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat), konserveret vaskulære netværk er synlig. (B) Repræsentative billeder af native eller decellulariserede nyrer sektioneret og farvet med hematoxylin og eosin (H & E). ECM arkitektur mikrostrukturelle funktioner, herunder glomeruli, samlekanalerne, Og blodkar, er velbevaret efter decellularization. (C) Scanning elektronmikrofotografier sammenligne glomeruli og tubuli i native (øverste række) og decellulariserede (nederste række) nyrer. Efter celle fjernelse, åbne tubuli er udbredt i hele nyren. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3:. Repræsentative resultater af menneskelig Renal Kortikal Tubular epithelial Recellularization af decellulariserede rottenyrer nyrer recellularized gennem en højtryks-antegrad arteriel perfusion teknik, der resulterer i RCTE celleadhæsion primært nyretubuli af cortex. (A) Repræsentative stor forstørrelse billeder (20X) af hematoxylin og eosin-farvede histologiske sektioner af recellularized stilladser 1, 3 eller 7 dage efter podning. Øverste række viser, at cellerne optager periglomerular rørformede plads trods bliver injiceres gennem den arterielle vaskulatur, med angivelse af deres præference for den tidligere renal ECM niche. Gul pilespids peger på en afferent arteriole med en lumen, der er blottet for celler. Nederste linje viser kortikale tubuli hvor RCTE prolifererer, med stigende celletæthed end en uge, og danner tætpakkede rørformede epiteliale strukturer. (B) En lille (10 ml) volumen af resazurin-suppleret dyrkningsmedium recirkuleres gennem nyrerne på tidspunktet for medieændringer. Under 60 minutters perfusion, celler reducere den oxiderede resazurin forbindelse (blå) til resorufin (rød), som frembringer et stærkt fluorescerende signal i forhold til antallet af celler i nyren. I overensstemmelse med den observerede stigning i celledensitet set inden for de histologiske billeder, stiger procent resazurin reduktion over kultur time med cellevækst, hvilket giver en non-invasiv indikation af både levedygtighed og proliferation under vedligeholdelse kultur. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 4 recellularized nyrer). Klik her for at se en større version af dette tal.

. Figur 4: Repræsentative resultater: Sammenligning af Native, decellulariserede og Recellularized Nyrer lav forstørrelse histologiske billeder viser den renale cortex, overgangszonen mellem cortex og ydre medulla, og medullære papilla regioner i native nyrer (øverste række), decellulariserede (Decell; midterste række), og 7-dages RCTE-recellularized (7 Day Recell, nederste række) stilladser. Den stiplede linje angiver den omtrentlige grænse mellem den renale cortex (C) og ydre medulla (M). Brutto billeder viser en nyre i dets native tilstand efter indkøb, efter decellularization, og 7 dage efter podning af RCTE celler gennem nyrearterien. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den beskrevne decellularization protokol konsekvent frembringer en helt acellulær nyre ECM, der fungerer som en 3D-skabelon til dyrkning af humane renale corticale tubulære epitelceller (både proximale og distale tubulus-afledt), i tillæg til vaskulære endotelceller ^7,17. Den kanyle renal vaskulatur fungerer som det centrale element for ensartet levering af reagenser og celler i hele stilladset i en bioreaktor set-up, således at de perfusion decellularization, celle seeding, langsigtet perfusion kultur, og tilsætte Resazurin perfusion protokoller. Som sådan korrekt kanylering af den renale arterie inden organperfusion er kritisk, og der skal tages særlig omhu for at sikre, at den renale arterie ikke er blokeret eller beskadiget, og at kateteret er fastgjort. De Sprague Dawley-rotter, hvorfra nyrer inddrives, skal systemisk hepariniseret at undgå størkning inden vaskulaturen under indkøb orgel, som intravaskulære blodpropper ikke kan be fjernet, og kan hæmme fuldstændig decellularization i nyren.

Den perfusionsbioreaktor anvendes til såning og perfusion kultur af recellularized nyrer er designet til at tillade flere seeding metoder in situ ^17. Ud over den arterielle injektionsteknik her beskrevet kan celler injiceres retrograd gennem kateter ureter eller renal vene. Endvidere er bioreaktoren legeme forsynet med en ventil, der tillader anvendelse af negativt tryk (partielt vakuum, se figur 1C), for ureter såning. Uanset den seeding strategi anvendes, perfusion dyrkningsmedium antegrad gennem den renale arterie er kritisk for passende næringsstof (f.eks oxygen, glucose) levering til podet celler.

Den beskrevne recellularization Protokollen viser vores brug af decellulariserede nyre matricer til at tjene som skabeloner specifikt til epitelial tubulogenesis. Men tidligere har vi shegen at den renale matrix understøtter også re-endotelialisering af den tilbageholdte vaskulære netværk og kan være foret med humane inducerede pluripotente stamcelle-afledte endotelceller, som er en vigtig observation for eventuel langvarig transplantation af recellularized nyrer i dyremodeller ved at forebygge trombotiske okklusion af den renale vaskulatur ^7. En aktuel hindring for eventuel opskalering af nyre recellularization protokoller til store dyr nyre scaffolds er væsentligt større antal celler, der kræves til at genbefolke human størrelse nyre scaffolds. Effektive seeding strategier, såsom højtryks-arteriel injektion teknikken beskrevet ovenfor, er der et udtalt behov for at maksimere antallet af celler, der indpode inden den decellulariserede ECM. Givet den heterogene cellulære sammensætning af den native nyre, kan i sidste ende være behov for flere seeding metoder til effektivt genbefolke de forskellige ekstracellulære renale nicher med forskellige celletyper, Collectivt udføre de mange funktioner af nyrerne, herunder filtrering, reabsorption, koncentration af urin, og hormon syntese.

Endelig resazurin perfusion assay påvist i denne artikel giver en ikke-invasiv, ikke-giftige vurdering af levedygtighed og proliferation celle under langvarig kultur ^7,17,18. Assayet tilvejebringer øjeblikkelig tilbagemelding på den metaboliske tilstand af celler, der vokser i nyre stilladser, og når regelmæssigt udføres i mellem regelmæssige udvekslinger medium, kan anvendes til at karakterisere celleproliferation over tid. Den resazurin reagens er billig, assayet kræver lidt tid til at udføre (1 time), og det er en mere konservativ analytisk metode til karakterisering celleproliferation eller metaboliske tendenser i forhold til histologisk evaluering, hvilket kræver terminal offer recellularized stilladset. Den resazurin perfusion assay kan også tilpasses til evaluering af cellepopulationer under vækst inden andre recellularized organer eller væv.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO	VWR	M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O	Sigma-Aldrich	05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT)	Sigma-Aldrich	77240	Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol	VWR	V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces	Sigma-Aldrich	SL2	For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media	Life Technologies	11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech	Corning	35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin	Corning	30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red	Life Technologies	12605-028	Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%)	Life Technologies	15250-061
Resazurin sodium salt	Sigma-Aldrich	R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC	Cole-Parmer	EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads.	Cole-Parmer	EW-07519-70	Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head.	Cole-Parmer	EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated	VWR	82027-438
*Kidney perfusion bioreactor	WilMad Labglass	*Custom designs	Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca)	BD Biosciences	381412	Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25'	Cole-Parmer	HV-06508-14	Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack	Cole-Parmer	HV-06411-62	Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft.	Cole-Parmer	HV-96410-14	Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD	VWR	89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences	VWR	28143-558	Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	T-45505-11	Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45502-22	Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs	Careforde Healthcare	10254821	Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip.	BD Biosciences	309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish	BD Biosciences	353001	Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.