Summary
이 원고는 캡슐 경색의 모델링 기법에 대해 설명합니다. 여기에서 우리는 미리 수술 대상 매핑 후 빛의 낮은 강도와 변형 photothrombotic 기술을 이용했다. 이 기술을 사용하여, 우리는 지속적인 운동 장애 외접 캡슐 경색 모델을 만들었습니다.
Introduction
최근까지 "회백질 스트로크 (GMS) 모델은"배타적 스트로크 기전을 이해하고, 새로운 치료법의 개발을 유도하기 위해 사용되어왔다. 모든 스트로크 1, 2의 25 % - 그러나, (15)를 구성하는 노인 개인에 피질 하 백질에 영향을 미치는 뇌졸중의 증가 보급되고있다. 많은 연구는 백질 스트로크 (WMS) 모델을 사용하고 몇 가지 연구가있는 반면, GMS 모델을 사용에 관한 스트로크를 실시하고있다. 설치류에 흰색 물질은 사람이나 영장류에 흰색 물질보다 훨씬 작다. 따라서, 선택적 백질 3 목표 영역을 액세스하고 파괴하는 것이 더 어렵다. 게다가, 더 효율적인 툴을 선택적으로 타겟팅 백질의 계획된 범위를 파괴하는 최신 개발되지 않았다. 따라서, 백질 스트로크의 연구에 적합한 모델의 부족이 있었다.
동물 일roke 모델은 종종 새로운 재활 및 치료 방법의 개발을위한 모터 회복의 진행을 모니터하기 위해 사용된다. 인간의 행정 4,5에서 보여준 해부학 적 변화와 조화 된 장기적인 신경 학적 결손을 나타내는 동물 모델을 활용하는 것이 이상적이다. 이와 관련하여, 모터 적자 및 뇌 다음 경색의 lesioning의 폭 넓은 참여의 신속한 복구 뇌졸중 연구의 추구 현실적인하지 않을 수 있습니다. 이전 캡슐 경색 모델 내부 캡슐 6-9으로 엔도 텔린 -1 (ET-1)의 내부 경동맥 또는 전방 맥락막 혈관 및 확산에 의해 폐색되었다. 그럼에도 불구하고, 동맥 폐쇄 동맥 절개주의를 필요로하지만, 영구 행동 결손없이 내부 캡슐 포함 경색 병변의 넓은 영역을 생성한다. 또한 ET-1을 완전히 캡슐 내부의 후방 다리를 파괴 확산하고, 따라서 적은 표시되거나 BEH을 지속하지 않았다avioral 적자.
photothrombotic 경색 모델 널리 피질 경색 병변 및 피질 하 구조 (10)의 다양한 형태를 생성하는 데 사용되어왔다. 이 기술은 경색 병변 (10)의 혈소판 작은 혈관에서 응집 및 생성에 이르게 초점 조명, 다음 정맥 내 투여를 포함한다. 거의 WMS 병변 5,11 생성에 사용되지 않은 반면 Photothrombotic 기술은 광범위 GMS 병변을 만드는 데 사용되고있다. 이 기술의 경우, 로즈 벵갈 염료 및 광 조사의 조합 기능 결핍을 유발 해당 대상 구조의 파괴에 유용한 것으로 입증되었다. 이 경색 병변의 크기를 결정하므로 photothrombotic 기술의 핵심 요소는 광 조사한다. 회색질과 백색질의 다른 효과에 광 조사 결과, 빛의 산란이 흰색 mA 이상 4 배 높기 때문에회색 물질 (12)와 비교 라 자세 히; 빛의 세기가 충분히 낮은 조도 (<1140 mW의 / mm 2)이있는 경우 따라서, 하나는 photothrombotic 병변이 백질에 어느 정도 영향을 미칠하는 확장을 제한 할 수 있습니다 (예. 내부 캡슐). 예를 들어, 높은 에너지의 빛이 모두 회색과 흰색 문제에 경색을 유도 할 수있다, 그러나 낮은 에너지의 빛은 흰색 만에 photothrombosis을 유도 할 수있다. 또한, 광 에너지의 침투가 매우 제한적이었다. 빛 에너지의 약 99 %는 빛 (13)의 소스에서 1mm 이상 끊어졌습니다. 따라서, 정확하게 대상 것으로 예상된다, 낮은 에너지의 빛은 이웃 회색 물질의 최소 침해와 흰색 문제에 photothrombosis을 유도한다.
여기서는 설치류 내부 캡슐의 앞다리 영역 경색 병변을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 우리는 내부 CA의 앞다리 영역의 동정 방법을 서술psule, 조정 및 빛의 전달 및 경색 병변의 발생을 포함하여 광 조사의 기술. 또한 캡슐 모델링의 완전성을 평가하는 행동 시험을 설명한다.
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Protocol
모든 절차는 과학 기술 (GIST) 광주 연구소의 제도적 지침에 따라 수행되었다, 모든 절차는 GIST에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 사전의 lesioning 단계
- 내부 캡슐의 앞다리 지역의 식별 AAV-GFP를 사용하여
- 기관 및 국가 가이드 라인을 준수 - (13주 ~ 400g, 11) 하우스 스프 라그 돌리 쥐를 처리합니다.
- 적절한 살균 (스팀 또는 플라즈마 살균기)를 사용하여 모든 수술 도구와 전극을 소독. 살균 30 분, 건조 30 분 설정으로 121 ° C에서 증기 멸균기를 사용합니다.
- 근육 주사로 케타민 하이드로 클로라이드 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (7 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 동물을 마취. 발 끼에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 가열 패드 아래로 37.5 ± 0.5 ° C의 체온 유지동물의 몸.
- 귀 바, 입 홀더를 사용하여 정위 프레임에 동물을 배치합니다.
- 면도하고 70 % 알코올, 포비돈 요오드 용액으로 수술 부위를 소독. 수술 중 통증을 감소시키기 위해 의도 된 두개골 절개 영역 두피 하에서 2 %의 리도카인 염산염을 침투.
- 눈의 건조를 방지하기 위해 수의사 안과 연고를 적용합니다. 수술 사이트 동물을 통해 멸균 드레이프를 놓습니다. 무균 조건에서 모든 절차를 유지한다.
- 메스를 사용하여 2cm의 정중선 두개골 절개를 수행하고 와이어 견인기와 양자 피부를 철회. 면봉 30 % 과산화수소와 두개골을 건조.
- 운동 피질의 앞다리 영역을 통해 핸드 피스 드릴 사용하여 구멍 확인하고 바이러스 주입을위한 마이크로 currette와 기관을 취소 (AP를 : +2.5을 브레 그마에서, ML을 중간 선에서 2.5 ±).
- 얼음의 부하 1 μL의 AAV-GFP (2 × 12 바이러스 분자 / ㎖)을 해동10 μL 주사기에 바이러스. 정위 프레임에 주사기를 놓습니다.
- 미리 만들어진 구멍에 바늘을 이동하고 경질에 깊은 바늘 1mm를 내립니다.
- 바이러스 서서히 (0.1 μL / 분) 고정밀 마이크로 펌프를 사용하여 주입하고 바이러스 밖으로 확산 될 수 있도록 추가로 10 분 동안 위치에 바늘을 떠난다.
- 식염수 관개와 수술 부위를 청소 한 후, 3-0 나일론 봉합사로 상처를 보호; 정위 프레임으로부터 래트를 분리 및 회수 챔버로 옮긴다. 수술 후 통증 조절을위한 근육 주사를 통해 케토 프로 펜 (2 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다.
- 가열 패드와 신체 온도 (37 ° C)를 유지하고 필요에 피하 주사를 통해 근육 주사하고 2 % 리도카인 염산염을 통해 (0.1 %, 1 ㎖) 두 번째 세대 cephems 수준의 항생제를 관리 할 수 있습니다. 그것을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오흉골 드러 누움. 싱글 하우스 전체 복구 될 때까지 동물.
- 2 다음 - 삼주 복구, 깊이 후드에 근육 주사를 통해 케타민 하이드로 클로라이드 (300 ㎎ / ㎏)의 과다 복용과 함께 쥐를 마취. 발가락 곤란 응답, 맥박, 호흡의 부족으로 동물의 죽음을 확인합니다. 후드의 쥐 부정사를 놓습니다.
- 흉강을 엽니 다 ''추정치 모양의 절개를 통해 복강을 엽니 다. 단단히 지혈과 하행 대동맥 클램프 및 혈액 배수의 쥐 심장의 우심방 파열. 30 분 (10 ml / 분)에 대한 4 % 파라 포름 알데히드 다음 5 분 (10 ml / 분)에 대한 차가운 1 % 파라 포름 알데히드와 심장의 좌심실로 관류를 시작합니다.
- 가위를 사용하여 시체에서 쥐 머리를 제거합니다. 코에 목에서 중간 선 절개를하고 두개골이 노출되도록 가위 또는 rongeur를 사용하여 목 근육을 제거합니다. 조심스럽게 뇌에서 두개골 뼈와 DURAS을 해부하다.
- 뇌를 추출하고 밤새 4 % 파라 포름 알데히드로 가득 찬 50ml의 원뿔 관에서 쥐의 뇌를 놓습니다. 다음 날, 1X PBS 3 회 뇌를 씻고 30 % 자당 용액에 넣습니다.
- 뇌 완전히 30 % 자당 용액의 바닥에 가라 후 cryotome에서 -20 ° C에서의 OCT 화합물과 cryomold 뇌를 배치했다. 40 ㎛ 두께 200 μm의 간격으로 관상면에서 뇌 조각입니다.
- 슬라이드 방식 (14)를 사용하여 GFP의 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. 차 항체 적용 (1 : 안티 - 녹색 형광 단백질, 토끼 IgG의 분율 200) 뇌 조각에 밤새 4 ° C에서. 2 번째 날에, 트윈 20 (PBST) 용액으로 1 % 인산염 완충 식염수로 3 회 세척 및 이차 항체 (1 : 염소 항 - 토끼 IgG를 500 (H + 1))를 적용, 1 시간 동안. 1 % PBST 3 회와 슬라이드를 씻어. 뇌 조각의 커버 유리를 놓습니다.
- 형광 현미경을 사용하여 (여기 파장470 nm의 발광 파장 525 nm의, 배율 5 배), 캡슐 내부에있는 AAV-GFP 형질 축삭을 관찰. 형질 도입 축삭의 정위 좌표를 확인하기 위해 쥐 뇌 아틀라스 (15)와 형질 축색 돌기의 위치를 비교
- 캡슐 경색 모델링에 적합 빛 강도의 조정 사전의 lesioning
- 광학 신경 인터페이스의 건설
- 절단 드릴을 사용하여 내부 탐침으로 27 게이지 척추 바늘의 적절한 길이 (4cm)을 잘라.
참고 : 절단 압축 및 척추 바늘 끝을 분쇄 할 수있다; 탐침을 분리하고 척추 바늘의 파쇄 부를 분리하고 척추 바늘의 내부 직경을 유지하기 위해 척추 바늘 끝을 연마. - 일 측면 패치 코드의 (a 62.5 μm의 코어 125 μm의) 광섬유의 재킷의 적당한 길이 (10cm)를 벗긴다.
- unjacked 광 파이를 삽입BER 금속 튜브 (외부 직경 17mm : 3.8 mm, 내경 : 3.3 mm 길이)로 한 후, 섬유 주위에 클램프된다. 금속관은 광섬유 척추 바늘 허브 사이의 공간을 채우기 위해 유용하다. 회 누름으로 금속관의 1/2 하부 클램프.
- 광파이버에 열경화성 에폭시를 적용하고 척추 바늘에 광섬유를 삽입한다. 허브의 빈 공간에 추가 에폭시를 적용합니다. 안정적인 고정 100 ℃에서 20 분 동안 에폭시 경화.
- 척추 바늘로부터 돌출 된 광섬유를 절단 및 다이아몬드 래핑 (연마) 시트를 사용하여 척추 바늘 끝에 광섬유 연마.
- 그린 레이저 시스템의 커플러 패치 코드의 FC / PC 커넥터 부분을 연결하고 디지털 광 전력 및 에너지 측정기를 이용하여 광파이버의 선단에서의 광 강도를 측정한다.
- 절단 드릴을 사용하여 내부 탐침으로 27 게이지 척추 바늘의 적절한 길이 (4cm)을 잘라.
- 광학 신경 인터페이스의 건설
2. Photothrom내부 캡슐에 botic 경색의 lesioning
- 적절한 살균 (스팀 또는 플라즈마 살균기)를 사용하여 모든 수술 도구와 전극을 소독. 살균 30 분, 건조 30 분 설정으로 121 ° C에서 증기 멸균기를 사용합니다.
- 동물을 마취 (~ 400g, 11-13주)를 근육 내 주사를 통해 케타민 하이드로 클로라이드 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (7 ㎎ / ㎏)의 혼합물. 발 끼에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 동물의 신체 하에서 가열 패드를 통해 37.5 ± 0.5 ° C의 체온을 유지한다.
- 귀 바, 입 홀더를 사용하여 정위 프레임에 동물을 배치합니다.
- 면도하고 70 % 알코올, 포비돈 요오드 용액으로 수술 부위를 소독. 수술 중 통증을 감소시키기 위해 의도 된 두개골 절개 영역 두피 하에서 2 %의 리도카인 염산염을 침투. 눈의 건조를 방지하기 위해 수의사 안과 연고를 적용합니다.
- 은 An 통해 멸균 드레이프를 적용imal 및 수술 부위를 노출합니다. 무균 조건에서 모든 절차를 유지한다.
- 2cm의 정중선 두개골 절개를 수행하고 와이어 견인기와 양자 피부를 철회. 면화 스왑 및 과산화수소와 두개골을 건조.
- 브레 그마 및 람다는 동일한 수준으로 정렬 될 때까지 코 클램프의 높이를 조정한다. CRITICAL STEP이 올바르게 정렬 같은 메인 실험 내부 캡슐 경색 병변을 수행 같이 깊은 구조에 접근하는 것이 중요하다.
- 구멍 만들기 (직경 : 2mm, AP : 브레 그마에서 -2.04; ML을 : 중간 선에서 3.0 ±) photothrombosis을 유도하기 위해 드릴을 사용.
- 폴란드와 광학 인터페이스의 광섬유 팁 청소. 굽힘없이 정위 프레임에 ONI을 수정합니다. ONI의 끝을 확인하기 전에 광학 인터페이스의 삽입 후 명확하게 그것을 닦아냅니다.
- 하기 Optica의 삽입 전에 광파이버의 선단으로부터 레이저의 세기를 측정래트 뇌의 표적 부위 L 인터페이스. 광섬유의 선단에, 수술 전 단계에서 확인한 결과, 3.5 mW의 레이저로 농도를 조정.
- 내부 캡슐의 대상 영역에 드릴 구멍을 통해 (전 수술 단계에서 확인 -7.8 mm을)를 ONI를 삽입합니다.
- photothrombosis 동안 37.5 ± 0.5 ° C의 체온을 유지한다. 낮은 체온은 경색의 예상 범위를 생산하지 않을 수 있습니다. 꼬리 정맥을 통해 장미 벵골 (2 ㎖ / kg)을 주입한다.
- 로즈 벵갈 주입 후 90 초 1 분 동안 532 nm의 녹색 레이저를 켭니다. 조사 후, 부드럽게 뇌에서 ONI를 제거합니다. 수술 부위를 청소 한 후, 상처는 3-0 나일론 봉합사로 상처를 고정 확보; 정위 프레임으로부터 래트를 분리 및 회수 챔버로 옮긴다.
- 가짜 운영 그룹 (SOG)의 경우, 대신 로즈 벵갈 식염수의 주입 (0.2 ㎖ / 100g)을 제외하고, 동일한 병변 결정 절차를 수행합니다.
- 수술 후 가열 패드, 체온 (37 ℃)을 유지하고, 근육 내 주사를 통해 항생제 (2 세대 세 팔로 스포린, 0.1 %, 1 ml)에 투여. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물에 의해 점유 된 케이지에 수술 후 동물을 반환하지 않습니다.
주 : 예비 실험이 5 mW의 1 mW의 최적의 광 강도를 찾기 위해 동일한 과정을 수행하고, 절차는 다른 상태 병변의 양호 정도를 얻기 위해 요구 될 수있다.
캡슐 경색의 lesioning 3. 평가
- 행동 테스트 및 동물 그룹화
- Whishaw 등의 알에 의해 설명 된대로 작업에 도달 한 펠릿을 수행합니다. 14 스트로크 모델링 후 1 주간 매일 앞다리의 모터 적자를 평가하기 위해. 하나의 펠렛에 도달 작업을 수행1 폭 cm 슬릿 전벽의 중앙의 정면에있어서의 식품 진열 맑은 플렉시 글라스 (30 X 15 X 35cm 높이)를 이용하여 음식 제한 동물 (SPRT) (대조군 체중의 90 %).
- 바람직한 앞다리에 비스듬히 반대편 음식 선반에 펠렛을 놓습니다. 삼주에 대한 세션 당 20 알약을 관리 할 수 있습니다.
참고 : SPRTs의 성공 수는 동물이 음식 펠렛을 파악하고 그것을 포기하지 않고 입으로 그것을두고있는 범위로 정의된다. - 다음의 식에 의해 정의된다 성공에 도달의 비율로 점수를 계산한다 :
참고 : 우리는 3 그룹으로 동물을 분할 : 가짜 운영 그룹 (SOG), 중간 복구 그룹 (MRG), 가난한 복구 그룹 (PRG). 만약 뇌졸중 후 SPRT 점수> 50 %, 우리는 상당한 병변의 존재를 나타내는 MRG 같은 쥐를 분류하지만, 타 아닌 완전한 파괴rget. 포스트 행정 SPRT 점수가 사전 행정 SPRT 점수에 비해 50 % <있다면, 우리는 대상에서 전체의 lesioning을 나타냅니다 PRG으로 그룹을 분류합니다.
- 경색의 lesioning의 Neurohistological 확인
- 전술 한 바와 같이 4 % 파라 포름 알데히드와 심장 관류를 수행합니다. 뇌 완전히 30 % 자당 용액 싱크 후, 10 ㎛의 두께 및 마이크로톰 cryotome 또는 4를 사용하여 200 ㎛의 간격으로 관상 절편을 수행한다.
- H & E, Nissl, 룩솔 빠른 블루 PAS, 신경 미세 섬유 단백질-L 또는 폐해 섬유 성 산 단백질 염색 및 조직 학적 소견을 관찰와 얼룩은 염색을 관찰 할 수있는 대상 영역의 내부 캡슐의 전체 폭을 커버 할 수있는 최적의 빛의 강도를 결정하는 4,17.
- ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 뇌 슬라이드 내부 캡슐 photothrombotic 경색 부분의 체적을 측정한다.
- 경색 부분의 부피를 측정하기 위해, 'ImageJ에의 소프트웨어를 실행. 파일을 열려면 선택 '스택에 이미지'( '이미지'→ '스택'→ '스택에 이미지')를 적층한다. 편집 파일 이름을 선택합니다 규모를 편집 (→ '축척을 설정합니다' '분석') '축척을 설정합니다'.
- '플러그인'에서 [이미지의 볼륨 또는 면적을 계산하는 '스택을 측정합니다'. '슬라이스 간격'에이 이미지의 거리 간격을 삽입합니다. 모든 이미지의 ROI의 도면 (가볼만한 지역)을 확인하고 '측정'을 클릭합니다.
참고 : 소프트웨어 'ImageJ에'자동 지역과 각 이미지의 볼륨과 그 총량을 계산합니다.
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Representative Results
여기에 제시된 방법은 영구 모터 적자와 외접 캡슐 경색을 만들 것입니다. 따라서, 정확하게 예비 수술 단계에서 내부 캡슐 내에 타겟을 결정하는데 중요하다. 내부 캡슐의 피라미드 섬유의 somatotopic 매핑은 현재까지 해결되지 않았습니다. 제대로 내부 캡슐 내에서 대상을 식별하기 위해, 앞다리 영역을 묘사해야합니다. 운동 피질의 앞다리 영역으로 AAV-GFP의 주입 내부 캡슐 (도 1)에 피라미드 형 섬유의 축삭을 추적 할 수있다. 예컨대 비오틴 덱스 아민 (BDA)와 같은 다른 신경 추적자를 동일한 사용될 수있다 목적. 내부 캡슐 내의 타겟의 정위 좌표는 내부 캡슐 운동 피질의 앞다리 영역에서 발생 축삭 돌기를 추적함으로써 설명 될 수있다.
2 주 운동 피질의 앞다리 지역에서 유래 AAV-GFP. GFP-형질 축삭 섬유의 주입 후 내부 캡슐의 앞다리 지역의 그림 1. 식별은 시상 (화살표)의 ventrolateral 핵에 표시되고, 내부 캡슐 (화살촉)의 꼬리 부분입니다. 점선은 내부 캡슐의 형상을 나타내고, 숫자는 브레 그마로부터의 거리를 참조. 해마, 마; CPU, 미상 피질; VL, ventrolateral 핵; IC는 내부 캡슐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
최적 광량은 동물의 체중 및 균주 및 유형 및 직경에 따라 상이 할 수있다 광섬유. 따라서, 최적의 광 강도는 주 경색 병소 실험 별도로 전에 결정되어야한다. 병변의 정도를 조직 학적 범위를 비교하여 (도 2). 최적의 광 강도가 확인 될 수있는 이웃 회백질 구조를 파괴하지 않고 내부 캡슐의 전체 폭을 커버 할 때까지 photothrombotic 과정을 사용하여, 광 강도는 서서히 증가 될 수있다 경색 병변 및 위치.
그림 Photothrombotic의 lesioning 후 5 mW의 2 주에 2 mW의에서 레이저 빛 다양한 강도의 맞은 편에 경색 병변 2. 넓이는. 최적의 광량이 실험 설정에서 3 mW의 4 mW의 사이로 간주됩니다. 화살표는 경색 병변을 나타냅니다./53281/53281fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
우리는 광섬유 얇은 금속 튜브 (척추 바늘)에 포함되는 ONI를 사용하는 것을 선호한다. 광섬유는 광섬유 관을 따라 추가적인 신경 손상을 발생시킬 가능성이 섬유 측으로부터 최소 광산란을 생성 할 수있다. 광섬유 넣음 깊은 대상 광파이버의 굴곡을 방지 할뿐만 아니라, 정위 프레임 (도 3)에 ONI를 부착하는 것도 바람직하다.
광학 - 신경 인터페이스 (ONI)의 그림 3. 건설. (a)는 척추 바늘의 절단. 광섬유의 스트리핑 (b). (C & D)를 고정 금속 튜브가 위에 삽입벗겨진 광섬유 비좁은는 척추 바늘 허브에 광파이버를 고정. (E) 에폭시 첨가 광섬유 척추 바늘에 삽입된다. (F) 에폭시는 20 분 동안 100 ℃에서 경화된다. (g) 광학 섬유는 척수 바늘의 선단에서 절단된다. (H) 광학 섬유는 연마된다. (ⅰ) 광량이 광섬유의 끝에서 측정한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
photothrombotic 절차는 모터 손상의 70 % 성공 ~으로 재현 병변 및 위치를 생성합니다. 일반적인 캡슐 경색 병변 캡슐 섬유 (그림 4A)의 ventrodorsal 차원을 포함한다. 또한, 경색 병변 때문에 캡슐 섬유 내부에 증가 된 빛의 산란의 내부 캡슐의 전후 축을 따라 연장. (도 4b)는 내부 캡슐 아래에 위치한 광 요로 백질 섬유로 구성되어; 따라서, 그것은 종종 증가 된 빛의 강도의 조사에 의해 손상되었습니다. 직렬 섹션과 염색은 경색의 전체 볼륨과 범위를 확인해야합니다. 경색 용적은 0.63 ± 0.37 mm 3이었다. 캡슐 섬유, 신경 미세 섬유의 파괴를 평가하고 룩솔 빠른 블루 PAS 얼룩은 도움이된다합니다.
Photothrombosis 후 캡슐 경색 3 주 4. 현미경 모양 그림. 캡슐 경색의 현미경 모습을 삼주 photothrombosis 후. 쥐 뇌의 코로나 섹션 A) 뇌 조각. 화살촉은 시상과 내부 캡슐까지 광섬유를 포함 바늘의 기관을 나타냅니다. B) 관상 뇌 조각의 showi의 직렬 Nissl 염색 내부 캡슐 경색 병변의 전체 범위 겨. 화살촉이 경색 병변을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
모델링의 성공은 태스크 도달 한 펠렛을 사용하는 행동 시험에 의해 평가 될 수있다. 경색의 lesioning 다음 일주 후 행동 성능은 매일 하나의 펠렛에 도달 훈련 (그림 5)에도 불구하고 SPRT의 지속적이고 현저한 장애를 수반 정확한 병소를 확인하는 좋은 가이드입니다. 모터 적자가 PRG에 표시되면, 신경 학적 결손이 관찰 3 개월 동안 지속되었다. 가짜 운영 그룹은 수술 후 SPRT 성능의 유의 한 감소를 보이지 않았다.
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캡슐 Infart 4,20 후 점수에 도달 싱글 펠렛 5. 변경 그림. 실험 그룹 (PRG 및 MRG)은 크게 전시 된 가짜 운영 그룹 (SOG)에 비해 경색의 lesioning 후 즉시 점수를 감소. PRG 시간이 지남에 영구 모터의 손상을 나타내는 반면 MRG는 SPRT 공연의 점진적 회복을 나타낸다. 연산, photothrombotic 경색의 lesioning; PRG 불량 복구 기; MRG, 중간 복구 그룹입니다. 통계적 유의성 차이는 반복 측정 분석을 사용하여 측정 하였다. MRG 대 + SOG; * PRG 대 SOG. 데이터는 SEM ± 수단이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 캡슐 경색 모델은 앞다리의 기능에 현저한 및 영구 모터의 손상과 목표 병변을 보여줍니다. 피질 캡슐 스트로크의 이전 모델은 모터의 손상 및 빠른 복구 프로세스 6,8,9의 부족 정도를 증명하고있다. 이런 의미에서,이 모델은 장기 작용 성 손상을 나타내는 임상 캡슐 경색 케이스를 닮았다.
외접 캡슐 경색 모델의 개발에 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 올바르게 내부 캡슐 내에서 기능을 비활성화하기위한 신체 부분의 somatotopic 표현을 식별; 2) 회백질 구조 이웃 최소 침해와 내부 캡슐의 전체 폭을 파괴 할 수있는 그린 레이저의 최적의 강도를 식별하는 단계; 3) 정확히 표적 구조의 광섬유를 배치한다. 제시된 기술은 외접을 유도 할 수 있지만높은 복제 속도 (> 70 %)와 디 캡슐 경색 모델 내부 캡슐의 전체 폭을 덮는 파괴의 완결성의 타겟팅 및 정도의 작은 차이는 상이한 모터 적자 차지하고있다.
피질 기관은 somatotopic 조직 (15)의 논란에도 불구하고 인간의 내부 캡슐의 후부 다리의 앞쪽 절반에 자리 잡고 있습니다. 반면에 상응하는 분류 또는 설치류의 내부 캡슐의 somatotopic 조직의 자세한 해명이 없었다. somatotopic 조직에 대한 지식의 부족은 종종 캡슐 경색 모델 중 다른 모터 결과와 내부 캡슐 내에서 경색의 lesioning의 잘못된 대상에 연결됩니다. 그러나 가능성 앞다리 모터 섬유의 경로를 나타내는 내부 캡슐의 꼬리 부분에서의 GFP 형질 축삭을 확인 하였다. 또한,이 지역 demonstrat의의 lesioning앞다리에 도달 기술의 표시 및 지속적인 적자를 에드. 따라서 캡슐 경색 모델의 유효성을 향상시키기 위해 정위 병소에 대한 내부 캡슐의 꼬리 부분을 추천한다.
ONI의 변형 동물, 체중, 광원 종류 경색 다른 크기를 생성 할 수 있기 때문에, 광 강도의 사전 조정은 뇌졸중 모델에서의 경색 병변의 균일 정도를 생산하는 필수이다. 만족스러운 경색 병변이 최소한의 광 강도로 될 때까지 따라서 동일한 균주 및 체중과 실험 동물에 다른 광 세기를 이용한 예비 실험을 실시한다.
캡슐 섬유의 전체 폭을 파괴 할 수있는 강력한 빛의 세기는 (전후방 및 dorsoventral 정도) 주변 구조에 최소한의 피해와 앞다리 영역에 대응하는 최적의 빛의 세기로 간주됩니다. forelim내부 캡슐의 B 영역은 우량 시상 및 하방 광학 기관에 의해 제한된다. 따라서 ONI 삽입 깊이는 상측과 하측 주변 구조의 보존과 동시에 상기 dorsoventral 방향으로 IC의 전체 범위를 파괴 정확해야한다. ONI의 부정확 한 배치는 캡슐 내부에 남아있는 피라미드 섬유의 시냅스의 결과로서 상기 모터 적자의 신속한 회복을 유도하는 IC의 불완전한 파괴를 초래한다. 시리얼 조직 학적 검사에서 영구 모터 적자의 유도에서 가장 혼란 요인은 PLIC 4,16의 전체 폭을 파괴하는 실패에 이르게 ONI의 잘못된 위치했다. 따라서 세심한주의가 올바른 목표에 도달하기 위해 지불해야한다. 최근 블라시 외는. 계속되는 순수 모터 적자 후방 내부 캡슐 경색 병변함으로써 제조 할 수 있다고보고엔도 텔린 -1 (ET-1) (17)을 사용. 그러나, ET-1은 ET-1의 확산에 의해 이웃 회백질 구조를 파괴 할 수있다.
행동 검사는 내부 캡슐 경색 병변의 형성을 평가할 수있는 실험실에서 즉시 사용 가능한 기준이다. 그러나 일주 경색의 lesioning 후 모터 성능의 평가는 보통 가난한 복구 그룹으로 동물을 분할하는 것이 좋습니다. 가난한 복구가 <50 %의 복구로 정의 하였다 반면 보통 복구는 이전의 lesioning의 점수와 비교> 50 % 성능 점수의 증가로 정의 하였다. 앞다리 모터 행동 시험 중 태스크 도달 단일 펠릿 뇌졸중 유도 모터 (14)의 공연 정성 및 정량 측정을 모두 가장 중요한 시험이다. 동시에 이러한 잡고 식품 입수 같이 앞다리 사용 분석을 제공하면서 작업 정량적 도달 성공을 측정작은 공. 도달 움직임의 정성 분석 정품 기능 회복 또는 보상 (20)를 구별함으로써 뇌졸중 회복의 질을 차별화하는 것이 도움이된다. 여기서 우리는 간단히 SPRT의 정량적 측정을 설명; 그러나, 프레임 별 분석을 기반으로 촬영하고 점수를 사용하여 정성 분석은 더 자세한 분석을 권장합니다.
여기에 제시된 기술들은 외접 캡슐 경색 모델의 유도에 국한 될 필요는 없다. 이 기술은 이러한 뇌량 백색 물질의 다른 영역, 전방 교련 신경 구조 간의 연결 섬유의 경색 병변의 유도에 적용될 수있다. 백색 물질의 광학적 특성에 기초하여 ONI 작고 photothrombotic 기술의 조합이 인접 구조물에 피해를 최소화하여 표적 구조를 파괴 할 가능성이있다. 예를 들어, 열공 경색 쉽게 생성 될 수있다모터,인지, 및 메모리 기능과 관련된 피질 하 구조를 타겟팅하여 D. 타겟 구조 크면 ONI 다른 타겟팅 및 각도 궤적 다중 삽입은 병변의 원하는 범위를 생성하도록 요구 될 수있다.
이 기술의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이 기술은 PLIC 이후 회복 경색 병소의 결과를 입증하기에 충분하다. 흰색 물질의 photothrombotic 파괴 약간 인간의 WMS 차이가 있기 때문에,이 모델은 인간의 WMS의 전체 스펙트럼을 반영하지 않습니다. 따라서, 신경 생물학적 또는 MRI 영상 소견은 photothrombotic의 lesioning의 초기 단계에서 서로 다른 기능을 나타낼 수있다. 따라서이 모델은 적절 모델의 장점과 단점을 절충하는 데 사용되어야한다. 매우 정확한 절차를 필요로하기 때문에 기술적으로, 모든 수술이 모델에 표시된 영구 모터 적자를 생성 할 수 있습니다. 에스pecifically, 지식과 경험을 가진 손은이 모델의 생성에서 높은 재현성을 생산해야합니다.
결론적으로, photothrombotic 기술 광량의 최적화, 정확한 표적의 병용 외접 캡슐 경색 모델을 생성하기위한 유용한 기술이다. 이 모델은뿐만 아니라 행동, 회로에서 WMS, 및 세포 수준의 연구뿐만 아니라 새로운 치료 및 재활 개입의 유용성을 평가하는 데 도움이 될 것입니다.
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Acknowledgments
이 작품은 의료 시스템 공학 연구소 (iMSE) GIST에서 GIST-Caltech의 공동 기금 (K04592)에서 부여에 의해 과학, ICT와 미래 기획의 교육부에 의해 투자 한국의 NRF을 통해 기초 과학 연구 프로그램에 의해 지원되었다 (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 125, 2-220 (2012).
- Debette, S., Markus, H. S. The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging: systematic review and meta-analysis. Bmj. 341, 3666 (2010).
- Zhang, K., Sejnowski, T. A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex. PNAS. 97 (10), 5621-5626 (2000).
- Kim, H. S., et al. A rat model of photothrombotic capsular infarct with a marked motor deficit: a behavioral, histologic, and microPET study. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 683-689 (2014).
- Kleim, J. A., Boychuk, J. A., Adkins, D. L. Rat models of upper extremity impairment in stroke. ILAR J. 48 (4), 374-384 (2007).
- Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169 (2), 206-211 (2006).
- He, Z., et al. Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique. J Neurol Sci. 182 (1), 16-28 (2000).
- Tanaka, Y., et al. Experimental model of lacunar infarction in the gyrencephalic brain of the miniature pig: neurological assessment and histological, immunohistochemical, and physiological evaluation of dynamic corticospinal tract deformation. Stroke. 39 (1), 205-212 (2008).
- Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann Neurol. 17 (5), 497-504 (1985).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40 (1), 248-253 (2009).
- Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Handbook of biomedical optics. 83, CRC Press. Boca Raton, Fl. (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Whishaw, I. Q., Whishaw, P., Gorny, B. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a movement rating scale. J Vis Exp. (18), e816 (2008).
- Jang, S. H. A review of corticospinal tract location at corona radiata and posterior limb of the internal capsule in human brain. NeuroRehabilitation. 24 (3), 279-283 (2009).
- Kim, D., et al. Longitudinal changes in resting-state brain activity in a capsular infarct model. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (1), 11-119 (2014).
- Blasi, F., Whalen, M. J., Ayata, C. Lasting pure-motor deficits after focal posterior internal capsule white-matter infarcts in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (6), 977-984 (2015).
- Metz, G. A., Antonow-Schlorke, I., Witte, O. W. Motor improvements after focal cortical ischemia in adult rats are mediated by compensatory mechanisms. Behavioural brain research. 162 (1), 71-82 (2005).
