Summary
Este manuscrito describe una técnica de modelado de infarto capsular. Aquí hemos utilizado una técnica photothrombotic modificado con baja intensidad de la luz después de la cartografía de destino antes de la cirugía. Usando esta técnica, hemos creado un modelo de infarto capsular circunscrita con deficiencia motora persistente.
Introduction
Hasta hace poco, la "carrera de la materia gris (GMS) modelos" se han utilizado exclusivamente para comprender la fisiopatología del accidente cerebrovascular y para guiar el desarrollo de nuevos tratamientos. Sin embargo, ha habido una creciente prevalencia de accidente cerebrovascular que afecta a la sustancia blanca subcortical en individuos de edad avanzada, lo que constituye 15 - 25% de los ictus 1,2. Numerosos estudios se han realizado en relación con el uso de modelos de carrera de la SGM, mientras que hay pocos estudios que han utilizado modelos de carrera de la sustancia blanca (WMS). La materia blanca en los roedores es sustancialmente menor que la materia blanca en los seres humanos o primates. En consecuencia, es más difícil de acceder selectivamente y destruir las regiones diana en la sustancia blanca 3. Además, no hay herramientas eficaces se han desarrollado hasta la fecha para destruir selectivamente la medida prevista de la materia blanca de destino. Por lo tanto, ha sido la falta de modelos apropiados para el estudio de los trazos de la materia blanca.
st Animalmodelos roke a menudo se utilizan para controlar el progreso de la recuperación de motor para el desarrollo de nuevos rehabilitación y métodos terapéuticos. Es ideal para utilizar un modelo animal que exhibe un déficit neurológico a largo plazo concordante con las alteraciones anatómicas demostrado en el accidente cerebrovascular humana 4,5. En este sentido, la rápida recuperación del déficit motor y la amplia participación del cerebro después del infarto lesioning puede no ser realista en la búsqueda de la investigación del accidente cerebrovascular. Anteriores modelos de infarto capsular han sido realizadas por la oclusión de la carótida interna o las arterias coroideas anterior y difusión de la endotelina-1 (ET-1) en la cápsula interna 6-9. Sin embargo, oclusión de la arteria requiere una cuidadosa disección de las arterias, sino que produce una amplia área de la lesión del infarto, incluyendo la cápsula interna, sin déficit de comportamiento persistentes. Por otra parte, ET-1 no era difusa para destruir por completo el brazo posterior de la cápsula interna, y por lo tanto menos marcada o de persistir Behavioral déficit.
Un modelo de infarto photothrombotic ha sido ampliamente utilizado para generar diversos tipos de lesiones del infarto en el córtex y estructuras subcorticales 10. La técnica incluye la administración intravenosa, seguido por la iluminación focal, lo que conduce a la agregación de plaquetas en los vasos pequeños y la generación de lesiones de infarto 10. Photothrombotic técnica se ha utilizado ampliamente para crear lesiones GMS, mientras que rara vez se ha utilizado para generar lesiones WMS 5,11. Para esta técnica, una combinación de Rosa de Bengala colorante y la luz de irradiación ha demostrado ser útil en la destrucción de la estructura diana, causando déficits funcionales correspondientes. El elemento clave de esta técnica es photothrombotic irradiación de luz, ya que determina el tamaño de las lesiones de infarto. Resultados de irradiación de luz en diferentes efectos en la materia gris y la materia blanca, debido a la dispersión de la luz es más de 4 veces mayor en ma blancatter en comparación con la materia gris 12; En consecuencia, si la intensidad de la luz tiene una irradiancia suficientemente baja (<1,140 mW / mm2), se puede limitar la extensión a la lesión photothrombotic afecta a la medida en la sustancia blanca (es decir., Cápsula interna). Por ejemplo, la luz de mayor energía puede inducir infartos, tanto en la materia gris y blanca, sin embargo, menor energía de la luz puede inducir photothrombosis sólo en la sustancia blanca. Por otra parte, la penetración de la energía de la luz era muy limitado. Aproximadamente el 99% de la energía de la luz se pierde más allá de 1 mm de la fuente de luz 13. Por lo tanto, se espera que los objetivos muy precisos, más baja energía la luz induce photothrombosis sólo en la sustancia blanca con una intrusión mínima de la sustancia gris vecino.
A continuación, se describe un nuevo método para crear lesiones de infarto en la zona de la extremidad anterior de la cápsula interna en los roedores. Se describe el método de identificación de la zona de la extremidad anterior de la ca internapsule, la tecnología de irradiación de luz, incluyendo el ajuste y la entrega de la luz, y la generación de una lesión del infarto. También describimos las pruebas de comportamiento utilizados para evaluar la integridad de la modelización capsular.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales del Instituto Gwangju de Ciencia y Tecnología (GIST), y todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en GIST.
1. Pasos Pre-Lesioning
- Identificación de la Zona Extremidad anterior de la cápsula interna usando AAV-GFP
- Casa y manejar las ratas Sprague Dawley (~ 400 g, 11 - 13 semanas) de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales.
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y electrodos utilizando un esterilizador apropiado (vapor o en un esterilizador de plasma). Utilice esterilizador de vapor a 121 ° C como ajuste de 30 min para la esterilización y 30 min para seco.
- Anestesiar al animal con una mezcla de clorhidrato de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (7 mg / kg) a través de una inyección intramuscular. Comprobar la profundidad de la anestesia por pellizco de la pata. Mantener la temperatura corporal a 37,5 ± 0,5 ° C a través de una almohadilla térmica bajoel cuerpo del animal.
- Colocar el animal en un marco estereotáxico usando una barra de soporte de la oreja y la boca.
- Limpiar y desinfectar la zona quirúrgica con un 70% de alcohol y solución de povidona yodada. Infiltrarse en el clorhidrato de lidocaína al 2% debajo del cuero cabelludo en la zona del cráneo incisión intención de reducir el dolor intraoperatorio.
- Aplicar ungüento oftálmico veterinario para prevenir la sequedad de los ojos. Coloque un paño estéril sobre el animal a los sitios operativos. Mantener todos los procedimientos en condiciones estériles.
- Realizar una incisión en la línea media del cráneo de 2 cm utilizando un bisturí y retraer la piel bilateral con retractores de alambre. Se seca el cráneo con hisopos de algodón y peróxido de hidrógeno al 30%.
- Hacer un agujero con un taladro de la pieza de mano sobre la zona de la extremidad anterior de la corteza motora (AP: 2.5 de bregma, ML: ± 2,5 de la línea media) y despejar las vías con micro-cureta para el virus de la inyección.
- Descongelar el AAV-GFP (2 x 10 12 moléculas de virus / ml) sobre hielo y de carga 1 l de lavirus en una jeringa de 10 microlitros. Coloque la jeringa en el marco estereotáctico.
- Mover la aguja en el orificio pre-hechos y bajar la aguja 1 mm de profundidad en la duramadre.
- Inyectar el virus lentamente (0,1 l / min) utilizando una alta precisión microbomba y dejar la aguja en su sitio durante otros 10 min para permitir que el virus se difunda hacia fuera.
- Después de limpiar el lugar de la operación con irrigación salina, asegurar la herida con sutura de nylon 3-0; liberar la rata desde el marco estereotáctico y la transfiere a una cámara de recuperación. Administrar ketoprofeno (2 mg / kg) a través de una inyección intramuscular para el control del dolor postoperatorio.
- Se mantiene la temperatura corporal (37 ° C) con el cojín de calefacción y administrar antibióticos de clase cefemes segunda generación (0,1%, 1 ml) a través de una inyección intramuscular y clorhidrato de lidocaína al 2% por vía subcutánea, según sea necesario. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantenerdecúbito esternal. casa sola al animal hasta la recuperación completa.
- Después de 2 - 3 semanas de recuperación, profundamente anestesiar la rata con una sobredosis de clorhidrato de ketamina (300 mg / kg) a través de una inyección intramuscular en el capó. Confirmar la muerte de los animales por la falta de respuesta de los pies pellizcos, el pulso y la respiración. Coloque la supina rata en el capó.
- Abra la cavidad abdominal a través de una "incisión en forma de Y 'para abrir la cavidad torácica. Sujete firmemente la aorta descendente con una pinza hemostática y la ruptura de la aurícula derecha del corazón de rata para el drenaje de sangre. Iniciar la perfusión en el ventrículo izquierdo del corazón con frío 1% de paraformaldehído por 5 min (10 ml / min) seguido de 4% de paraformaldehído durante 30 min (10 ml / min).
- Retire la cabeza de la rata de la carcasa con un par de tijeras. Hacer una incisión en la línea media del cuello a la nariz y eliminar los músculos del cuello usando tijeras o pinzas gubias de manera que el cráneo está expuesto. diseccionar suavemente los huesos del cráneo y duras a cabo desde el cerebro.
- Extraer el cerebro y colocar el cerebro de rata en un tubo cónico de 50 ml lleno con 4% de paraformaldehído durante la noche. Al día siguiente, lavar el cerebro con 1x PBS 3 veces y lo coloca en una solución de sacarosa al 30%.
- Después de que el cerebro se hunde completamente a la parte inferior de la solución de sacarosa al 30%, coloque el cerebro en el criomolde con compuesto OCT a -20 ° C en cryotome. Cortar el cerebro en el plano coronal a un espesor de 40 micras y un intervalo de 200 micras.
- Realizar tinción inmunohistoquímica GFP usando el método de deslizamiento 14. Aplicar el anticuerpo primario (1: 200 de anti-proteína fluorescente verde, fracción IgG de conejo) para las secciones de cerebro durante la noche a 4 ° C. El 2 de días, se lava con 1% de fosfato de solución salina tamponada con (PBST) solución de Tween-20 3 veces y aplicar el anticuerpo secundario (1: 500 de IgG de cabra anti-conejo (H + L)) durante 1 hora. Enjuague el portaobjetos con 1% de PBST 3 veces. Coloque la cubierta de vidrio en la sección de cerebro.
- El uso de un microscopio de fluorescencia (longitud de onda de excitación470 nm, longitud de onda de emisión de 525 nm, un aumento de 5X), observar el AAV-GFP axones transducidas en la cápsula interna. Comparación de las ubicaciones de los axones transducidas con el Atlas de cerebro de rata 15 para determinar las coordenadas estereotácticas de los axones transducidas
- El ajuste de la intensidad de luz adecuada para capsular del infarto Modelado pre-lesioning
- La construcción de la interfaz de los nervios óptico
- Cortar una longitud apropiada (4 cm) de una aguja espinal de calibre 27 con un estilete en el interior con una broca de corte.
NOTA: El corte puede comprimir y aplastar la punta de la aguja espinal; retirar el estilete y pulir la punta de la aguja espinal para eliminar la porción aplastada de la aguja espinal y mantener el calibre interior de la aguja espinal. - Tira de una longitud apropiada (10 cm) de la camisa de la fibra óptica (125 micras con un núcleo de 62,5 micras) de cable de conexión de un lado.
- Inserte el fi óptica unjackedBER en el tubo de metal (diámetro externo: 3,8 mm, diámetro interno: 3,3 mm y longitud: 17 mm), que luego se sujeta alrededor de la fibra. El tubo de metal es útil para llenar el espacio entre la fibra óptica y el cubo de la aguja espinal. Sujetar el inferior media del tubo de metal con un prensador dos veces.
- Aplicar el epoxi curable por calor en la fibra óptica y insertar la fibra óptica dentro de la aguja espinal. Aplicar un epoxi adicional para el espacio vacío en el centro. Curar la resina epoxi durante 20 min a 100 ° C para la fijación estable.
- Escindir la fibra óptica que sobresale hacia fuera de la aguja espinal y pulir la fibra óptica en la punta de la aguja espinal mediante lapeado diamante (pulido) hojas.
- Conecte la parte del conector FC / PC del cable de conexión al acoplador del sistema de láser verde y medir la intensidad de la luz desde la punta de la fibra óptica utilizando la potencia óptica digital y medidor de energía.
- Cortar una longitud apropiada (4 cm) de una aguja espinal de calibre 27 con un estilete en el interior con una broca de corte.
- La construcción de la interfaz de los nervios óptico
2. PhotothromBotic infarto en lesiones por la cápsula interna
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y electrodos utilizando un esterilizador apropiado (vapor o en un esterilizador de plasma). Utilice esterilizador de vapor a 121 ° C como ajuste de 30 min para la esterilización y 30 min para seco.
- Anestesiar al animal (~ 400 g, 11 - 13 semanas) con una mezcla de clorhidrato de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (7 mg / kg) a través de una inyección intramuscular. Comprobar la profundidad de la anestesia por pellizco de la pata. Se mantiene la temperatura corporal a 37,5 ± 0,5 ° C a través de una almohadilla de calentamiento en el cuerpo del animal.
- Colocar el animal en un marco estereotáxico usando una barra de soporte de la oreja y la boca.
- Limpiar y desinfectar la zona quirúrgica con un 70% de alcohol y solución de povidona yodada. Infiltrarse en el clorhidrato de lidocaína al 2% debajo del cuero cabelludo en la zona del cráneo incisión intención de reducir el dolor intraoperatorio. Aplicar ungüento oftálmico veterinario para prevenir la sequedad de los ojos.
- Aplicar un campo estéril sobre la unatremo y exponer los sitios operativos. Mantener todos los procedimientos en condiciones estériles.
- Realizar una incisión en la línea media del cráneo de 2 cm y retraer la piel bilateral con retractores de alambre. Se seca el cráneo con permutas de algodón y peróxido de hidrógeno.
- Ajustar la altura de la abrazadera de la nariz hasta el bregma y lambda están alineados en el mismo nivel. Paso crítico: Esta alineación es crítica para acercarse correctamente una estructura más profunda, como en la realización de una lesión del infarto en la cápsula interna en el experimento principal.
- Hacer un agujero (diámetro: 2 mm; PA: -2,04 desde bregma; ML: ± 3,0 de la línea media) usando un taladro para inducir photothrombosis.
- Pulir y limpiar la punta de la fibra óptica de la interfaz óptica. Fijar la ONI al marco estereotáxico sin doblar. Compruebe la punta de la ONI y limpiarla con claridad antes y después de la inserción de la interfaz óptica.
- Medir la intensidad del láser desde la punta de la fibra óptica antes de la inserción de la optical interfaz al sitio diana del cerebro de rata. Ajustar la intensidad del láser de 3,5 mW, según lo confirmado por los pasos previos a la cirugía, en la punta de la fibra óptica.
- Inserte la ONI en el área de orientación de la cápsula interna (-7,8 mm confirmados de la etapa previa a la cirugía) a través del agujero de perforación.
- Mantener la temperatura corporal a 37,5 ± 0,5 ° C durante photothrombosis. Una temperatura corporal más baja no puede producir el grado esperado de miocardio. Inyectar Rose Bengal (2 ml / kg) a través de la vena de la cola.
- Encienda el láser verde de 532 nm durante 90 s 1 min después de la inyección de Rosa de Bengala. Después de la irradiación, retire con cuidado la ONI desde el cerebro. Después de limpiar el lugar de la operación, asegurar la herida asegurar la herida con sutura de nylon 3-0; liberar la rata desde el marco estereotáctico y la transfiere a una cámara de recuperación.
- Para el grupo de operación simulada (SOG), lleve a cabo un procedimiento de lesión de decisiones idénticas, excepto por la inyección de solución salina (0,2 ml / 100 g) en lugar de Rose-Bengala.
- Se mantiene la temperatura corporal (37 ° C) con el cojín de calefacción después de la cirugía y administrar antibióticos de cefalosporina (segunda generación, 0,1%, 1 ml) a través de una inyección intramuscular. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devolver los animales post-quirúrgicos para la jaula ocupada por otros animales hasta que esté completamente recuperado.
NOTA: experimento preliminar se realizó en los mismos procedimientos para encontrar la intensidad de la luz óptima desde 1 mW a 5 mW y el procedimiento puede ser necesario para adquirir el grado satisfactorio de lesión en diferentes condiciones.
3. Evaluación de las lesiones por infarto capsular
- Las pruebas de comportamiento y los animales agrupación
- Realizar sola pastilla llegar a tareas como se describe por Whishaw et al. 14 para evaluar el déficit motor de la extremidad anterior todos los días durante 1 semana después del modelado de un derrame cerebral. Realizar una sola tarea de pellets llegar(SPRT) en animales con restricción alimenticia (90% del peso corporal control) utilizando Plexiglas transparente (30 x 15 x 35 cm de altura) con un 1 cm de anchura de hendidura y un útil de los alimentos en la parte delantera de la mitad de la pared frontal.
- Coloque una pastilla en el banco de alimentos de forma oblicua contralateral a la extremidad anterior preferida. Administrar 20 gránulos por sesión durante 3 semanas.
NOTA: Un número exitosa de SPRT se define como un alcance en el que el animal agarra una bola de comida y la pone en la boca sin que se caiga. - Calcular la puntuación como porcentaje de tramos de éxito, que se define por la siguiente fórmula:
NOTA: Dividimos los animales en 3 grupos: el grupo de operación simulada (SOG), grupo de recuperación moderada (MRG), y la mala grupo de recuperación (PRG). Si la puntuación SPRT posterior al accidente cerebrovascular> 50%, clasificamos a las ratas como el MRG, que indica la presencia de una lesión importante, pero no la destrucción completa de la target. Si la puntuación SPRT posterior al accidente cerebrovascular es <50% en comparación con el marcador SPRT carrera previa, clasificamos el grupo como PRG, lo que indica lesioning completa en el objetivo.
- La confirmación de un infarto lesiones por neurohistológica
- Realizar la perfusión cardiaca con 4% de paraformaldehído como se describe anteriormente. Después de que el cerebro se hunde completamente en la solución de sacarosa al 30%, realice seccionamiento coronal a un espesor de 10 micras y un intervalo de 200 micras usando un microtomo o cryotome 4.
- Mancha con H & E, Nissl, Luxol Fast Blue-PAS, Neurofilamentos proteína-L o glial tinción de la proteína ácida fibrilar y observar los hallazgos histológicos para determinar la intensidad óptima de la luz que puede cubrir todo el ancho de la cápsula interna en el área objetivo de observar la tinción 4,17.
- El uso de software ImageJ, medir el volumen de la zona infartada photothrombotic de la cápsula interna en los toboganes del cerebro.
- Para medir el volumen del área infartada, iniciar el software 'ImageJ'. Para abrir los archivos para ser apilados, seleccione 'Imagen a pilas' ( 'Imagen' → 'pilas' → 'Imagen a pilas'). Editar nombre de archivo y seleccione 'establecer la escala "(" Analizar "→" Establecer la Escala') para modificar la escala.
- En 'plugins', seleccione 'Medir las pilas' para calcular el volumen o área de imágenes. Introduzca el intervalo de distancia de 2 imágenes en 'Slice Spacing ". Hacer un dibujo de la ROI (región de interés) de todas las imágenes y haga clic en "Medir".
NOTA: El software 'ImageJ' calcula automáticamente el área y volumen de cada imagen y el volumen total de ellos.
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Representative Results
El método que aquí se presenta tiene por objeto crear un infarto capsular circunscrita con un déficit motor persistente. Por lo tanto, es fundamental para determinar correctamente el objetivo dentro de la cápsula interna en la etapa de pre-cirugía. El mapeo somatotopic de fibras piramidales en la cápsula interna no ha sido resuelto hasta la fecha. Para identificar correctamente el objetivo dentro de la cápsula interna, el área de la extremidad anterior deberán estar delimitadas. Una inyección de AAV-GFP en el área de la extremidad anterior de la corteza motora puede rastrear los axones de las fibras piramidales en la cápsula interna (Figura 1). Otros marcadores neuronales, tales como biotina amina dextrano (BDA), se puede utilizar para el mismo propósito. Las coordenadas estereotácticas de la diana dentro de la cápsula interna puede ser dilucidado mediante el trazado de las proyecciones axonales que se originan en la zona de la extremidad anterior de la corteza motora a la cápsula interna.
Figura 1. Identificación de la Zona Extremidad anterior de la cápsula interna 2 semanas después de la inyección de AAV-GFP. GFP-transduced fibras axonales que se originaron en la zona de la extremidad anterior de la corteza motora se muestran en el núcleo ventrolateral del tálamo (flechas) y la porción caudal de la cápsula interna (punta de flecha). La línea punteada indica el contorno de la cápsula interna, y los números se refieren a las distancias desde el bregma. Hipopótamo, el hipocampo; CPU, putamen caudado; VL, núcleo ventrolateral; IC, cápsula interna. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La intensidad de luz óptima puede ser diferente dependiendo de la cepa y el peso corporal del animal y los tipos y diámetros de fibras ópticas. Por lo tanto, la intensidad de luz óptima debe determinarse por separado antes del experimento principal del infarto de lesionar. Usando el procedimiento photothrombotic, la intensidad de la luz se puede aumentar gradualmente hasta que la extensión de la lesión cubre toda la anchura de la cápsula interna sin destruir las estructuras de materia gris vecinos (Figura 2). La intensidad de luz óptima se puede verificar mediante la comparación de la medida histológico de la lesión del infarto y ubicaciones.
Figura 2. extensión del infarto lesiones Al otro lado de mayor o menor intensidad de la luz laser de 2 mW hasta 5 mW 2 semanas después de lesiones por photothrombotic. La intensidad de la luz óptima se considera que es entre 3 y 4 mW mW en este entorno experimental. Las flechas indican la lesión del infarto./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Preferimos utilizar el ONI en el que la fibra óptica está contenida en un tubo de metal fina (aguja espinal). La fibra óptica puede producir dispersión de la luz mínima de la cara de la fibra, que es probable que genere daños neuronales adicional a lo largo del tracto de fibra óptica. Encasement de la fibra óptica también es ventajoso para evitar la flexión de la fibra óptica en objetivos más profundos, así como para fijar la ONI al marco estereotáctico (Figura 3).
Figura 3. Construcción de la Interfaz óptico-neural (ONI). (A) El corte de la aguja espinal. (B) desprendimiento de la fibra óptica. (C + d) El tubo de metal de anclaje se inserta sobre elfibra óptica despojado y estrecha para asegurar la fibra óptica al cubo de la aguja espinal. (E) La fibra óptica añadido epoxi se inserta en la aguja espinal. (F) El epoxi se endurece a 100 ° C durante 20 min. (G) La fibra óptica se escinde en la punta de la aguja espinal. (H) La fibra óptica se pule. (i) La intensidad de la luz se mide desde la punta de la fibra óptica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El procedimiento photothrombotic producirá lesiones reproducibles y lugares con ~ 70% de éxito en la alteración motora. Lesión típica del infarto capsular abarca la dimensión ventrodorsal de fibras capsulares (Figura 4A). Por otra parte, la lesión del infarto se extiende a lo largo del eje anteroposterior en la cápsula interna debido a la mayor dispersión de la luz dentro de la fibra capsular. (Figura 4B) El tracto óptico situado debajo de la cápsula interna se compone de fibras de materia blanca; por lo tanto, a menudo se daña por irradiación de un aumento de la intensidad de la luz. Se requieren secciones seriadas y tinción para confirmar todo el volumen y la extensión del infarto. El volumen del infarto fue de 0,63 ± 0,37 mm 3. Para evaluar la destrucción de la fibra capsular, neurofilamentos y manchas Luxol Fast Blue-PAS son útiles.
Figura 4. Aspecto microscópico de capsular de infarto 3 semanas después de Photothrombosis. Aspecto microscópico del infarto capsular 3 semanas después de photothrombosis. A) de cortes de cerebro de la sección coronal en el cerebro de rata. La punta de flecha indica la zona de la aguja que contiene la fibra óptica en el tálamo y hasta cápsula interna. B) tinción de Nissl de serie de la rodajas de cerebro coronal showi ng de toda la extensión de la lesión del infarto en la cápsula interna. Las puntas de flecha indican la lesión del infarto. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El éxito de la modelización puede evaluarse mediante pruebas de comportamiento utilizando un solo pellet alcanzar tarea. El rendimiento de comportamiento después de 1 semana después de la lesioning infarto es una buena guía para confirmar lesioning precisa, que acompaña al deterioro persistente y marcada de SPRT a pesar del entrenamiento diario sola pastilla alcanzar (Figura 5). Una vez que se muestra el déficit motor en el PRG, el déficit neurológico persistió durante el período de 3 meses de observación. simulacro de accionamiento grupo no mostró la disminución significativa de los resultados SPRT después de la operación.
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Figura 5. Cambios en la sola pastilla que alcanzan puntuaciones después de infarto agudo del 4,20 capsular. Los grupos experimentales (PRG y MRG) mostró una significativa disminución de las puntuaciones inmediatamente después de la lesioning del infarto en comparación con el grupo de operación simulada (SOG). El MRG exhibe una recuperación gradual de las actuaciones SPRT, mientras que el GRP exhibe el deterioro motor persistente en el tiempo. Op, photothrombotic lesioning del infarto; PRG, pobres grupo de recuperación; MRG, grupo de recuperación moderada. La significación estadística se determinó utilizando el análisis de medidas repetidas de las varianzas. + SOG frente MRG; * SOG frente PRG. Los datos son medias ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El modelo de infarto capsular presentado aquí demuestra una lesión diana con deficiencia motora marcada y persistente en la función de la extremidad anterior. Los modelos anteriores de un derrame cerebral subcortical capsular han demostrado un grado insuficiente de deterioro motor y una rápida 6,8,9 proceso de recuperación. En este sentido, este modelo se asemeja a los casos de infarto capsular clínicos que presentan deterioro funcional a largo plazo.
Los pasos más críticos en el desarrollo de un modelo de infarto capsular circunscrita son: 1) para identificar correctamente la representación somatotopic de la parte del cuerpo destinada a desactivar la función dentro de la cápsula interna; 2) identificar la intensidad óptima del láser verde, que puede destruir todo el ancho de la cápsula interna con la intrusión mínima del vecino estructuras de materia gris; y 3) para colocar con precisión la fibra óptica en la estructura objetivo. Aunque las técnicas presentadas pueden inducir circunscribend modelo de infarto capsular con una alta tasa de replicación (> 70%), pequeñas diferencias en la orientación y el grado de integridad de destrucción que cubren toda la anchura de la cápsula interna puede dar cuenta de los diferentes déficits motores.
El tracto corticoespinal se encuentra en la mitad anterior del brazo posterior de la cápsula interna en los seres humanos a pesar de la controversia de la organización somatotopic 15. Por el contrario, no ha habido ninguna clasificación equivalente o elucidación detallada de la organización somatotópica de la cápsula interna en roedores. La falta de conocimiento sobre la organización somatotopic a menudo conduce a los objetivos incorrectas de lesioning infarto dentro de la cápsula interna con diferentes resultados motores entre los modelos de infarto capsular. Sin embargo, hemos identificado los axones GFP-transduced en la porción caudal de la cápsula interna, lo que probablemente representan la trayectoria de las fibras motoras del miembro anterior. Por otra parte, lesionando de esta zona demonstrated un déficit marcado y persistente de la habilidad de llegar a la extremidad anterior. Por lo tanto, se recomienda la porción caudal de la cápsula interna para lesioning estereotáctica para mejorar la validez del modelo de infarto capsular.
Pre-ajuste de la intensidad de la luz es obligatoria para producir una medida uniforme de la lesión del infarto en modelos de accidente cerebrovascular debido a que la cepa de animal, el peso corporal, la fuente de luz y los tipos de ONI pueden generar diferentes tamaños de miocardio. Por lo tanto, los experimentos preliminares utilizando diferentes intensidades de luz en animales de experimentación con la misma cepa y el peso corporal deben llevarse a cabo hasta que se consigue la lesión del infarto satisfactoria con intensidad de luz mínima.
intensidad de la luz fuerte que puede destruir toda la anchura de la fibra capsular (anterior-posterior y la extensión dorsoventral) que corresponde a la zona de la extremidad anterior con un daño mínimo a las estructuras vecinas se considera que es la intensidad de luz óptima. el forelimb área de la cápsula interna está limitada por el tálamo por encima y el tracto óptico inferior. Por lo tanto, la profundidad de inserción ONI debe ser precisa para destruir toda la extensión de la IC en la dirección dorsoventral, con la preservación simultánea de las estructuras vecinas superiores e inferiores. la colocación inexacta de la ONI resulta en una destrucción incompleta del IC, que conduce a una rápida recuperación del déficit motor como resultado de la plasticidad sináptica de las fibras piramidales restantes en la cápsula interna. En exámenes histológicos de serie, el factor más de confusión en la inducción de un déficit motor persistente fue la colocación incorrecta de la ONI, lo que conduce a la falta de destruir toda la anchura de la PLIC 4,16. Por lo tanto, cuidado se debe prestar atención para alcanzar el objetivo correcto. Recientemente, Blasi et al. Reportó que duradera déficit motor puro se puede producir al hacer una lesión del infarto en cápsula interna posteriorel uso de la endotelina-1 (ET-1) 17. Sin embargo, la ET-1 puede destruir la estructura de la materia gris vecino por la difusión de la ET-1.
Pruebas de comportamiento es un punto de referencia disponible de inmediato en el laboratorio para evaluar la formación de la lesión del infarto en la cápsula interna. Sin embargo, se recomienda una evaluación del rendimiento del motor de una semana después del infarto lesioning para dividir a los animales en grupos de recuperación moderados y pobres. recuperación moderada se definió como un aumento en la puntuación de rendimiento> 50% en comparación con la puntuación antes de lesioning, mientras que una mala recuperación fue definido como la recuperación de <50%. Entre las pruebas de comportamiento del motor de la extremidad anterior, la sola pastilla alcanzar tarea es una de las pruebas más sensibles para ambas mediciones cuantitativas y cualitativas del rendimiento motriz accidente cerebrovascular inducida por 14. La tarea mide cuantitativamente el éxito alcanzando al mismo tiempo proporcionar un análisis del uso de la extremidad anterior, como agarrar y recuperar un alimentobolita. El análisis cualitativo del movimiento alcanzando también es útil para diferenciar la calidad de la recuperación del accidente cerebrovascular distinguiendo genuina recuperación funcional o compensación 20. Aquí, describimos brevemente la medición cuantitativa de la SPRT; Sin embargo, se recomienda un análisis cualitativo mediante la filmación y de puntuación basado en un análisis cuadro por cuadro para un análisis más detallado.
Las técnicas presentadas aquí no tienen por qué limitarse a la inducción de la modelización del infarto capsular circunscrito. La técnica se puede aplicar a la inducción de una lesión del infarto en otras áreas de materia blanca, tales como el cuerpo calloso, comisuras anterior y fibras de conexión entre las estructuras neurales. La combinación de la pequeña ONI y photothrombotic técnica basada en las propiedades ópticas de la materia blanca es capaz de destruir las estructuras específicas con un daño mínimo a las estructuras vecinas. Por ejemplo, infartos lacunares se pueden producir fácilmented apuntando a las estructuras subcorticales relacionados con las funciones motoras, cognitivas y de memoria. Cuando la estructura objetivo es grande, múltiples inserciones de la ONI y diferentes de orientación y ángulo trayectorias pueden ser necesarios para producir el grado deseado de las lesiones.
Existen varias limitaciones en esta técnica. La técnica es suficiente para demostrar la consecuencia de lesioning infarto en el PLIC y posterior recuperación. Sin embargo, este modelo no refleja todo el espectro de WMS humanos debido a la destrucción de la materia blanca photothrombotic difiere ligeramente de WMS humanos. En consecuencia, los hallazgos de imagen de resonancia magnética o neurobiológicos pueden presentar diferentes características en la etapa temprana de lesioning photothrombotic. Por lo tanto, este modelo se debe utilizar adecuadamente para el comercio fuera ventajas y desventajas del modelo. Técnicamente, no todas las cirugías pueden producir el marcado déficit motor y permanente en este modelo, ya que requiere procedimientos muy precisos. Specifically, se requieren manos con formación y experiencia para producir la alta reproducibilidad en la generación de este modelo.
En conclusión, el uso combinado de una técnica photothrombotic, la optimización de la intensidad de la luz, y la orientación correcta es una técnica útil para producir un modelo de infarto capsular circunscrito. Este modelo será útil no sólo para estudiar WMS en el comportamiento, circuito, y los niveles celulares, sino también para evaluar la utilidad de las nuevas intervenciones terapéuticas y de rehabilitación.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca del Instituto de Medicina Ingeniería de Sistemas (Imse) y Fondo GIST-Caltech Collaborative (K04592) de GIST y por el Programa de Investigación de Ciencias Básicas a través NRF de Corea financiado por el Ministerio de Ciencia, las TIC y la planificación futura (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
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