Abstract
Einer der anregendsten Beobachtungen in der Pflanzenentwicklung eine Korrelation zwischen dem Auftreten des Erdmagnetfeldes (GMF) Auflösungen (oder Ausflüge) und dem Zeitpunkt der Strahlung der Angiospermen. Dies führte zu der Hypothese, dass Veränderungen im GMF Polarität kann eine Rolle bei der Pflanzenevolution spielen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um diese Hypothese durch Aussetzen Arabidopsis thaliana künstlich umgekehrt GMF Bedingungen zu testen. Wir verwendeten ein Drei-Achsen-Magnetometer und die gesammelten Daten wurden verwendet, um die Größe des GMF berechnen. Drei DC-Netzteile wurden zu drei Helmholtz-Spulenpaare verbunden und wurden von einem Computer gesteuert, um die GMF Bedingungen zu ändern. Pflanzen in Petrischalen gezüchtet wurden sowohl normale freigelegt und umgekehrt GMF Bedingungen. Schein-Expositions-Experimente wurden ebenfalls durchgeführt. Exposed Pflanzen wurden während des Experiments fotografiert und die Bilder wurden analysiert, um die Wurzellänge und Blattflächen zu berechnen. Arabidopsis Gesamt-RNA wurde extrahiert und QuantitativeEchtzeit-PCR (qPCR) Analysen wurden auf die Genexpression von Cruciferin 3 (CRU3), Kupfer Transport protein1 (COTP1), Redox gesteuerten Transkriptions Factor1 (RRTF1), Fe Superoxide Dismutase 1 (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal geführt Ascorbatperoxidase (TapX), einer zytosolischen Ascorbat Peroxidase1 (APX1) und NADPH / respiratory burst oxidase Protein D (RbohD). Vier verschiedene Referenzgene wurden analysiert, um die Ergebnisse der qPCR normalisieren. Die beste der vier Gene, wurde ausgewählt und die stabilste Gen zur Normalisierung verwendet. Unsere Daten zeigen zum ersten Mal, dass die Umkehrung der Polarität GMF mit dreiachsigen Spulen hat erhebliche Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum und die Genexpression. Dies stützt die Hypothese, dass die GMF Umkehr trägt zu induzieren Veränderungen in der Pflanzenentwicklung, die einen höheren Selektionsdruck rechtfertigen könnten, was schließlich zu p führendenlant Evolution.
Introduction
Das Magnetfeld der Erde (oder äquivalent das Erdmagnetfeld, GMF) ist eine unausweichliche Umweltfaktor für alle lebenden Organismen auf der Erde, einschließlich Pflanzen. Die GMF ist seit jeher eine natürliche Eigenschaft der Erde, so dass im Laufe der Evolution erlebten alle Lebewesen seine Wirkung. Liegen zunehmend Belege dafür, dass das GMF der Lage ist, viele biologische Prozesse 1 beeinflussen. GMF nicht einheitlich, und es gibt erhebliche lokale Unterschiede in der Größe und Richtung an der Oberfläche der Erde. Die GMF an der Erdoberfläche zeigt eine breite Palette von Größen, von weniger als 30 & mgr; T, um fast 70 & mgr; T. Die GMF schützt die Erde und ihrer Biosphäre von den tödlichen Auswirkungen der Sonnenwind durch Ablenken meisten seiner geladenen Teilchen durch die Magnetosphäre 2.
Pflanzen reagieren auf Reize aus der Umwelt; und der klassischen Reaktionen auf abiotische Faktoren wie Licht und Schwerkraft haben t gewesenhoroughly durch Definition der sogenannten phototropen und gravitrope Reaktionen beschrieben. Sehr wenig oder gar nichts tun, wird über die Mechanismen der Wahrnehmung und Reaktionen von Pflanzen gegenüber Magnetfeldern bekannt, trotz der Fülle von Arbeiten zu diesem Thema veröffentlicht und vor kurzem überprüft 1. Anders als das Gravitationsfeld, änderte sich die GMF konsequent während der Pflanzenentwicklung damit einen wichtigen abiotischen Stressfaktor, der vor kurzem als eine potenzielle Antriebskraft letztlich einen Beitrag zur Diversifizierung und Artbildung 2 pflanzen darstellt. Feldumkehrung (oder Ausflüge) sind Änderungen der Polarität des GMF. Während der Lebensgeschichte der Erde, GMF Wertaufholungen kam mehrmals. Diese freiliegenden den Planeten zu Zeiten der reduzierten GMF Festigkeit bei jedem Polaritätsübergang. Einige Autoren haben die Hypothese aufgestellt, dass diese Übergänge Zeiten geringer GMF Stärke könnte erlaubt haben, ionisierende Strahlung aus dem Sonnenwind auf der Oberfläche der Erde zu erreichen, wodurch eine Induktionkonsistente Belastung für lebende Organismen, die stark genug gewesen, um Gen-Veränderungen schließlich zu induzieren, die zu Evolution 2 pflanzen konnte.
Eine detaillierte Analyse der Experimente beschreiben die Wirkung von Magnetfeldern auf die Pflanzen eine große Anzahl von widersprüchliche Berichte, gekennzeichnet durch einen Mangel der plausiblen biophysikalischen Wirkungsmechanismen. Viele Experimente sind einfach unrealistisch, während andere fehlt eine testbare Hypothese, und letztlich nicht überzeugend 3. In den letzten Jahren hat sich der Fortschritt und Stand der Forschung über die Wirkung von Magnetfeldern auf die Anlage überprüft 2,4-11. Vor kurzem hat die Wirkung der beiden niedrigen und hohen Magnetfeld eingehend erörtert 1 wurde, mit einem besonderen Schwerpunkt auf der Beteiligung von GMF Umkehr Veranstaltungen an Pflanzenevolution 2.
Die direkte Methode, um die Hypothese zu untermauern, dass GMF Auflösungen beeinflussen Pflanzenevolution ist es, eine GMF synthetisierenUmkehr im Labor durch Testen der Reaktion von Pflanzen auf normale und umgekehrte Magnetfeldbedingungen. Um die Hypothese zu testen, daher haben wir eine achteckige dreiachsigen Helmholtzspule-Paaren Magnetfeld-Kompensationssystem (Drei-Achs-Spulen), die in der Lage, die normalen GMF Bedingungen genau umgekehrte ist.
Wir verwendeten Arabidopsis thaliana als Modellpflanze und wir die Wirkung rückgängig GMF auf die Genexpression einiger wichtiger Gene getestet: Cruciferin 3 (CRU3), die eine 12S Samenspeicherprotein, das tyrosinphosphorylierten ist und dessen Phosphorylierungszustand in Reaktion moduliert kodiert ABA in Arabidopsis thaliana Samen 12,13; Die Kupfer Transport protein1 (COTP1), die eine Schwermetalltransport / Entgiftung Super Protein mit der vorherrschenden Funktion im Boden Cu Erwerb und Pollenentwicklung 14 kodiert; und Redox-gesteuerten Transkriptions Factor1 (RRTF1)dass kodiert für ein Mitglied des ERF (Ethylen-Antwort-Faktor) Unterfamilie B-3 der EFF / AP2 Transkriptionsfaktor-Familie, die eine AP2-Domäne, die die synergistische Co-Aktivierung der Genexpression Wege sowie verleihen Quer Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen betont 15 enthält.
Darüber hinaus haben wir auch analysiert fünf Gene in oxidativen Stress-Antworten beteiligt sind: Fe Superoxid Dismutase1 (FSD1), das ein zytoplasmatisches Enzym, das enzymatisch und schnell wandelt das Superoxidanion kodiert (O 2 -) und Wasser (H 2 O) zu Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) und molekularem Sauerstoff (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), dass dieses Enzym codiert, und die den Abbau von H 2 O 2 in Wasser und Sauerstoff 17,18 katalysiert; Thylakoidal Ascorbatperoxidase (TapX), das ein kodiert Chloroplasten thylakoid Peroxidase, die H 2 O abfängt2 19; Ascorbate Peroxidase1 (APX1), das eine cytosolische Peroxidase umfaßt, die H 2 O 2 spült und stellt eines der möglichen Ziele von post-translationalen Modifikationen von NO-abgeleiteten Molekülen 20 vermittelte codiert; und NADPH Respiratory Burst-Oxidase Protein D (RbohD), die ein Enzym, das O 2 erzeugt codiert - und spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Wachstums, der Entwicklung und Stressantworten in Arabidopsis 21.
Unsere Feldumkehr Methode liefert den ersten Beweis, dass GMF Umkehr kann eine signifikante Veränderung in der Morphologie und Genexpression von A. induzieren thaliana Wurzeln und Sprossen. Dieses Protokoll stellt eine innovative Möglichkeit, die Wirkung von GMF Umkehr auf Pflanzenmorphologie und der Genexpression zu bewerten und kann verwendet werden, um die möglichen Auswirkungen der GMF Umkehr auf andere Aspekte der Anlagenverhalten zu bewerten und dadurch zu führen Diskussion der role der GMF Umkehr auf die Pflanzenentwicklung.
Protocol
1. Einstellung der Triaxial Coils
ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt die für die GMF Rückwärts triaxiale Spulen.
- Einschalten des Drei-Achsen-Magnetometer, dessen Sonde in die triaxiale Spulen eingesetzt ist.
- Schalten Sie den Computer und starten Sie die Magnetometer-Software, die Daten, die von Drei-Achsen-Magnetometer gesammelt werden können.
- Mithilfe der Komponentenwerte des Magneto gemeldet, um die Größe des GMF berechnen. Zum Beispiel mit Magneto Werte: Bx = 6,39 & mgr; T, By = 36,08 & mgr; T, Bz = 20,40 & mgr; T zu berechnen einer Feldstärke von 41,94 & mgr; T unter Verwendung der folgenden Gleichung: B = B GMF + B zusätzliche, wobei B zusätzliche = (Bx 2 + durch 2 + Bz 2) ½ (dh 41,9 & mgr; T im Beispiel.)
- Schalten Sie die drei DC-Stromversorgungen (dual Bereich: 0-8V / 0-20V 5A und / 2.5A, 50W) jede 1-3 coupl verbundenes Helmholtz-Spulen und an einen Rechner über eine GPIB-Verbindung (1B) verbunden ist.
- Set Spannungen der Netzteile, um das gewünschte Magnetfeld mit einer umgekehrten Magnetfeld-Vektor zu erzeugen. Zum Beispiel mit B GMF wie in Schritt 1.3 und mit der Spulengröße des hier beschriebenen Instrumente, setzen Sie die Spannungen V x = 0,00 V, V y = 30,52 V, V z = 0,00 V, um eine neue resultierende B zu erzeugen = B + B GMF triaxiale Spulen = (6,38, -36,08, 20,39) & mgr; T. dh ein neues Feld mit der gleichen Größenordnung wie B GMF sondern zeigt auf eine andere Richtung.
- Stellen Sie sicher, das neue Feld mit dem Magnetometer-Software unter Verwendung der in 1.3 beschriebenen Verfahren.
- Expose Pflanzen zu normalen und umgekehrt GMF Bedingungen unter Verwendung Petrischalen, wie in Kapitel 2 beschrieben.
- Führen Schein-Expositions-Experimente, indem sie die Größe des Feldes gleich | B GMF | und Haltungdie vertikale Komponente des Feldes gleich der des GMF jedoch unter Veränderung der Richtung (dh "Nord, Ost oder West") der horizontalen Komponente des Feldes mit gleichen Strömen in den triaxialen Spulen im Vergleich zu der Feldumkehr Zustand. Dies geschieht durch Änderung der Spannung der Spulen, wie in 1.5 beschrieben.
Hinweis: Diese Schein-Exposition schließt potentielle subtile Heizung oder Schwingungseffekte entweder die Spulen selbst oder von den verwendeten, um die Spulen Steuerelektronik. - Laufen Doppelblindversuchen, indem Feldbedingungen vom Personal geblendet Führen des Rests der Experimente und / oder der Interpretation der Daten.
2. Herstellung von Pflanzen Materialien und Bedingungen für das Pflanzenwachstum
- Verwenden Samen von Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia 0 (Col 0), setzen dann in ein 1,5-ml-Röhrchen und Oberflächen sterilisiert durch Behandlung mit einer 5% (w / v) Calciumhypochlorit-Lösung und 0,02% (v / v) Triton X-100 in 80% Ethanol (EtOH), für 10-12 min bei 25-28 ° C unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Dann spülen Sie zweimal mit 80% EtOH, wäscht mit 100% EtOH und schließlich mit sterilem destilliertem Wasser spülen.
- Bereiten Sie 1 l Murashige und Skoog 22 (MS) modifiziertes Medium durch Zugabe von: 2,297 g MS (0,5 x MS Basal Salzmischung), 10 g Sucrose, VE-Wasser bis zu 1 l, pH 5,8 bis 6,0 mit KOH eingestellt. 16 g Agar Autoklavieren für 20 min, 120 ° C.
- Vor der Verfestigung, gießen Sie 80 ml Medium in jede (120 x 120 mm 2) Quadratisch Petrischalen. Säen dreißig sterilen Samen auf Platte, und dann Dichtungsplatten mit einer wachsartigen Film.
- Vernalize die Platten horizontal in der Dunkelheit bei 4 ° C für 2 Tage, um eine Verstärkung und Keimung zu synchronisieren und dann Petrischalen ausgesetzt werden entweder in normaler oder umgekehrter GMF.
- Aussetzen Samen in einer klimatisierten Umgebung bei 22 ° C in einer vertikalen Position in Parallelversuchen sowohl innerhalb der dreiachsigen Wicklungen und außerhalb der triaxiale Spulenunter einer Photoperiode von 8 h Zeitplan Dunkelheit und 16 Stunden Licht, mit Natriumdampfleuchten (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Verwenden Sie einen blauen Gelatinefilm für Spotlight, um die Rot-Komponente der Leuchtmittel zu reduzieren.
- Aussetzen Pflanzen für 10 Tage vor der RNA-Extraktion sowohl normalen (Kontroll-) und Umkehrung (Behandlung) GMF Bedingungen.
- Nach der Belichtung fotografieren Petrischalen.
- Verwenden Sie die ImageJ Software zur Wurzellänge und Blattflächen zu berechnen.
- Kurz gesagt, messen Sie die Seite der Petrischale, dann öffnen Sie das Bild der Petrischale und mit Hilfe der "gerade" Zeilenoption, um eine Linie, die genau durchquert die Plattenseite zu zeichnen.
- Im Menü "Analysieren", wählen Sie "Skala" und setzen Sie den tatsächlichen Abstand in der "bekannte Strecke" Box (zB 120 mm), legen Sie dann die Einheit der Länge (mm); Schließlich klicken Sie auf die "globalen" Optionseinstellungen zur Verfügung für alle Messungen zu machen.
- Für root Länge, beachten Sie unbedingt die Form der Wurzel, indem Sie die Freihandwerkzeug. Messen Sie die Länge mit Hilfe der Option "Maßnahme" im "Analyse" Menü. Weiterhin alle Wurzeln auf dem Bild zu messen und speichern Sie die Datei zur weiteren statistischen Analysen.
- Für Blattfläche, aus dem Menü "Bild" verwenden Sie die Option und dann "Farbschwelle" einzustellen. Wählen Sie die einzelnen Blatt und im Menü "Analysieren", wählen Sie "analysieren Teilchen". Speichern Sie die einzelnen Messungen für statistische Auswertungen.
3. Arabidopsis Gesamt-RNA-Extraktion, quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) Reaktionsbedingungen und Primer für Arabidopsis
- Getrennt sammeln 30 Triebe und 30 Wurzeln und sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren. Dann mahlen in flüssigem Stickstoff mit Mörser und Stößel.
- Isolieren der Gesamt-RNA mit einem Reinigungs-Kit und RNase-Free DNase-Behandlung-Kit mit Hilfe manufacturAnleitungen er ist.
- Überprüfen Probe qualitativ und quantitativ unter Verwendung eines RNA-nano-Kit und Kapillargelelektrophorese nach Herstelleranweisungen. Bestätigen Sie die Quantifizierung von RNA spektrophotometrisch.
- Verwendung 2 ug Gesamt-RNA und zufällige Primer unter Verwendung eines cDNA Reverse Transkription Kit zur Erststrang-cDNAs entsprechend den Empfehlungen des Herstellers erhalten.
- Führen Sie alle Experimente auf einem Real-Time System mit SYBR Green I mit ROX als interne Lade Standard.
- Führen die Reaktion mit 25 ul Mischung, bestehend aus 12,5 ul 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 & mgr; l cDNA und 100 nM Primer. Verwenden Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Primer. Fügen Sie in der Kontrollgruppe nicht-RT Kontrollen (mit Gesamt-RNA ohne reverse Transkription, um Kontamination mit genomischer DNA zu überwachen) und Nicht-Template-Kontrollen (Wasser anstelle von Vorlage).
- Berechnen Primereffizienz für alle Primer-Paare unter Verwendung des Standard-Kurvenverfahren 23.
- Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min bei 95 ° C, 40 Zyklen von 15 s bei 95 ° C, 30 sec bei 58 ° C und 30 sec bei 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, KW3, TapX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min bei 95 ° C, 40 Zyklen von 15 s bei 95 ° C, 20 sec bei 57 ° C und 30 sec bei 72 ° C.
- Lesen Fluoreszenz nach jedem Anlagerungs- und Verlängerungsphase. Für alle Läufe, führen eine Schmelzkurvenanalyse 55-95 ° C, indem sie die Dissoziation Segment in dem Wärmeprofil. Verwenden Sie die Dissoziationskurve Bildschirm, durch die Ergebnisse Register zugegriffen wird, um die Dissoziation Profil (Plot der Fluoreszenz als Funktion der Temperatur) anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass die während der Dissoziation Segment des Experiments gesammelt Datensatz wird für die Analyse ausgewählt unter Verwendung der Analyse / Setup-Bildschirm.
- Bestimmen Sie die linear Reihe von Template-Konzentration auf Schwellenzykluswert (Ct-Wert), indem eine zehnfache Verdünnungsreihe (1- bis 10 3 -fach) unter Verwendung von cDNA aus drei unabhängigen RNA-Extraktionen in drei technische Replikate 24,25 analysiert.
- Analysieren Sie alle Verstärkungsgrundstücke mit der Real-Time PCR Instrument Software Ct-Werte zu erhalten. Kalibrieren und zu normalisieren relativen RNA-Spiegel mit dem Niveau der besten Haushaltsgenen wie folgt: 3.11.1) Besuchen Sie das Amplification Plots Bildschirm über die Registerkarte Ergebnisse, wählen Sie die Rampe oder Plateaus, für die Daten sollten mit der Siebanalyse Selection / Setup untersucht werden, und wählen Sie dann die DRN (basislinienkorrigierten normalisierten Fluoreszenz) von der Fluoreszenz-Menü auf der Bedientafel. Besuchen Sie das Kennzeichen Beispielwerte Bildschirm über die Registerkarte Ergebnisse, um Ct-Werte für die Stichprobe Brunnen anzuzeigen.
- Können vier unterschiedliche Referenzgene [zB zytoplasmatischen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPC2), Ubiquitin spezific Protease 6 (UBP6) Actin1 (ACT1) und der Elongationsfaktor 1B alpha-Untereinheit 2 (eEF1Balpha2)], um die Ergebnisse der Echtzeit-PCR zu normalisieren. Wählen Sie den bestplatzierten-Gen unter Verwendung eines Analyse-Software 26; und verwenden Sie die stabilste Gen für die Normalisierung.
- Kurz gesagt, organisieren die Eingangsdaten auf einem Excel-Sheet mit der ersten Spalte mit den Gen-Namen und erste Zeile mit den Probennamen. Dann wählen Sie die Analyse-Software aus der Menüleiste. Verwenden Sie das Dialogfeld, um die Eingangsdaten zu wählen.
- Als nächstes überprüfen Sie die Felder Beispielnamen, Gennamen und einfach nur ausgegeben. Klicken Sie auf die Go-Taste, um die Analyse durchzuführen. Wählen Sie den bestplatzierten Gen als Kandidaten-Gen meisten stabil exprimiert (was die kleinste Stabilitätswert hat).
- Grundstücksdaten durch Nachweis unterschiedlicher Falte Änderung Ausdruck in beiden Sprossen und Wurzeln.
4. Statistische Analysen
- Express-Daten als Mittelwerte ± Standardfehler. Vergleichen Sie die Zusammenarbeitntrol und die Behandlungsgruppen durch Durchführen einer Varianzanalyse (ANOVA) und Tukey-Test mit Bonferroni und Dunn-Sidak Adjusted Wahrscheinlichkeitstest (0,95% Vertrauen).
Representative Results
Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verfahren zu schaffen, um zu beurteilen, wie in 1A gezeigt, ob Umkehrung des Erdmagnetfeldes (GMF) kann die Pflanzenentwicklung und Genexpression von Arabidopsis thaliana Ökotyp Col 0. Triaxial Spulen beeinflussen, werden verwendet, um die GMF, wenn Satz umkehren mit den entsprechenden Treiberspannungen (1B), erhalten wie in Schritt 1.5 beschriebenen Protokoll. Die Abmessungen der triaxiale Spulen ~ 2 x 2 x 2 m 3, der ausreichend Platz mit umgekehrtem GMF Verhältnisse mehrere Petrischalen Host erlaubt. Kontrollen wurden unter den gleichen Umgebungsbedingungen und bei Normal GMF Werte gewachsen. Nach 10 Tagen Exposition gegenüber normalen und umgekehrten GMF Bedingungen der Phänotyp der Pflanzen zeigten morphologische Veränderungen offensichtlich. Wie in Figur 2 gezeigt, die Kontrollpflanzen (dh bei normalen Bedingungen gezüchtet GMF) zeigte Wurzellängen mit signifikant (Dunn-Sidak und Bonferroni bereinigt Prob <0,001;Student-t = 10.68, df = 31), höhere Werte (29,41 mm; SEM = 1,04; n = 32) in Bezug auf Pflanzen umgekehrt GMF ausgesetzt (17,53 mm; SEM = 0,58; n = 36). In GMF-Anlagen umgekehrt wurde die Morphologie der Triebe auch durch, die eine reduzierte Entwicklung der Packungsbeilage Expansion verändert. Pflanzen in den normalen Bedingungen ausgesetzt zeigte eine durchschnittliche Blattfläche von 4,95 mm 2 (SEM 0,025, n = 54), während die Pflanzen umgekehrt GMF Bedingungen ausgesetzt deutlich zeigten (Dunn-Sidak und Bonferroni Bereinigt Prob = <0,001; Schüler t = 31.32, df = 53) unteren Blattbereich-Werte (3,71 mm 2; SEM = 0,032; n = 54). Daher Exposition von Arabidopsis rückgängig GMF Bedingungen führte zu einer Verringerung sowohl der Wurzellänge und Blattfläche.
Blattausdehnung und Wurzelwachstum sind abhängig sowohl von der Trennfläche und der Dehnung der Zellen 27. Daher Pflanzenentwicklung, Produktivität und allgemeine Fitness sind abhängig von einer optimalen shoot- und Wurzel-System-Architektur <sup> 28. Die reduzierte Wurzellänge und Blattgröße von Pflanzen zu wend GMF Bedingungen ausgesetzt zeigen das Vorhandensein von einem Erfassungssystem in der Lage, nicht nur das wahr Variationen in der Magnetfeldstärke, sondern auch auf Änderungen des Magnetfeldes "direction" im Vergleich zur Schwerkraft reagieren. Die Hypothese, dass GMF Umkehr kann das Pflanzenwachstum beeinflussen findet überzeugende Beweise in unseren Experimenten, die zeigen, dass GMF Umkehrbedingungen erheblich Pflanzenentwicklung auswirken.
Die morphologischen Veränderungen wurden auch durch Veränderungen in der Genexpression begleitet. Unter Haushaltsgenen war die stabilste Gen Elongationsfaktors 1B alpha-Untereinheit 2. Die erste Gruppe von Genen (CRU3, COTP1, RRTF1) zeigte eine dramatische Veränderung in der Genexpression (Abbildung 3). Erschießen Expression aller drei Gene signifikant um etwa das 2,5-fache erhöht (P <0,05) in Anlagen zur Rücklage ausgesetztd GMF Bedingungen. Root Expression CRU3 wurde in den Wurzeln der Pflanzen in den Normal GMF Bedingungen ausgesetzt hochreguliert, jedoch war signifikant (P <0,05) in der Umkehr GMF Bedingungen herunterreguliert. Das Gegenteil wurde COTP1 und RRTF1, unter normalen Einsatzbedingungen abgeschwächt und in Gegenwart von GMF Umkehr hochreguliert wurden (Figur 3) festgestellt.
Cruciferin (a 12 S-Globulin) ist das häufigste Speicherproteins in den Samen von A. thaliana und andere Kreuzblütler und als Vorstufe im rauen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert. Es wird dann auf die Lagerung des Proteins Vakuolen 13 transportiert. Sämling Keimung erfordert die Aufteilung der Cruciferin, die als eine anfängliche Stickstoffquelle verwendet wird. Herabregulierung von Cruciferin Abbau reduziert Embryonen Entwicklung von Zellstrukturen oder Zellbestandentwicklungs 29,30 beeinträchtigen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Hochregulierung von CRU3 korreliert miteine untere Blattausdehnung und eine reduzierte Wurzellänge, was darauf hinweist, daß dieses Gen in empfindlich GMF Umkehr und dass seine Überexpression kann die Reduktion der Pflanzenentwicklung beitragen. Außerdem induziert GMF Umkehr eine signifikante Herabregulation CRU3 in Wurzeln, die mit einem reduzierten Wurzellänge korreliert. Kupfer ist ein essentielles Co-Faktor für die wichtigsten Prozesse in Pflanzen, aber es schädliche Auswirkungen, wenn mehr ausübt; Somit überexprimierenden Kupfertransport beeinträchtigt das Pflanzenwachstum. Die Wirkung von GMF Umkehr gab eine signifikante Überexpression von COTP1 in beiden Sprossen und Wurzeln, was erklärt die reduzierte Pflanzenwachstum. Ionen Stress beeinträchtigt Chloroplasten Stoffwechsel, die fest an den Redoxzustand der Zelle verbunden ist. In Arabidopsis der Transkriptionsfaktor RRTF1 ist wichtig für die Expression von Genen, mit der Fähigkeit assoziiert zu justieren, um Redoxveränderungen 31. Deshalb, wenn Pflanzen werden auf äußere Reize in der Lage, ihre physiologischen und Entwicklung verändern ausgesetztal Programme eine Überexpression dieser wichtigen Transkriptionsfaktor zu erwarten ist. Umkehr der GMF induzierte eine signifikante Überexpression von RRTF1 in beiden Sprossen und Wurzeln, was auf höhere oxidative Stressreaktionen von Pflanzen umgekehrt GMF Bedingungen.
Interessante Ergebnisse werden durch die Analyse der fünf in oxidativen Stress beteiligten Gene erhalten. In der Regel haben alle extrahiert und in Trieben analysierten Gene keine signifikanten Unterschiede (P> 0,05), wenn Pflanzen werden in normalen angebaut oder umgekehrt GMF Bedingungen (Abbildung 4 und Abbildung 5) zu zeigen. Jedoch wurde eine signifikante Herabregulierung immer Wurzeln der Pflanzen zu wend GMF Bedingungen ausgesetzt waren. Insbesondere zeigten CAT3 die höchste Herunterregulierung (Bild 5), gefolgt in der Reihenfolge der Herunterregulierung von APX1, FSD1, RBOHD und TapX (Abbildung 4).
Kreuztoleranz einbiotische und abiotische Stress wird durch die Aktivierung verschiedener Gene in verschiedenen biochemischen Stoffwechselwegen beteiligt ist. RRTF1 Transkriptionsfaktor ermöglicht die synergistische Co-Aktivierung der Genexpression dieser Wege 15,31, und können möglicherweise zu oxidativem Stress 32 einbezogen werden. Daher ist die Hochregulation von RRTF1 erwartet, wenn sauerstoffaufnehmende verringert. Herabregulierung von Wurzelfänger Enzyme korreliert mit der Hochregulation von RRTF1, das als Reaktion auf erhöhten oxidativen Stress wirkt. Die dramatische Wurzelherunterregulieren der KW3, APX1 und TapX zeigt die reduzierte Fähigkeit der Wurzelzellen zu H 2 O 2, die durch die verringerte Fähigkeit, die Superoxid-Anion, das durch Herunterregulieren der FSD1 dismutieren begleitet wird abzufangen. Die oxidative Stressantworten in Wurzeln, die auf die Hauptseite umgekehrter GMF Wahrnehmung erscheinen höher.
Abbildung 1. Erdmagnetfeld Vergütungssystem. (A) triaxiale Spulen (umfassend ein Paar von achteckigen Spulen für jede der drei senkrechten Achsen) um den Erdmagnetfeldvektors umkehren. (B) eine computergesteuerte Stromversorgung mit jedem Paar von Helmholtz-Spulen verbunden ist. (Spannungen in diesen Zahlen sind willkürlich) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Auswirkungen der geomagnetischen Feldumkehr auf Arabidopsis-Morphologie. Nach zehn Tagen Exposition Kontrollpflanzen (dh diejenigen, die normale GMF Bedingungen ausgesetzt) zeigen eine signifikant größere Wurzellänge und mehr expanded Blättchen im Vergleich zu Pflanzen, die umgekehrt GMF Bedingungen ausgesetzt wurden. Metric bar = 18 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Auswirkungen der geomagnetischen Feldumkehr auf Arabidopsis Genexpression. Nach zehn Tagen nach der Exposition wurde Gesamt-RNA von Kontroll- und behandelten Pflanzen extrahiert und durch Real-Time PCR für die Expressionsanalyse analysiert. Der Effekt der Umkehrung der GMF war es, eine drastische Veränderung in der Genexpression aller Gene, die CRU3, Cruciferin 3 getestet wurden, zu induzieren;. COTP1, Kupfer Transport protein1; RRTF1, Redox gesteuerten Transkriptions Factor1. Balken zeigen die Standardfehler; Sternchen zeigt signifikante (p <0,05) Unterschiede zwischen plAmeisen, um umgekehrt und normalen GMF Bedingungen ausgesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Auswirkungen der geomagnetischen Feldumkehr auf Arabidopsis Antioxidans-verbundene Genexpression. Nach zehn Tagen der Exposition wird eine Gesamt-RNA von Kontroll- und behandelten Pflanzen isoliert und für die Genexpressionsanalyse mittels Real-Time PCR eingesetzt. Die Wirkung der Umkehr der GMF war, keine signifikanten Veränderungen in shoot Genexpression zu induzieren; Jedoch wurde eine drastische Herunterregulation in root Genexpression von Pflanzen unter Umkehr GMF Bedingungen gezüchtet beobachtet TapX, Thylakoidal Ascorbatperoxidase;. APX1, Ascorbate Peroxidase1; FSD1, Fe Superoxid Dismutase1; RbohD, NA. DPH / Respiratory Burst-Oxidase Protein D Balken zeigen Standardfehler; Sternchen zeigt signifikante (p <0,05) Unterschiede zwischen Pflanzen umgekehrt und normalen GMF Bedingungen ausgesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Effekte des Erdmagnetfeldes Wende an Arabidopsis Katalase 3 (CAT3) Genexpression. Nach zehn Tagen der Exposition wird eine Gesamt-RNA von Kontroll- und behandelten Pflanzen isoliert und für die Genexpressionsanalyse mittels Real-Time PCR eingesetzt. Die Wirkung der Umkehr der GMF war, keine signifikanten Veränderungen in shoot Genexpression zu induzieren; Jedoch wurde eine drastische Herunterregulation in root Genexpression von Pflanzen unter Umkehr GMF Bedingungen gezüchtet beobachtet. Balken zeigen die Standard error; Sternchen zeigt signifikante (p <0,05) Unterschiede zwischen Pflanzen umgekehrt und normalen GMF Bedingungen ausgesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Wir haben kürzlich gezeigt, dass eine erstaunliche Korrelation zwischen GMF Wertaufholungen und der Zeit, als Abzweigung von den meisten der familiären Angiospermen Abstammungslinien aufgetreten 2 existiert. Doch trotz der stimulierenden Hypothesen und der Fülle von Studien über die Wirkung von verschiedenen GMF Intensitäten, die Annahme, dass GMF Umkehr kann selbst herbei signifikanten Veränderungen in Pflanzengenexpressions und Morphologie noch nie gezeigt worden. Hier zeigen wir zum ersten Mal ein Verfahren, das eine achteckige triaxial Helmholtz-Spule verwendet, um GMF in unserem Labor umzukehren, und daß die Umkehr der Umgebungsmagnetfeld phänotypischen Veränderungen und Modulation der Genexpression in Pflanzen verursachen.
Um GMF Umkehr (oder Änderung) über ein ausreichendes Volumen für die Pflanzenwachstumsexperimente (2 x 2 x 2 m 3) zu erhalten, bauten wir einen achteckigen Helmholtz-Spulensystem. Dieses System ist nicht im Handel erhältlich (üblicherweise Helmholtzspulen sind ringförmig und kleiner)und die Kosten für den Bau waren beträchtlich. Wichtig ist, liefert dieses System robuster Feldmodifikation, mit außergewöhnlichen Zeit-Stabilität und Homogenität in den modifizierten Magnetfeldern.
Das System ist so konzipiert und aufgebaut, um den Wert der GMF auf ein Tausendstel der normalen Bedingungen zu reduzieren oder um einen der drei Dimensionen des Magnetfeldes umzukehren. Allerdings ist der Entwurf der Spulen nicht erlauben, eine hohe magnetische Feldstärke zu erzeugen. Daher ist dieses Gerät in der vorliegenden Form nicht geeignet für Experimente entworfen, um die Wirkung der hohen magnetischen Feldstärke auf Pflanzen oder andere Organismen zu beurteilen.
Im Labor hat die Veränderung des GMF ähnlich den in diesem Verfahren beschrieben durch verschiedene Verfahren gewonnen wurde, auch Abschirmung durch Umgeben der Versuchszone durch ferromagnetische Metallplatten mit hoher magnetischer Permeabilität, die Magnetfeldern abweichen und konzentriert sie im Metall selbst. The Vorteil der Verwendung von Helmholtzspulen ist, dass das System ermöglicht Pflanzen möglichst natürlichen Zustand (Licht, Luftzirkulation, etc.) ausgesetzt werden, so dass es sich nicht nur für in-vitro-Studien (wie bei der Verwendung von Petrischalen), sondern auch zur in vivo-Pflanzenwachstum und -entwicklung Experimenten. Die Abmessungen der unser System zu schaffen einen Raum, der eine Unterdrückung bis <1 / 1.000 der natürlichen GMF ermöglicht über einen 25 x 25 x 25 cm 3 Kugelvolumen (siehe 1A), so dass mehrere Petrischalen oder eine kleine Gastgeber Töpfe für das Pflanzenwachstum.
Die hier vorgestellte Methode zur Pflanzenbiologie Studien angewandt wurden; jedoch kann das System eine Vielzahl von Experimenten, darunter Virologie und Mikrobiologie, sowie Studien über Nematoden (zB Caenorhabditis elegans), Arthropoden und kleine Tiere (einschließlich Mäusen und Ratten). Daher Tests der Hypothese, dass die Umkehrung der GMF ist in der Lagezur Induktion morphologischer und Transkriptionsänderungen können auch auf viele andere lebende Systeme erweitert werden, möglicherweise letztlich sogar auf menschliche Zellen.
Die GMF ändert sich ständig und schwankenden. Daher ist in unseren Experimenten eine große Herausforderung ist, eine konstante Vergütung des GMF, um die gewünschte neue GMF-Werte zu erhalten ist. Dies kann nur durch eine kontinuierliche Steuerung der Magnetfelder Werte durch Lesen des Magnetowerte und Spannungskompensation erreicht werden. Daher kann das System den langsam variierenden Teil des GMF zu kompensieren, aber es tut nichts zur höheren Frequenzschwankungen.
Zusammenfassend war die Verwendung von triaxialen Spulen um die GMF Vektorumkehr instrumental zu demonstrieren, dass diese Umkehrung des GMF-Vektor ist in der Lage, Pflanzen morphologische Veränderungen und differentielle Genexpression zu induzieren. Die mit dem vorgestellten Verfahren erzielten Ergebnisse bieten eine überzeugende Beweise für die Hypothese, dass die GMF WiederVersalien könnte eine der treibenden Kräfte für die Pflanzenentwicklung haben über geologische Zeitskalen 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
| DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
| Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Ethanol | Sigma | 2860 | |
| GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
| RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
| RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
| 2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Petri dish square (120 x120 mm2) | Sigma | Z692344 |
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